流式细胞术分析 报告人：焦鑫艳 报告时间： 2014.10.20. 流式细胞术（ Flow Cytometry, 简称 FCM ）定义 流式细胞术是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中 的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，同时可以对特定群体加 以分选。 研究对象为各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或贴.

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1 流式细胞术分析 报告人：焦鑫艳 报告时间： 2014.10.20

2 流式细胞术（ Flow Cytometry, 简称 FCM ）定义 流式细胞术是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中 的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，同时可以对特定群体加 以分选。 研究对象为各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或贴 壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等。最终获得单细胞悬液（天然，机械研磨 / 消化）。 特点：检测速度快，分析样本量大；可同时分析单个细胞的多种特征；强大的分 选功能。 所用流式细胞仪（ Flow Cytometer ）是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。 有分析型流式细胞仪和分选型流式细胞仪。

3 流式细胞仪的检测范围 细胞结构 细胞大小 细胞颗粒度 细胞表面积 核浆比例 DNA 含量与细胞周期 RNA 含量 蛋白质含量 …… 细胞功能 细胞表面 / 胞浆 / 核的特异性抗原 细胞活性 细胞内 / 外的细胞因子 激素结合位点、细胞受体 蛋白磷酸化 pH 值 钙离子浓度 细胞膜电位、线粒体膜电位 ……

4 1. 上机检测 单色 / 双色 / 多色样本 参数调节 电压、阈值、设门、补偿 2. 细胞分选 3. 细胞表面和胞内标志检测 4. 细胞周期 (PI 单染 ) 5. 细胞凋亡（ Annexin V 与 PI 双染）

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6 举例： FACS Calibur 可检测 FL1-4 四个通道的 4 个颜色 检测器组 （激光器） 所需探测器 （ PMT ）位置 带通 / 长通透镜适用染料 488nm 蓝 色激光 FL1530/30FITC FL2585/42PE, PI FL3670 LP PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7 635nm 红 色激光 FL4661/16APC 搭配荧光素原则 1. 不同型号的流式细胞仪的同样的一个通道检测荧光素的能力是不一样的。 2. 每个通道只能选择 1 种荧光素。 3. 各个通道之间的荧光素可以随意搭配

7 流式抗体荧光标记搭配 将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，区别经这些特殊处理发生选择 性凋亡的淋巴细胞亚型以及活细胞的分类。 由流式细胞仪能检测多少个通道（由有多少激光以及每激光的功能决定的）、需要 同时检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记等决定。 不推荐 APC 和 PE-Cy5 一起使用，上流式以后，容易导致补偿过度。 推荐使用 Alex Fluro488 和 Alex Fluro647 。因为这些荧光非常明亮，对激光非常稳定 ，适合流式细胞仪的光谱性质，对 PH 值不敏感，具有水溶性。此外，他们联合使用时 发射光谱存在巨大差异，无需补偿。

8 数据显示 1. 直方图（ Histogram ） 2. 二维点图（ Dot Plot ） 3. 等高线图（ Contour Plot ） 4. 密度图（ Density ） 5. 三维图（ 3D Plot ）等 “ 设门 ” 就是确定阳性细胞群，去除散点部分。指在 细胞分布图中，根据该图的细胞群分布选定其中想要分 析的特定细胞群（细胞基本处于同一状态，有可比较 性）。通过 “ 设门 ” 得到不同的区域，从而对其中的细胞 进行单参数或多参数分析。 设门是流式细胞仪分析中的一种重要技术，只有 通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析。包括在 线设门和离线设门。 补偿对照（双色或多色分析中，荧光素发射光谱 重叠时）荧光补偿是指在流式细胞多色分析中，纠正荧 光素发射光谱重叠的过程，即从一个被检测的荧光信号 中去除任何其他的干扰荧光信号。 使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对 应的同型对照抗体分别进行染色。 实验样本：自发荧光＋非特异荧光＋特异荧光 同型对照：自发荧光＋非特异荧光

9 单参数直方图分析 荧光峰的高低即在纵轴对应 的高度反映了具有此种荧光 强度的细胞在样本中所占比 例的相对多少，而非绝对数 目。

10 双参数散点图分析双参数散点图分析

11 散点图 等高线图 密度图

12 FCM 的主要测定指标： FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 (FL4) FCM 标记方法 单标：一种单抗 /tube--FL1, FSC, SSC （三参数） 双标：两种单抗 /tube--FL1, FL2, FSC, SSC （四参数） 三 / 四标：三种单抗 /tube 、四种单抗 /tube--FL1-FL3/4, FSC, SSC 分析时，使用 FL2-w 和 FL2-A 显示。 FL2-A 是指荧光峰面积，反映了细胞 DNA 含量（前 提是用 Rnase 处理去除 RNA ）；, FL2-H 是指荧光峰的脉冲高度； FL2-W 是指检测荧光峰的脉 冲宽度，该值通常在做细胞周期分析时应用, 用于去除粘连细胞。 流式测细胞周期，一般分为 G0/G1,S,G2/M 期三部份，如果有凋亡，在 G0/G1 期前面有个凋 亡峰 ( 也称 sub-G0 期 ) ，而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。

13 外周全血细胞散射光双参数点图 （红细胞溶解后） 颗粒杂质、气泡 对检测的影响 FSC ：反映细胞相对大小及其表面积 SSC ：反映颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性

14 对血液中淋巴细胞设门（ R1 ）分析其免疫表型 在线设门在线设门 离线设门

15 T B 细胞分选

16 细胞表面标志物检测

17 从增殖的角度分类高等动物细胞 ①连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、 部分骨髓细胞。 ②休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称 G0 期细胞，如淋 巴细胞、肝、肾细胞等。 ③不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、 肌肉、多形核细胞等等。 不同类型细胞的 G1 长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。细胞周期的时间长 短与物种的细胞类型有关。

18 G1 期 (gap1) ； S 期 (synthesis phase) ； G2 期 (gap2) ； M 期又称 D 期 (mitosis or division)

19 依据细胞 DNA 含量（横坐标）： G1 期： DNA 复制还没开始， 也是 DNA 含量最少的，即流式 检测结果图的第一个峰； S 期： DNA 开始复制，到完 成复制，是一个一倍 DNA 到二 倍 DNA 的过程，在流式结果图 中显示期跨度特别大（第二个 不高但很宽的峰）； G2 期： DNA 复制完成至分 裂的一段时间，此时细胞内含 二倍 DNA ，在流式结果图中的 第三个峰； M 期：细胞分裂过程，此 时细胞内也是二倍 DNA ，用 DNA 含量的方法是无法与 G2 期 分开，所以有第三峰明显升高 时报告： G2/M 期阻滞。 流式细胞仪分析细胞周期

20 流式细胞仪检测细胞凋亡 1. 细胞核的改变 凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧 光染料对凋亡细胞 DNA 可染性发生改变。 研究表明，用各种染色体荧光染料对经固 定的凋亡细胞进行染色，其 DNA 可染性降 低。 许多学者把这种 DNA 可染性的降低认为是 凋亡细胞的标志之一。 DNA 可染性降低也可能是因为 DNA 含量 的降低，或者 DNA 结构的改变使其与染料 结合的能力发生改变所致。在分析结果时 应该注意。 细胞凋亡会产生特征性改变，包括细胞核、细胞器、细胞膜成分和细胞形态等的改 变，其中细胞核的改变最具特征性。

21 2. 光散射特性 凋亡细胞形态的改变影响其光散射特性。 前散射光（ FSC ）与细胞的大小有关，而 侧散射光 (SSC) 反映的是光在细胞内的折 射作用，与细胞内的颗粒多少有关。 细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小， FSC 降低；染色体降解，核破裂形成， 胞内颗粒往往增多， SSC 常增加。细胞 坏死时，细胞肿胀， FSC 增大； SSC 亦 增大，故可根据 FSC 和侧 SSC 区别凋亡 细胞和坏死细胞。但该检测受细胞形态 的均一性和核胞浆比率影响很大。 在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特 性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细 胞凋亡中，其可靠性就较差。 Forward Scatter

22 双染和单染 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（ PS ）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞 凋亡早期，细胞膜中的 PS 由脂膜内侧翻向外侧。 Annexin V 是一种分子量为 35~36kD 的 Ca 2+ 依赖性磷脂结合蛋白，与 PS 有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的 PS 与凋 亡早期细胞的胞膜结合。故 Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将 Annexin V 进行荧光素（ EGFP 、 FITC ）标记，作为荧光探针，利用流式细胞仪可检 测细胞凋亡的发生。与 FITC 的绿色荧光信号相比， EGFP 的绿色荧光信号具有信号强， 不易淬灭，稳定性高等优点。 碘化丙啶（ Propidium Iodide,PI ）是一种核酸染料，溴化乙锭的类似物，不能透 过完整的细胞膜，但能够透过凋亡中晚期细胞和死细胞的细胞膜，嵌入双链 DNA 后释 放红色荧光。故将 Annexin V 与 PI 匹配使用，可将处于不同凋亡时期的细胞区分开。 注： 1. Annexin V-EGFP ， PI 避光保存及使用。 PI 有毒，操作时要戴手套。 2. 上机前要过滤细胞！因为 PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团。流式细胞仪检测 时，细胞数量不应低于 1×10 5 ，不适用于检测组织样本。 3. 如果是贴壁细胞，胰酶消化不当会引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团 影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含 2%BSA 的 PBS 中，防止进一步的损伤。

23 操作步骤 1. 细胞培养：取对数生长期的细胞，接板，药物处理，特定时间后终止培养。 2. 细胞固定：离心，收集细胞沉淀。贴壁细胞用不含 EDTA 的胰酶消化收集，消化时间 不易过长。预冷 PBS 洗涤，加入预冷 75% 乙醇， 4 ℃固定 4h 以上。 3. 细胞染色：离心弃上清， PBS 洗涤，加入 PI 和 RNase A ， 4 ℃避光孵育 30min 。（ PI 单染） 或者 加入 500μL Binding Buffer 悬浮细胞。加入 5μL Annexin V-EGFP 混匀后，加入 5 μL Propidium Iodide ，混匀。室温、避光、反应 5 ～ 15min ；（双染） 6. 请在 1 h 内，进行流式细胞仪的观察和检测。一般计数 2~3 万个细胞，结果用细胞周期 拟和软件 ModFit 分析。 Annexin V-EGFP 的绿色荧光通过 FITC 通道（ FL1 ）检测； PI 红色荧 光通过 PI 通道（ FL2 或 FL3 ）检测，建议使用 FL3 。 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧 光补偿也不同，建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的正常细胞作为对照，将荧 光补偿调整到适合，去除光谱重叠和设定十字门的位置。若没有调节好，会导致细胞 分群不明显或者流式检测得到的结果图非常不漂亮，而且会影响到检测结果的不真实。

24 结果解读 : 纵坐标 Cell Number ：即计数的有效细胞数；横坐标 DNA Content ：即 DNA 含量； G0/G1 期细胞占总的 61.2% ， DNA 含量平均值为 45.76 。 G2/M 期占 13.07% ， DNA 含量平均 值为 91.43 。 S 期占 25.73% 。 G2/G1 为 2.0 。细胞碎片为 0.48% ，细胞聚集体有 0.06% 。总的 细胞数（仪器检测到的）为 17525 个。在细胞周期中分析的细胞数为 17431 个（即排除了 碎片及聚集体后）。峰的变异系数为 4.54% （好） ------CV 是变异系数。一般 CV 越小，峰形 越好，越尖锐。能控制在 5% 左右是比较好的结果，一般小于 10% 就可以认可了。

25 PI 标记法测细胞周期 在 FSC-SSC 物理图中圈定目标细胞群，排除多细胞团块的影响，再以 FL2A 接受 PI 荧光 信号检测细胞中 DNA 含量为例 ，将目标细胞显示群在 FL2A(area)-FL2W(width) 散点图中， 粘连的两个二倍体细胞可能与一个四倍体细胞的 FL2A 信号相同，但是 FL2W 的信号却不 同，粘连的双细胞的 FL2W 值比单细胞要大，可以在散点图中将单细胞设门显示于 FL2A 直方图中，再分析细胞周期。 FL2-W/FL2-A 设门排除双连 体细胞对 G2/M 期细胞比例的 影响

26 凋亡晚期或者坏死细胞 CD45 阴性筛选法，用 CD45 来筛选单一细胞 选出来后在检测这一群细胞的凋亡情况。 通过 CD45 阴性筛选可以去除淋巴系和其它髓系细胞。筛选后再用 ANNEXIN-V 和 PI 做双 标检测凋亡。 样品中的细胞不是单纯的细胞，就得事先标记确定要检测的细胞群。 正常细胞 凋亡早期的细胞 双染检测细胞凋亡 左上：可能是 PI 标记时间过长，或者操作过于剧烈而伤害到原本正常的细胞。也有说 法是凋亡最后阶段的细胞，细胞已经没有细胞膜了，可不结合 Annexin-V 而只结合 PI 。

27 谢 谢！