©2008, Promega Corporation. All rights reserved. 萤光素酶报告基因产品培训 2008.6.

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1 ©2008, Promega Corporation. All rights reserved. 萤光素酶报告基因产品培训 2008.6

2 2 各种报告基因的优点和缺点 报告基因优点缺点 萤光素酶 优越的灵敏度  高信号值  无内源活性 需要底物 ß-gal 灵敏度好 细菌，血清等内源活性高 需要底物 GUS （葡糖醛酸糖苷 酶） 灵敏度好 植物中内源活性低 90% 的 E.coli, 人／动物细胞中有内 源活性 酶的扩散可引起 “ 过度报告 ” 需要底物 SEAP （分泌性碱性 磷酸酶） 分泌性报告基因 ( 不需裂解 ) 在 HeLa, 癌 和其它细胞类型中有 高的内源活性 需要底物 CAT （氯霉素转乙酰 基酶） - 真核细胞没有背景表达 - 易于使用 - 设备现成 ( 液闪仪, 层析 ) 放射性的 灵敏度底 50 ｈ半衰期 GFP （绿色荧光蛋白） 显微镜 : 亚细胞定位 不需底物 背景可能高 折叠 “ 情形 ” 可导致信号差别

3 3 培训内容 报告基因应用举例 化学原理 载体的选择 检测试剂的种类 细胞系的应用 数据分析举例 检测板

4 4 报告基因应用举例 1 －辨别启动子 / 增强子 “ 碰撞启动子 ”: 1) 全序列 : 2) 逐步缺失 : Promoter luc+ Light Promoter luc+ Light Promoter luc+

5 5 Promega eNotes April ， 2000 Focus: Gene Reporter Assay Alpha-Melanocyte-Stimulating Hormone Induction of Luciferase Expression under the Control of Human Tyrosinase Promoter/Enhancer α- 促黑激素诱导人酪氨酸启动子 / 增强子控制下的萤光素酶表达 by Zakhartchenko.V et al. 报告基因应用举例 2 －药物对启动子活性的影响

6 6 实验中的质粒 实验载体 α-MSH inducible plasmid pGL3-Tyr14A 阳性对照 pGL3-Control 阴性对照 pGL3-Basic 内对照 pRL-SV40

7 7 细胞培养和瞬时转染 应用举例 2 小鼠黑素瘤细胞 B16-F1 保存在含 10 ％胎牛血清的 DMEM 培养基 中。 37 o C ，潮湿， 5 ％ CO 2 环境中培养。每两月从冻存管中复苏 一次。 转染前一天， 6 孔板接种，密度为 2x10 5 / 孔， 转染 pGL3-Control, pGL3-Tyr14A （ 2ug/ 孔） pGL3-Basic 载体， pRL-SV40(0.2ug/ 孔）， DNA:SuperFect™=1:5(ug:ul), 细胞与 DNA-SuperFect™ 复合物共孵育 2 小时

8 8 药物处理 应用举例 2 配制药物储存液 : 0.1mM 的 NDP-alpha-MSH,-20 o C pGL3-Tyr14a 和 pRL-SV40 共转染 B16-F1 细胞 细胞分成两组： 1. 用 DMF 处理（对照） 2. 用 10 － 7 M 的 NDP-alpha-MSH 处理 含有 NDP-alpha-MSH 或 DMF 或没有添加物的培养基每两天更 新一次。 在选定时间内（图 1 ）裂解细胞，用 DLR™ 试剂分析，一式三 份

9 9 B16-F1 细胞中萤光素酶的诱导表达 应用举例 2

10 10 双萤光素酶数据分析 第一天萤光素酶活性 (RLU) 比率 归一 对照 Ｆ Ｒ (F:R) １ 5,128 2,511 ２ 7,553 3,815 ３ 10,555 5,413 7,745 3,913 1.98 1.00 处理Ａ １ 5,1376 4,467 ２ 40,712 3,574 3 88,787 7,654 6,0292 5,23211.52 5.82 处理 B 1 587,635 5,144 2 988,347 8,832 3 409,881 3,564 661,954 5,847 113.21 57.18 第二天 萤光素酶活性 (RLU) 比率 归一 对照 Ｆ Ｒ (F:R) １ 15,529 20,433 0.76 ２ 21,897 30,841 0.71 3 10,760 13,620 0.79 16,062 21,631 0.741.00 处理Ｃ １ 850,239 20,843 ２ 578,951 14,830 ３ 943,873 21,788 791,021 19,154 41,30 55,81 处理 D 1 14,865 19,3-05 2 8,967 12,284 3 13,767 20,246 12,533 17,278 0.730.99 (F/R) 样品 Δ 活性倍数 = ; (F/R) 对照 第二天处理Ｃ计算如下： Δ 活性倍数 = (791,021/19,154)/ （ 16,062/21,631) = 55.81

11 11 培训内容 报告基因应用举例 化学原理 载体的选择 检测试剂的种类 细胞系的应用 数据分析举

12 12 萤火虫生物萤光的化学 萤光素 + ATP + O 2 萤光素酶 Oxyluciferin + AMP + PP i + CO 2 + Light 萤光素酶 : 单体, 61,000 Daltons 辅 - 底物 : ATP. Mg 2+ 萤光素 : Mg 2+

13 13 海肾萤光素酶反应 Coelenterazine + O 2 萤光素酶 Coelenteramide + CO 2 + Light 萤光素酶 : 单体, 36,000 Daltons 萤光素 : (Coelenterazine)

14 14 培训内容 报告基因应用举例 化学原理 载体的选择 检测试剂的种类 细胞系的应用 数据分析举例 FAQ

15 15 关于质粒的知识－ PGL3 ， pRL 和 pGL4 pGL3 是萤火虫萤光素酶报告基因 pGL3 有 4 个载体 –pGL3-Basic –pGL3-Control –pGL3-Enhancer –pGL3-Promoter pRL 是海肾萤光素酶载体 pRL 有 4 个载体 –pRL-null –pRL-TK –pRL-CMV –pRL-SV40

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21 21 pGL4 载体 ( 现有 37 个） 相关元件 萤火虫 luc2,luc2P,luc2CP 萤光素酶 海肾 hRluc,hRlucP,hRlucCP 启动子 SV40,TK,CMV. mini Hygro 选择标记 Neo Puro 调控序列 CRE,NFAT-RE, NF-κ-B

22 22 Upstream element –Multiple Cloning Region –Promoter/response elements Luciferase genes: –luc2 Rapid response (-P, -CP) –hRluc Rapid response (-P, -CP) Selectable markers: –Neo r –Hygro r –Puro r –none pGL4 Vectors: Major Design Features

23 23 pGL4 虫萤光素酶报告载体 pGL4.10[luc2] Vector 虫，无 P pGL4.23[luc2/minP] Vector 虫， mini P GL4.11[luc2P] VectorpGL4.24[luc2P/minP] Vector pGL4.12[luc2CP] VectorpGL4.25[luc2CP/minP] Vector pGL4.13[luc2/SV40] Vector 虫，有 P pGL4.26[luc2/minP/Hygro] Vector 虫， mini P, 瞬、稳转 pGL4.14[luc2/Hygro] Vector 虫， 无 P ， 稳转 pGL4.27[luc2P/minP/Hygro] Vector pGL4.15[luc2P/Hygro] VectorpGL4.28[luc2CP/minP/Hygro] Vector pGL4.16[luc2CP/Hygro] VectorpGL4.29[luc2P/CRE/Hygro] Vector 虫，瞬、稳转， cAMP,NFAT ， NF-κB 信号转导 pGL4.17[luc2/Neo] VectorpGL4.30[luc2P/NFAT-RE/Hygro] Vector pGL4.18[luc2P/Neo] VectorpGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro] Vector pGL4.19[luc2CP/Neo] Vector pGL4.31[luc2P/GAL4UAS/Hygro] Vector CheckMate/Flexi pGL4.20[luc2/Puro] Vector pGL4.21[luc2P/Puro] Vector pGL4.22[luc2CP/Puro] Vector

24 24 pGL4 海肾萤光素酶报告载体 pGL4.70[hRluc] Vector 海肾，无 P pGL4.71[hRlucP] Vector pGL4.72[hRlucCP] Vector pGL4.73[hRluc/SV40] Vector 海肾，有 P pGL4.74[hRluc/TK] Vector pGL4.75[hRluc/CMV] Vector pGL4.76[hRluc/Hygro] Vector 海肾，无 P, 瞬、稳转 pGL4.77[hRlucP/Hygro] Vector pGL4.78[hRlucCP/Hygro] Vector pGL4.79[hRluc/Neo] Vector pGL4.80[hRlucP/Neo] Vector pGL4.81[hRlucCP/Neo] Vector pGL4.82[hRluc/Puro] Vector pGL4.83[hRlucP/Puro] Vector pGL4.84[hRlucCP/Puro] Vector

25 25 培训内容 报告基因应用举例 化学原理 载体的选择 检测试剂的种类 细胞系的应用 数据分析举例

26 26 检测试剂 虫萤光素酶检测试剂  非均质 Luciferase Assay System,E1500.E4030  均质 Bright-Glo™, Steady-Glo®, ONE-Glo™ 海肾萤光素酶检测试剂  Renilla Luciferase Assay  Enduren  Viviren 双萤光素酶检测试剂  非均质 Dual-Luciferase® Reporter Assay System  均质 Dual-Glo™

27 27 均质检测与非均质检测 发光 细胞 + 培养基 添加试剂 细胞 + 培养基除去培养基 发光 清洗细胞裂解细胞添加试剂 均质检测 非均质检测

28 28 萤光素酶 ( 萤火虫 ) 检测系统 ( 低通量 ) E1500, E4030 试剂盒组成 : 萤光素酶底物 ( 冻干粉 ) 1 瓶 + 检测缓冲液 两种裂解液之一 : CCLR, RLB 非均质性检测 萤光水平高 需要细胞提取物

29 29 用一个萤光素酶做报告基因的实验步骤 实验举例 ( 检测启动子功能） 一、克隆及转染 1. 克隆：将待测启动子序列克隆进 pGL3-Basic 或 pGL3-Enhancer 或 pGL4 载 体中。 2. 用 pGL3-Control, pGL3-Basic 和实验载体分别转染所选细胞系。 3 ．孵育细胞。 二、检测前的准备 1 ．确定萤光发光计的线性检测范围。 2 ．制备萤光素酶试剂 ( 混合, 室温平衡 ) 。 3 ．制备 1x 细胞裂解液 （用水稀释 5 倍），于室温平衡至少 30 分钟。 三、裂解细胞 去除培养基，加裂解液，离心，取上清，存于 -70C 或立即检测。 四、检测（单管） 分装试剂，设置程序，加裂解物，读数，记录 五、分析数据

30 30 萤火虫萤光素酶检测试剂 样品 ( 细胞裂解液 ) 萤光素酶 检测试剂 发光量 1. 快速 (10 秒） 2. 灵敏 (2000 分子 ) 3. 线性 (10 8 范围 ) 4. 精确 ( 检测内变化 CV < 2%)

31 31 Bright-Glo TM 和 Steady-Glo™ 检测步骤 恒温箱萤光发光计 缓冲液 底物 培养板 裂解 2-5 分钟

32 32  均质、一步检测 – 与不同培养基相容 （含 0-10% 血清培养基 : RPMI 1640, MEM , DMEM 和 Ham’s F12 ） – 与小牛或牛血清相容 – 与酚红相容  定量 & 快速细胞裂解 （ < 5 分钟）  试剂加入后萤光强度稳定（半衰期分别是 ~20 分钟和 5 小时）  检测性能好 – 灵敏度 < 10 -19 摩尔萤光素酶 (< 5 fg) – 线性范围 > 7 个数量级 – 精确 Bright-Glo TM 和 Steady-Glo™ 检测特点

33 33 ONE-Glo™ 的优势 Reduced sulfurous odor Compatible with phenol red Optimal reaction sensitivity and kinetics More consistent data Longer operational life at room temperature Extended storage of components and reconstituted reagents More options for catalog sizes and easier customization One liter lyophilized size Inventory formulation of buffer when providing custom 20X frozen substrate liquid

34 34 Proprietary Change in Chemistry

35 35 Reconstituted reagent is MUCH more stable

36 36 What kinds of media and cells have we used? MEM  F-12 DMEM/F-12 DMEM RPMI CO 2 -independent CD 293 CD CHO 293 SFM Amniomax PBS Glo Lysis Buffer HEK293

37 37 Product format & protocol Standard “add & read” format 3 sizes: 10mL, 100mL, 1L 1L size requires 2-part reconstitution (resuspend in lyo bottle, then dilute in buffer bottle) 20X substrate is lyophilized, therefore the cake resembles the LAR cake (except C-size)

38 38 Summary 1 st completely innovative reaction chemistry for firefly luciferase since “Glo” reagents in mid ’90s Minimal sulfurous odor More robust to reaction environment than the existing chemistries Easier for customers to use Intended Promega literature: TM, 2 PNotes articles (Sept/Oct 07 & Dec 07/Jan 08), ACT poster (Oct 07)

39 39 Promega 公司萤火虫萤光素酶检测试剂的特点 ONE-GloBright-GloSteady-Glo 萤光素酶检测 方案均质非均质或均质 非均质 过程连续的 批量 小量 步骤 111 4 灵敏度最高较高较低 高 信号半衰期 >45 分钟 ~30 分钟 ~ 5 小时 ~12 分钟 细胞裂解时间 >3 分钟 ~2 分钟 ~5 分钟 不适合 制备试剂时间 <30 秒 至 40 分钟 储 底物 存 条 件 Buffer RT 4C –20°C. < 3 weeks, 2 m 4C -20°C 2 weeks 25C -20°C. 1 m 25C -20°C 混合 试剂 稳定性 RT 4C -20C 冻融 18% loss 24h 12% loss 5d 9 weeks <10 10% loss 5 h, 10% loss 24 h, <5% loss 1 m 70C. < 7 7% loss 8h, 10% loss 24 h ， 8% loss 2 weeks < 5 -20C<1m, -70C< 1 year

40 40 海肾萤光素酶 检测系统 试剂盒组成： - 底物, 液体底物 100X - 检测缓冲液, - 裂解液, 5X

41 41 海肾萤光素酶检测特点 市场上唯一的独立试剂盒, 用于检测海肾萤光素酶基 因表达。 目前所知的最灵敏的最灵敏的定量报告基因系统。 可替代萤火虫萤光素酶作报告基因，也可做辅报告基 因。 与 phRL 载体结合使用, 可能得到 10 倍于萤火虫萤光 素酶的检测灵敏度。

42 42 海肾萤光素酶检测步骤 稀释裂解液，裂解细胞 离心收集澄清裂解液，并移到另一试管。 检测  单管检测  ９６孔板检测（需带自动进样器的萤光发光计）

43 43 海肾萤光素酶检测－非裂解性检测 在活细胞内产生的萤光 – 表达动力学 ( 如, 应答滞后, 诱导, 等等.) – 可能取决于底物渗透性, 细胞内辅助因子, 和细胞内微环境 – 控制细胞生理可能很重要 细胞内海肾萤光 – 比细胞内萤火虫萤光更亮 – 不需要 ATP- 辅助因子 – 底物高度可渗透 – 底物 Km 较低 – 腔肠素在培养基中不稳定

44 ©2008, Promega Corporation. All rights reserved. ViviRen™ and EnduRen™ Live Cell Substrates

45 45 in situ Luminescence Measurements Applications of in situ Luminescence Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) Calcium signaling (Obelin, Aequorin) Intracellular reporters (Renilla, Gaussia) Whole animal imaging Applications of Live Cell Substrates Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) Intracellular reporters (Renilla) Whole animal imaging

46 46 in situ Luminescence Measurements Enablement of intracellular measurement Enable HTS measurement of Renilla luciferase (multi-well plate analysis) Live cells Volume limitations Multiplexing/Reuse Internal control Shorten protein half-life

47 47 Renilla Bioluminescence Coelenterazine + O 2 Luciferase Coelenteramide + CO 2 + Light Luciferase: Monomeric, 36,000 Daltons Luciferin: (Coelenterazine)

48 48 in situ Renilla Luminescence Measurements Protected coelenterazines More stable than coelenterazine in aqueous environments Very low autoluminescence More biologically compatible solvents (DMSO, not alcohol)

49 49 in situ Renilla Luminescence Measurements Two protected coelenterazines ViviRen™ Live Cell Substrate EnduRen™ Live Cell Substrate 半衰期 40 分钟 >24 小时

50 50 t 1/2 @ 37C ~ 11 hours t 1/2 @ 37C~ 17 minutes EnduRen TM 底物，活细胞中的非裂解性检测 羧甲基醚（ Acyloxymethyl ether ）衍生物保护腔肠素避免其快速降解 和产生自发萤光. 在哺乳动物细胞中, 保护基团被内源酯酶切下生成 胞内萤光底物. 在培养基中的被保护的底物库可以连续不断地向细胞 提供底物.

51 51 Reporter Gene Analysis Long-lived luminescence enables multiple measurements to be taken from the same sample. Isoproterenol

52 ©2008, Promega Corporation. All rights reserved. 双萤光素酶报告基因检测系统

53 53 为什么要使用双报告基因 报告基因 A ( 首要信号 ) 报告基因 B ( 第二信号 ) 特异生物学反馈 + 非特异生物学反馈 非特异生物学反馈 检测结果 比较首要与第二信号确定 特异生物学反馈

54 54 细胞可能有内源脱乙酰基酶  -Gal 或 GUS 活性. CAT,  -Gal 和 GUS 检测是终点检测. 不能同时对在一个管中组合了萤光素酶和 CAT, 或  -Gal, 的两个 报告基因的检测都灵敏而快速． 传统的双报告基因的缺点

55 55 双萤光素酶报告基因系统比用 CAT 和 ß-Gal 做内对照的优点 速度  样品不需预处理，不需孵育。两次检测在几秒种内完成 灵敏  两个萤光素酶的线性范围超过 7 个酶浓度数量级。内源萤光素酶背景极 低 方便  一管完成检测，样品不必分份

56 56 Promega 公司出品的双报告基因实验产品 质粒  萤火虫萤光素酶质粒  海肾萤光素酶质粒  叩头虫萤光素酶质粒 检测系统  非均质双报告基因检测系统（通量较低）  均质的双报告基因检测系统（适合高通量，自动化）

57 57 用萤火虫和海肾两个萤光素酶做报告基因 Dual-Luciferase® 双萤光素酶报告基因系 统（非均质检测） Dual-Glo TM 萤光素酶检测系统 （均质检测）

58 58 双萤光素酶检测试剂 组分 DLR®Dual-Glo™ 检测缓冲液 II 底物（冻干粉） Stop&Glo® 缓冲液 Stop&Glo® 底物,50X 被动裂解液,5X Dual-Glo™ 萤光素酶缓冲液 Dual-Glo™ 萤光素酶底物 ( 冻 干粉 ) Dual-Glo™ Stop & Glo 缓冲液 Dual-Glo™Stop & Glo™ 底物

59 59 Dual-Luciferase® 报告基因检测步骤 裂解细胞  被动裂解 除去培养基..PBS 洗.. 加 1XPLB, 振荡 15 分钟.. 检测  主动裂解 除去培养基..PBS 洗.. 在 1XPLB 中刮下细胞.. 细胞转移到试管或小瓶 中..1-2 次冻融.. 检测 检测

60 60 双萤光素酶检测试剂 DLR Dual-Glo

61 61 Dual-Glo™ 操作步骤 试剂制备简单  将 Dual-Glo™ 萤光素酶缓冲液倒入 Dual-Glo™ 萤 光素酶底物中  用 Dual-Glo™ Stop &Glo® 缓冲液按 1:100 稀释 Dual-Glo™ Stop &Glo® 底物  所有的缓冲液存于室温, 所有的底物存于 –20°C 两步加入试剂 : 加, 读, 加, 读

62 62 DLR®Dual-Glo™ 非均质检测均质检测 需要自动进样装置需要排枪 2 小时内检测 2 小时，完全信号 配好的试剂－ 20C ， 15 天， 6 次冻融 配好的试剂－ 70C 一 个月 >10,000 倍信号分离

63 63 双萤光素酶做报告基因检测系统 Chroma-Luc TM 载体 Chroma-Glo® 检测试剂

64 64 E.Coli 表达的 Chroma-Luc TM 基因

65 65 Chroma-Luc TM 基因和载体 三个基因 : 1. CBRluc – 发红光的萤光素酶 2. CBG99luc – 发绿光的萤光素酶 99.0% DNA 相同于 CBRluc 3. CBG68luc - 发绿光的萤光素酶 68.9% DNA 相同于 CBRluc 两种载体骨架 : 1. 对照 – 置换了 pGL3-Control 的 luc+ (pCBR-Control, pCBG68-Control, and pCBG99-Control) 2. Basic – 置换了 pGL3-Basic 的 luc+ (pCBR-Basic, pCBG68-Basic, and pCBG99-Basic)

66 66 Chroma-Luc TM 萤光素酶载体 E1411pCBR-Basic E1421pCBR-Control E1431pCBG68-Basic E1441pCBG68-Control E1451pCBG99-Basic E1461pCBG99-Control

67 67 Chroma-Glo™ 检测的化学 Luciferin + ATP + O 2 Luciferase Oxyluciferin + AMP + PP i + CO 2 + Light Luciferase: Monomeric, 61,000 Daltons Co-substrates: ATP. Mg 2+ Luciferin:

68 68 Chroma-Luc TM 萤光素酶滤光片选择 510/60nm 610nm Long pass

69 69 Chroma-Glo™ 检测的特点 为高通量检测设计，检测 96- 、 384- 孔板 均质检测 需要带滤光片的萤光发光计

70 70 培训内容 报告基因应用举例 化学原理 载体的选择 检测试剂的种类 报告基因细胞系 数据分析举例 FAQ

71 71 How Do Our Customers Use Promega Luciferase Reporter Technology? Monitor transcription, evaluate promoters and response elements Used as signal readout for defined response element in screening campaigns for drug discovery RE/Promoter Luciferase Our key drug discovery customers want integrated, ready to use (turn-key/off-the-shelf), biologically relevant luminescent assay. Promega Confidential Information. For internal Use Only!

72 ©2008, Promega Corporation. All rights reserved. GloResponse TM G- 蛋白耦联受体 萤光素酶 HEK293 细胞系 Promega Confidential Information. For internal Use Only!

73 73 GloReponse™CRE-luc2P HEK293 细胞系 特点：  人胚胎肾 293 细胞 一个克隆的衍生细胞。  细胞中含一个萤光素酶基因（ luc2p), 由一个最小单纯疱疹病毒胸苷启动 子（ HSV) 控制。  HSV 与多个 cAMP 应答因子（ CRE) 相连。 功能：  这个细胞系用于研究能调节 CREB 的细胞应答核结果。  应用举例：调节子引起 GPCR 细胞内的 cAMP 水平变化， cAMP 变化反过 来又调节 CREB 和 CRE-luc2P 的活性。 构建：  稳定转染 pGL4.15[luc2p/hygro] 于 HEK293 细胞

74 74 客户怎样使用 Promega 萤光素酶报告基因技术 ? 监控转录, 评价启动子和应答因子 在筛选药物时，作为已经确定的应答因子读出信号值 应答因子 / 启动子 萤光素酶 Promega Confidential Information. For internal Use Only!

75 75 Why G-Protein Coupled Receptors (GPCRs)? 最富含药物靶标的组之一： 排名前 200 的要务中有约 50 个 的靶标是 GPCR 大约有 400 “ 药物相关的 ” GPCRs, 150 孤儿 GPCR ~30-40% 的 HTS 是关于 GPCR 覆盖许多治疗领域 Promega Confidential Information. For internal Use Only!

76 76 PLC AC GqGq GsGs GiGi G  ATPcAMP PKA - SREAP-1 NFAT-RECRE CREB-P 应答因子 萤光素酶 Ras Raf MEK-1 MAPK Rsk-2 ELK-P PIP2 DAG IP 3 PKC fos/jun Ca+ 钙调磷酸酶 NFAT-P NFAT 核 调节子 GPCR 信号转导途径概览 GPCR 信号转导途径概览 Promega Confidential Information. For internal Use Only!

77 77 Who are likely/potential customers? Pharmaceutical Companies (smaller pharma) Academic Screening centers CROs Academic Laboratories Promega Confidential Information. For internal Use Only!

78 78 培训内容 报告基因应用举例 化学原理 载体的选择 检测试剂的种类 细胞系的应用 数据分析举例 检测板

79 79 White microplates for luminescence White, flat-bottomed 96-well plate Costar #3912 Corning #3600 Costar #3610 (tissue cultured treated white, clear bottomed plate) Nunc white polyester sealing tape Nunc Catalog # 235305 100/pkg Promega Z3291 (white microtiter plate)