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男性不育的实验室诊断及评估 南京医科大学生殖医学重点实验室 周作民
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维持男性生育的基本条件： （ 1 ）睾丸内产生足够数量的精子。 （ 2 ）精子在男性生殖管道内获得运动能力和 受精能力，既精子的成熟。 （ 3 ）输精管道通畅。 （ 4 ）具有正常的性功能。 （ 5 ）附属性腺功能正常。
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不育症诊断的步骤： 1. 病史采集 : 包括年龄、职业、生育史、疾 病史、家族史等。 2. 体格检查：包括外生殖器和全身体检。 3. 实验室诊断 4. 特殊检查
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一、 精液常规分析 ┌ 精子（ 5% ） 精液组成 ┤ ┌ 精囊腺液（ 60% ）－凝固因子、果糖 └ 精浆（ 95% ） ├ 前列腺液（ 20% ）－液化因子 ├ 尿道球腺液（ 3% ） └ 睾丸液、附睾液 —— 精子
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精液分段成分： 前段－睾丸液，附睾液（精子），尿 道球腺液 中段－前列腺液 后段－精囊腺液
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精液变量的参考值： 精液量： 2 ～ 6ml 颜色：灰白 液化时间： <60 分 粘稠度：拉丝 <2cm pH ： 7.2 ～ 8.0 活率： >60% 活力： A+B>50% 或 A>25% 精子计数： >2000 万 /ml 畸形率： <30% 脓细胞： < 5 个 /HP （ <1×10 6 /ml)
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精子活力分级 A 级：快速前向运动 B 级：慢或呆滞的前向运动 C 级：非前向运动 D 级：不动
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影响精液常规数据准确性的因素： ① 自身的波动性 : 要求首次检查应连续进行两次, 间隔时间 7 天 —3 周，两次结果差异大时应再检一次。
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每周测定一次精子密度，连续 120 周，期间此人未服 药，也无发热，结果显示精子密度可有显著性波动 。
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② 禁欲时间： 要求 2 －７天 ③ 采精方式： 要求用手淫法或取精器取精。 ④ 盛精容器： 要求用对精子无毒性的玻璃或塑料容器。 ⑤ 室温： 要求不低于 20 度 ⑥ 观察时间： 要求精液液化后，取精后 1 小时内检测。 ⑦ 检测设备： 冬天检测应注意保温。
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精液常规异常的分析 ： 1. 精液量异常 1) 无精液症：精液量 <0.5ml 或无 病因：①性交不射精 ②逆行射精 2) 少精液症：精液量为 0.5 ～ 2ml 病因：①性交频率过高 ②附属性腺先天性发育不良 ③附属性腺感染 ④雄激素水平下降 ⑤年龄因素 3) 多精液症：精液量 >6ml 病因：①附属性腺感染 ②附属性腺功能亢进
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2. 精液液化及粘稠度异常 ① 精液不凝固或凝固不全：精液稀薄，流动性大。 病因：精囊腺炎症 ② 精液不液化或液化不全：液化时间 >30 分 病因：前列腺功能障碍
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3. 精液 pH 异常 ： 测量方法： pH 试纸 (pH 范围 6.1-10.0 或 6.4-8.0) ① pH 过低： pH<7.2 原因：①输精管和精囊腺的缺如 ②附睾病变 ② pH 过高： 原因：①精囊腺液分泌过多 ②前列腺液分泌过少
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4. 精子记数异常： 正常 ≥20×10 6 个 /ml 测定方法：①血球计数板 ②一次性精子计数板 ③ Makler 精子计数板 ④ CASA 仪 1) 少精子症： <20×10 6 个 /ml 严重少精子症： <5×10 6 个 /ml 2) 无精子症：精液须经离心，沉淀物中仍未见精子者，并须 连续检查三次尚可确诊。 3) 多精子症： >250×10 6 个 /ml
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5. 精子畸形： 观察方法：①吉姆萨染色法或瑞士染色法 ②巴氏染色法 ③布赖恩－利什曼染色 ④肖尔染色法 畸形分类：①头部畸形：大头，小头，锥形头，梨形头， 无定形头，空泡样头，双头等。 ②颈和中段畸形：缺尾，弯曲尾，肿胀，过薄等。 ③尾部畸形：短尾，多尾，断尾，卷尾，双尾等 ④胞质残余体：常位于精子颈部
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６．白细胞检查： ① 正甲苯胺蓝过氧化酶染色法： 结果：白细胞染成棕红色 ② 联苯胺法：染料：联苯胺＋玫瑰红 结果：白细胞－褐色；其它细胞－品红色。
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二．精子运动特性的检测和分析 1. 显微镜观察： 注意事项： (1) 取精液 10 ul ，滴于玻片，盖上 22×22 盖玻片，静置 1 分钟后观察。 (2) 控制温度，最好在 37 ℃进行 (3) 每次观察 4 ～ 6 个视野，计算 100 个细胞，计算 A 级、 B 级、 C 级和 D 级精子的百分比，连续观察两张滴片， 误差不得 >10% 。
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2. 多点曝光技术：在 1 秒钟内对精子连续曝光 6 次，可判 断精子的运动速度及运动轨迹。 精子运动速度分布： 快速： ≥ 25 微米 / 秒 中速： 10—25 微米 / 秒 慢速： <10 微米 / 秒
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3. 计算机辅助的精子分析系统（ CASA ） 原理：用高分辨率摄像机实时记录精子及精子运动图象， 用分析软件对图象进行处理和分析，并得出结果。 硬件：显微镜，摄像机，微机 软件：图象分析系统
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参数及意义： 1) 运动精子密度：①活动率 ②前向运动率 2) 活力参数：①平均路径速度 ②曲线速度 ③直线速度
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不足之处： ① 价格高 ② 误判多：特别是脱落细胞多时 ③ 不能识别畸形精子、脓细胞 ④ 对待检标本的精子密度有一定要求：精子数量少时， 计数偏高，精子数量高时，活率偏高。
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４．宫颈粘液穿透试验： 1) 体内试验：性交后试验（ PCT ） 注意事项：①排卵期进行 ②禁欲至少 2 天 ③最好在性交后 9 ～ 24 小时进行观察。 诊断标准：正常为宫颈粘液中的活动精子数 >50 个 /HP 或 A 级精子 >20 个／ HP
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影响因素：①女方的内分泌状况。 ②宫颈粘液中的白细胞。 ③阴道 pH ， 8.5 可导致 PCT 异常。 ④宫颈结构异常。 ⑤抗精子抗体影响。 ⑥性功能异常, 如阴道痉挛。 ⑦精子质量差。
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2) 体外试验： ① 玻片试验 ② 精子－宫颈粘液接触试验 ③ 毛细管试验 : 穿透介质 : 人宫颈粘液 ; 宫颈粘液代用品 : 牛宫颈粘液 ; 含人血清精子营养液 ; 含牛血清白蛋白精子营养液 ; 鲜鸡蛋清 ;
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５．精子顶体酶测定（明胶膜法）： 1) 制备 5% 明胶溶液，吸取 100ul 均匀涂于载玻片上，自 然干燥， 4 ℃湿盒备用，使用前用甲醛－酒精固定液固定 60 分钟。 2) 精子处理：取液化精液，用 PBS 稀释至 2 ～ 4×10 6 个 /ml 。 3) 涂片：取 1 滴精液涂于明胶膜上， 37 ℃湿盒 2 小时。 4) 观察：于相差显微镜下计数有反应精子的百分率及精 子的平均反应直径。 5) 正常值：平均反应率 ≥65% ，平均反应直径 ≥25μm 。
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6 ．去透明带仓鼠卵穿透试验 1) 精子准备： ① 精液充分液化 ② 调整精子浓度至 10×10 6 个 /ml ③ 精子获能：取精液 0.5ml ， 5%CO 2 ， 95% 空气中， 37 ℃孵育 18 ～ 24 小时，调整精子浓度至 4×10 6 /ml 。
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2) 卵细胞准备： ① 取动情第一天仓鼠，腹腔内注射 PMSG 30 ～ 40U ， 48 ～ 72 小时后再次注射 HCG 30 ～ 40U ， 18 小时后输卵管内取卵。 ② 1% 透明质酸去除卵丘细胞， 0.1% 胰蛋白酶去除透明带。 3) 体外受精： 将 0.1ml 精液加至液体石蜡下，再加入 20 ～ 30 个仓鼠卵， 培养 3 小时。 4) 结果观察： 相差镜下见卵丘细胞内膨大的精子头为受精卵，计算 受精率，正常为 ≥10% 。
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三．精液生化指标检测 1. 酸性磷酸酶测定（ ACP ） 原理： P －硝基酚磷酸二钠 ACP →P －硝基酚 测定产生的 P －硝基酚含量，推测 ACP 的活性 正常值： ≥200U ／一次射精 意义：反映前列腺功能
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2. 果糖测定：间苯二酚法 原理：果糖＋间苯二酚 加热 → 红色化合物 测定化合物含量 正常值： 0.87 ～ 3.95g/L 意义：反映精囊腺功能与精子供能有关 3. α －糖苷酶测定 原理：麦芽糖 α －糖苷酶 → 葡萄糖 测定葡萄糖含量 正常值： 35.1 ～ 87.7U/ml 意义：反映附睾功能
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四．抗精子抗体测定 1. 常用方法： 1) 凝集试验： 原理：大分子或多价抗体如 IgM 或分泌型 IgA 可以在精子 间形成交链，产生精子凝集，观察。 ① 试管－玻片凝集试验（ FramRlin-Dukes ）： 将待检样本与液化的精液混合后，于３７℃孵育１小 时，显微镜下观察，出现３条以上精子头－头、尾－尾或 头－尾连接即为凝集，观察１０个视野，５个以上出现凝 集即为阳性。 ② 圆盘凝集试验（ Friberg ） ③ 凝胶凝集试验（ Kibrick ） 缺点：假阳性高
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2) 精子制动试验（ Isojima ）： 原理：在补体参与下，精子表面的抗精子抗体可抑制 精子的运动能力。 缺点：敏感性差， IgA 的作用常测不出，吸附于精子 头部的 AsAb 作用也常常测不出。
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3) 直接免疫荧光试验： 原理：用荧光素标记抗人免疫球蛋白抗体与精子混合后， 如精子表面有抗体，则标记的二抗吸附于精子表面，出现 荧光。 优缺点：方法敏感，假阴性少，且可确定吸附部位，但假 阳性多。 4) 免疫珠试验： 原理：将聚丙烯珠与兔抗人免疫球蛋白相连，如精子表面 有抗精子抗体，则免疫珠与精子表面吸附，光镜下即可观 察到，计数吸附在免疫珠上的活动精子数，计算百分比， 且可确定吸附部位。 优缺点：结果可靠，且可进行抗体分类和定位，但价格较 贵。
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5 ）混合抗球蛋白抗体试验（ MAR 试验）： 原理：将精液与包被了 IgG 或 IgA 的乳胶颗粒或红 细胞混合，在加入二抗，颗粒与活动精子间形成 混合凝集预示精子表面存在 IgG 或 IgA.
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6) 酶联免疫吸附试验（ ELISA ）： 原理：将精子抗原吸附于酶标板上，加入待检样本，如有 AsAb 则吸附于精子抗原上，加入酶标二抗，与 AsAb 结合， 最后加入底物，产生颜色反应。 优缺点：可大规模使用，但有假阳性和假阴性，必须设定 阳、阴性对照。
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五．激素测定 六．遗传检测 （一）染色体检查 １．染色体的非整倍体 １）性染色体的非整倍体 精子发生需要性染色体的平衡，即一个 X 和一个 Y ， X 或 Y 的数目异常均可导致精子发生异常。
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( 1) 47,XXY 男性（ Klinefelter’s syndrome ），发生率 1 ： 500 ，睾丸发育不 良，精子发生障碍； 46,XY/47,XXY 亦经常发生，伴有无精子或少精子。 (2) 48,XXXY ， 49,XXXXY 表型为女性，阴茎发育不良，隐睾。 (3) 46,XX 男性：由于 Y 染色体的短臂（ Yp11 ）异位到 X 染色体的短臂上 （ Xp22 ）。内生殖器表现型取决于 Yp11 的断裂部位， Yp11 远端（ SRY 附 近）的断裂常导致隐睾、小阴茎、尿道下裂。 (4) 45,X 男性，较少见，为 Y 长臂缺失，短臂异位至常染色体上（ 13,15,22 常见）。 (5) 47,XYY 发生率 1 ： 750 ，活检显示曲精小管受损，生精阻滞于精母细 胞阶段，有时有精子生成。少数人能生育，但胚胎易死亡，或后代有异 常染色体， 45 － 75% 精母细胞带有二个 Y 。 (6) Y － A 平衡异位： Y 长臂远端的异染区（ Yq12 ）转移至端着丝粒常染 色体的长臂上， Y 长臂断裂在 Yq11 上，断裂部位对精子发生的影响较大， 距 Yq11 较近时，精子发生基因受损，致精子发生障碍。断裂距 Yq11 较远 时，精子发生可正常并能生育，但带有 Y － A 异位的很易再断裂而引起不 育，或将异位传给子代，使子代发生断裂而导致精子生成障碍。
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2) 常染色体的非整倍体 在不育男子中，常染色体结构异常的发生率是有生育能力 男子的 10 倍。 (1) 男性 Turner 氏综合征（ Noonan 综合症）： 为常染色体显性或隐性遗传病，染色体核型常为 46, XY ， 或 XO/XY 嵌合体。 临床表现：身体矮小，颈蹼，典型的脸部特征，心脏缺陷， 隐睾，无精子或少精子症，血睾酮下降， FSH 和 LH 升高。 (2)21 三体（ Down 综合症）：可生育或不育，多余的一条 21 可影响联会复合体的形成，也可影响性染色体上性泡（ Sex vesicle ）的形成。 (3) １、 3 、 9 、 10 染色体长臂的部分三体或单体可引起性翻转， 性腺退化，生精障碍。 (4) 罗伯逊异位：无精子症患者可见，但常引起严重少精子症。
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体细胞和生精细胞内的染色体异常可能不一致。已发现 1 号染色体的非整倍体和 XY 精子的发生率是体细胞的 10 倍， 如用 XY 精子行 ICSI 则可产生 47,XXY 的后代。已有报道， ICSI 的胚胎性染色体非整倍体的发生率高于自然生殖。因 此对行 ICSI 的患者，最好进行精子的染色体分析或植入前 胚胎的遗传分析。
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（二）精子发生基因（ Azoospermia factor, AZF ）检测 1. AZF 存在部位： Yq11.23 2. AZF 的重要候选成分： YRRM1, DYS240, DAZ 3. AZF 与精子发生的关系： 精子发生障碍患者中（无精子或精子计数小于 500 万 ／ ml ）约有１０％有 AZF 缺失
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4. AZF 的检测方法： (1) 染色体原位杂交法 (2) Southern Blot 方法 (3) PCR 方法：具有迅速、灵敏、操作简便和成本低等特 点，便于临床推广应用，多重 PCR 可同时检测几 AZF 成分。 (4) 单链构象多态性分析（ Single Strand Conformation analysis, SSCP ）检测 AZF 的点突变。 (5) 核苷酸序列测定 (6) 基因芯片技术
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5. AZF 检测的意义： (1) 从基因水平揭示精子发生的机制。 (2) 无精子症和严重少精子症患者的病因诊断。 (3) ICSI 的病例选择。 (4) 为基因缺陷男子和男性避孕的分子疫苗研究打下基础。
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