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酶免疫测试（ EIA ）技术 翁 锡 全翁 锡 全 广州体育学院
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酶免疫分析技术（ enzyme immunoassay,EIA ） 是继荧光免疫技术和放射免疫技术之后建立的一 种非放射性免疫技术，是将抗原抗体反应的高度 特异性和酶的高效催化作用相结合，发展建立的 一种非放射性标记的免疫性标记分析方法。酶免 疫分析系统则属于开放式的，符合标准的各种品 牌的 ELISA 试剂盒均可应用，且有灵敏度高、特异 性强、酶免疫试剂的性质比较稳定、操作方法简 便、快速、无放射性污染以及应用范围广等很多 优点。
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酶免疫分析技术 非均相酶免疫分析均相酶免疫分析 非均相液相酶免疫分析 非均相固相酶免疫分析 以聚苯乙烯制品作为载体的酶 联免疫吸附实验 ---ELISA 一、酶免疫测试（ EIA ）技术分类
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二、 ELISA 技术方法与原理 （ 1 ） ELISA 特点：在固相表面组装免疫活性物质 形成 " 免疫吸附剂 " ；酶标记免疫活性物质，进 行信号放大；有二步温育反应二次洗涤过程； 灵敏度特异性相对较高。 （ 2 ） ELISA 局限性：只能检测到 ng 水平，精密度 差（批内 CV15-20% ）；线性范围窄（一个数 量级）。 （ 3 ）根据检测目的和操作步骤不同有三种基本方 法：双抗体（原）夹心法 ；间接法；竞争法
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ELISA 测试原理 1 ）将链霉亲合素包被的聚苯乙烯塑料试管安置固定。 2 ）将生物素标记的特异性抗体和待测抗原加入链霉亲 合素包被小管内，经温育，生物素和亲和素发生连接， 待测抗原和特异性抗体发生结合，形成固相包被亲合素 - 生物素 - 特异性抗体 - 待测抗原复合物，然后进行洗涤， 除去未结合的抗原和生物素标记抗体。 3 ）加入辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的特异性抗体 ( 酶标 抗体 ) ，经温育形成固相包被链酶亲合素 - 生物素 - 特异性 抗体 - 待测抗原 - 酶标抗体复合物，再次进行洗涤，除去 多余的酶标抗体。 4 ）加入底物 ABTS 和 H 2 O 2 ，经温育， ABTS 在辣根过氧 化物酶的作用下显色，然后经波长 450nm 的光度计测定 获得 A 值，从标准曲线上计算出待测抗原的含量。
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三、自动化酶标仪基本工作原理 光源 光路 微孔板 触摸屏电源 单 A/D 转换 程控放大器 多路开关 光电检测 显示器 片 打印机 步进电机驱动 步进电机 送样机构 电源 机 图 2 工作原理方框图 电源
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四、 ELISA 操作步 （ 1 ）试剂的准备 （ 2 ）加样 （ 3 ）保温 使用恒温水箱 使用保温箱 （ 4 ）洗涤 （ 5 ）比色
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五、 ELISA 质量控制 （一）的测试前标本的采集和保存 （ 1 ）可作标本广泛，体液（如血清，血浆，各种积液），分 泌物（如唾液）和排泻物（如粪便，尿液）均可。 （ 2 ）标本采集时应尽量避免溶血，否则造成假阳性；长菌的 标本同样的道理易产生假阳性。 （ 3 ）抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性， 建议尽量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂。 （ 4 ）标本保存：血清置 4 ℃冰箱 5 天内完成测试；一周以上则 要 -20 ℃冰冻保存，融解时应上下颠倒充分混匀。 （ 5 ） ELISA 的灵敏度 >1ng/ml 水平上, 标本间的污染要尽量避 免，尤其不应与生化试验用同一管标本，最起码应先做免疫 后做生化 。
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（二）仪器质控 （ 1 ）移液器： ELISA 加样量小（ 5-100 ｕ l ），其准确性直 接影响实验结果，利用称重法检查，一般应在 ±10% 以内； （ 2 ）水浴箱：经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中 （或温箱内）实测温度是否一致，允许有 ±1 ℃的误差； （ 3 ）洗板机：每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规 定一般不超过 2ul ，人工扣板时，垫纸不湿，定期检查管 孔是否堵塞； （ 4 ）酶标仪：经常维护其光学部分，防止滤光片霉变， 定期检测校正，使其保持良好的工作性能。
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（三）分析中质控 （ 1 ）加样 （ 2 ）温育 （ 3 ）洗涤 （ 4 ）显色 （ 5 ）酶标仪判读结果
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六、 ELISA 操作注意事项 （ 1 ）测试之前，冰箱内试剂一定要复温（至室温），并 检查是否已经变质，同时用双蒸水稀释浓缩的洗涤液和稀 释液，若用不合格的蒸馏水则可使空白值增高。 （ 2 ）微量加液器应注意保养并定期校正，否则结果误差 较大，同时加样时不可出现气泡，以免反应物间不能充分 混匀反应。 （ 3 ）温育时要力求受热均匀，同时避免液体蒸发。 （ 4 ）洗涤时力求次数足够，且避免形成气泡，否则洗涤 不完全。 （ 5 ）比色时反应管内不能留有气泡，管底不能存有水滴， 否则出现较大误差。
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七、影响 ELLSA 测试结果常见问 题原因及解决方法 1. 选择试剂 2. 加样 3. 孵育 4. 洗板 5. 显色 6. 终止 7. 读板
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八、、 RT-2100C 型多功能酶标仪仪 器特点： 1 、 RT-2100C 可广泛应用于传染病、肿瘤标志物、血液病、 艾滋病、内分泌障碍测定等临床论断领域。 2 、大屏幕汉化界面，利用触摸屏和笔作为输入方式，极大 地方便了用户的操作输入。 3 、 100 个可编程的检验项目。 4 、多种定量、定性计算方法 5 、 96 孔可视化布板，空白位、对照位、样本位、标准品位 任意设置，同一板上可同时进行最多 12 个项目的测试。 6 、 8 通道检测迅速准确 (<5 秒 / 板 ) ，测试前的震动混匀功能。
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7 、大容量历史数据保存，最多可保存 500 个项目， 1000 个 病人， 10000 条样本记录。 8 、形式多样的综合中文报告输出，支持多种品牌系列的外 置打印机。 9 、强大的网络功能：可与医院内部计算机网络、质量监测 中心及雷杜用户服务中心联网，为工作带来极大的便捷。 10 、配合使用雷杜酶标实验室管理系统，可以在联网计算 机上进行数据管理和分析。 11 、辅助管理功能：内置科室数据库、医生数据库和系统 日志数据库。
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九、 RT-2100C 型多功能酶标仪常用 测试项目 （ 1 ） 肝炎类：甲肝抗体 IgM 、乙肝两对半、丙、丁、戊、庚性肝炎 抗体等 （ 2 ）传染病类：爱滋病、衣原体、肺炎支原体、腺病毒、幽门螺旋杆 菌、腮腺炎、麻疹、水痘、百日咳杆菌、流行性出血热、狂犬病等。 （ 3 ）肿瘤标志物类：卵巢癌、乳腺癌、胃肠道癌、癌胚抗原、甲胎蛋 白、膀胱癌、铁蛋白等。 （ 4 ）内分泌类： T 3 、 T 4 、促卵泡生成素 (FSH) 、黄体生成素 (LH) 、泌 乳素 (PRL) 、人绒毛促性腺激素 (HCG) 、睾酮 (TESTO) 、孕酮 (PROG) 、雌二醇 (E 2 ) 、雌三醇 (E 3 ) 、生长素 (HGH) 、促甲状腺素 (TSH) 、皮质醇或皮质酮 (C) 、促红细胞生成素 (EPO) 等。 （ 5 ）自身抗体类： ENA 全套 6 项筛选、抗核抗体、抗 Sm 抗体、抗精子 抗体、抗双链 / 单链 DNA 、红斑狼疮筛选等。 （ 6 ） Torch 类、病毒感染类：弓形虫、巨细胞病毒、风疹病毒、单纯 疱疹病毒等。 （ 7 ）细胞因子类：白细胞介素、可溶性 CD 抗原。
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十、 RT-2100C 型酶标仪基本操 作步骤 （ 1 ）开机，待机器自行检测稳定 （ 2 ）项目设置： RT-2100C 所有项目均由用户 自行定义，最多允许设置 100 个项目。用户已 经设置的项目均在窗口中列表显示，关机时自 动保存。 （ 3 ）样品测试 （ 4 ）综合报告
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实验操作项目： 血清睾酮的定量测定
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