分子技术在肿瘤靶向药物 治疗的应用 中南大学病理学系 湘雅医院病理科 周建华. 肿瘤靶向治疗 （ Target therapy of cancer ） 依据已知肿瘤发生的异常分子和基因， 设计和研发针对这些特定的分子和靶点 药物，选择性杀伤肿瘤细胞的治疗方法； 靶向治疗的前提就是明确肿瘤的特异靶 基因变异类存在与否和变异类型；

Presentation on theme: "分子技术在肿瘤靶向药物 治疗的应用 中南大学病理学系 湘雅医院病理科 周建华. 肿瘤靶向治疗 （ Target therapy of cancer ） 依据已知肿瘤发生的异常分子和基因， 设计和研发针对这些特定的分子和靶点 药物，选择性杀伤肿瘤细胞的治疗方法； 靶向治疗的前提就是明确肿瘤的特异靶 基因变异类存在与否和变异类型；"— Presentation transcript:

1 分子技术在肿瘤靶向药物 治疗的应用 中南大学病理学系 湘雅医院病理科 周建华

2 肿瘤靶向治疗 （ Target therapy of cancer ） 依据已知肿瘤发生的异常分子和基因， 设计和研发针对这些特定的分子和靶点 药物，选择性杀伤肿瘤细胞的治疗方法； 靶向治疗的前提就是明确肿瘤的特异靶 基因变异类存在与否和变异类型； 个体化治疗的雏形。

3 荧光原位杂交（ Fluorescence in situ hybridization ， FISH ）技术

4 简介 FISH = Fluorescence In Situ Hybridization 利用荧光标记的 DNA 探针检测组织或细胞 内与其互补的 DNA 片段 应用：遗传病诊断 血液肿瘤 实体瘤 样本：羊水、绒毛、流产组织、外周血、 骨髓、体液及各种肿瘤组织等

5 用已知的标记单链核酸为探 针，按照碱基互补的原则， 与待检材料中未知的单链核 酸进行异性结合，形成可被 检测的杂交双链核酸。由于 DNA 分子在染色体上是沿着 染色体纵轴呈线性排列，因 而可以探针直接与染色体进 行杂交从而将特定的基因在 染色体上定位 荧光标 记探针 探针变性 样本 DNA 变性 工作原理

6 FISH 检测染色体易位（ Translocation ）在 淋巴瘤分型中的应用 FISH 技术在淋巴造血系 统肿瘤中的应用

7 检测技术特点 不同类型的淋巴瘤染色体易位类型不同 优点 适用于形态学上难以诊断且 IHC 结果不理想的标本； 适用于细胞数量少，形态不典型的活检及穿刺组织。 必须结合组织形态学和免疫组化结果作最后 诊断！！！

8 FISH 基因检测在淋巴瘤的应用 淋巴瘤 FISH 检测基因临床应用 套细胞淋巴瘤 IGH/CCND1 融合基因辅助诊断 滤泡性淋巴瘤 BCL2/IGH 融合基因辅助诊断、判断预后 弥漫性大 B 细胞淋 巴瘤 BCL6 基因断裂重组辅助诊断、判断预后 伯基特淋巴瘤 C-MYC 基因断裂重组辅助诊断 粘膜相关淋巴组织 淋巴瘤 MALTI 基因断裂辅助诊断 胃粘膜相关淋巴组 织淋巴瘤 API2-MALTI 融合基因指导治疗

9 弥漫大 B 细胞淋巴瘤（ DLBCL ） 按免疫组化亚型分为 CD5 阳性 DLBCL 生发中心 B 细胞样变型 (GCB) 、 非生发中心 B 细胞样变型 (non-GCB) 3 类 可根据 CD10 、 BCL6 、 MUM1 的表达区分生发中 心 B 细胞样变型、非生发中心 B 细胞样变型。 >30% 瘤细胞表达 CD10 或 CD10(-) 、 BCL-6(+) 、 MUM-1(-) 诊断为 GCB; 其他病例则为 non-GCB 。

10 ◆ BCL6 基因断裂 --- 辅助诊断弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 ◆ BCL6 基因断裂重排 ---- 判断预后 目前研究确定至少 40% 的 DLBCL 涉及 BCL6 基因重排。 一项针对 102 名 DLBCL 患者的 BCL6 重排情况及其与预后关系 的研究显示， BCL6 阳性患者诊断治疗 36 个月后，疾病停止发 展的比率为 82% ，携带有 BCL6 重排的病例预后较好。 BCL6 基因断裂与弥漫性大 B 细胞淋巴瘤

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12 Offit, K. N Engl J Med, 1994. 331(2): p. 74-80. 结果判读

13 IGH/CCND1 融合基因可见于 95% 的套细 胞淋巴瘤，是套细胞淋巴瘤与其他淋巴瘤 鉴别的重要指标。  IGH/CCND1 融合基因 -- 辅助诊断套细胞淋巴瘤。 IGH/CCND1 融合基因与套细胞淋巴瘤

14  正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。  异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两 个融合信号。

15 API2/MALT1 基因检测试剂盒 探针： GLP API2/GLP MALT1 凋亡抑制因子 2 基因（ apoptosis inhibitor-2,API2 ）, 位于 11 号染色体 ; 粘膜相关淋巴组织基因（ Mucosa-associated lymphoid tissue 1,MALT1 ）， 位于 18 号染色体。 API2 基因与 MALT1 基因的融合导致凋亡抑制的增加， 引起细胞不依赖于抗原刺激的生存优势。

16  API2/MALT1 融合基因的检测可以指导抗 HP 治疗 胃 MALT 淋巴瘤与幽门螺旋杆菌（ HP ）感染导 致的慢性胃炎有关， MALT1/API2 融合基因阴性的 患者抗 HP 治疗有效，阳性患者抗 HP 治疗无效。 API2/MALT1 融合基因检测意义

17  正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。  异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两 个融合信号。

18 BCL2/IGH 重排发生在约 80%-85% 的 FL 患者中，检 测 BCL2/IGH 基因重排可以辅助诊断 FL 。 BCL2/IGH 阴性的 FL 患者 3 年生存率为 100% ，而 阳性者只有 54% ； 阴性者 3 年疾病无进展为 87.5% ， 而阳性者只有 13% 。 BCL2/IGH 融合基因与滤泡性淋巴瘤 BCL2/IGH 融合基因 ----- 辅助诊断滤泡性淋巴瘤 BCL2/IGH 融合基因 ----- 判断预后

19  正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。  异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两 个融合信号。

20 结果判读 - 阳性结果

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22 约 80% 的伯基特淋巴瘤病例发生 t(8 ； 14) （ q24;q32 ）； 约 15% 的伯基特淋巴瘤病例发生 t(2 ； 8)(p11;q24) ； 约 5% 发生 t(8 ； 22) （ q24;q11 ）。 染色体易位导致 C-MYC 基因断裂重组可能是伯基特淋 巴瘤的一个标志，可以应用于临床上伯基特淋巴瘤的辅 助诊断。 C-MYC 基因断裂与伯基特淋巴瘤  辅助诊断伯基特淋巴瘤

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24 结果判读 - 阳性结果

25 FISH 技术在乳腺癌靶向治疗应用

26 乳腺癌 Her- 2 基因 致癌基因： Her-2 基因； 位点： 17q11.2-q12 ； 编码蛋白：跨膜蛋白（与 表皮生长因子受体部分同源）； 25-30% 乳腺癌病人都有 HER-2 的扩 增； HER-2 基因扩增是决定 Herceptin 治 疗是否有效的关键性指标。 HER2 扩增的乳腺癌更具有侵袭性生 长能力。

27 乳腺癌 Her- 2 基因及蛋白检测 Cerb-B-2 :3+ 完全强膜阳性细胞 >30% 2+,1 +,- FISH 检测是否有基因扩增

28 Her2 基因 检测流程 石蜡组织标本 IHC 检测 再用 FISH 方法检测 — 1+3+2+ —+ Herceptin 治疗 + 再用 FISH 方法检测 Herceptin 治疗 FISH 检测 + — 再用 FISH 方法检测 +

29 A. 无须计数的大簇团信 号（高度扩增） B. 颗粒状信号（ R>10 ，高度扩增） C. 须计数的颗粒状信 号（ R=3.5 ，低度扩增） A C B Her-2 基因扩增状况

30 >30% 的肿瘤细 胞全部的细胞膜 高强度着色 免疫组化（ 3+ ）与 FISH 对比 ×40 ×100 浸润性导管癌Ⅱ级 IHC ： +++ FISH ：呈簇团状高度扩增 ×100

31 免疫组化（－）与 FISH 扩增阳性 浸润性导管癌Ⅱ级 IHC ：－ FISH ：呈簇状扩增 肿瘤细胞不着色 ×40 ×100

32 基因突变检测方法

33 1.RNA 酶 A 切割 (RnaseAcleavage) 2. 变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 3. 杂合双链分析法 (HA) 4. 化学切割错配 (CCM) 5. 碳化二亚胺检测 (Carbodiimide,CDI) 6. 酶促切割错配 (Enzyme Mismatch Cleavage, EMC) 7. 单链构象多态性 (Single-Strand Conformation) 8. 切割片段长度多态性 9.DNA 测序 (Sequencing) 10. 双脱氧指纹图谱法 (Dideoxy Finger-printing, ddF) 11. 错配接合蛋白检测 12. 蛋白截短测试（ protein truncation test ） 方法

34 13. 变性的高效液相色谱检测 (Denaturing High Performance Liguld Chromatography DHPLC) 14.DNA 芯片技术 (DNAchip) 15. 等位基因特异性扩增 16. 等位基因特异性寡核苷酸片段分析 (Allele- Specific Oligonucleotide,ASO) 17. 引物延伸检测 (Primer Extension,PEX) 18. 寡核苷酸连接检测 (Oligonucleotide Ligation Assay,OLA) 19. 限制性片段分析 (Restriction Fragment Analysis ） 20. 突变体富集 PCR 法（ mutant-enriched PCR ） 21. 蝎形探针扩增阻滞突变系统（ Scorpions amplification refractory mutation system ）

35 肺癌组织 EGFR 基因扩增和 突变检测及其临床意义

36 研究背景 研究显示吉非替尼对部分晚期 NSCLC 患者的治疗 效果非常显著。 存在 EGFR 基因突变的患者更有可能对吉非替尼的 治疗敏感。 存在 EGFR 基因扩增的肺癌、肠癌病人对分子靶点 药物更为敏感。 检测大肠癌有无 EGFR 过度表达，只要 >1% 的癌 细胞的胞膜强阳性染色即判断为 3+ ，可作为应用 西妥昔单抗的指征。

37 FISH 检测 EGFR 基因扩增 标本类型：石蜡包埋组织（手术、活检、穿刺） 冰冻组织 胸、腹水沉渣细胞 探针类型： GLP EGFR / CSP7 定量 PCR 检测 EGFR 基因突变分型 突变类型： 19 exon （ 2235-2249 位点） 15bp 缺失突变 19 exon （ 2240-2257 位点） 18bp 缺失突变 19 exon （ 2240-2251 位点） 12bp 缺失突变 21 exon 2573 位点 T>G 碱基置换突变 21 exon 2582 位点 T>G 碱基置换突变 EGFR 基因变异检测

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39 双体性 三体性 多体性扩 增扩 增 肺癌石蜡肺癌石蜡

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41 FQ-PCR 分型技术检测 EGFR 突变

42 存在 EGFR 突变肺癌样本的琼脂糖凝胶电泳图 71 例肺癌组织中检测出 6 例突变样本

43 FQ-PCR 检测 15bp 缺失阳性病例结果 红色阈值线以上的扩增曲线即为 阳性标本的扩增曲线，按荧光信 号值的高低依次为 9 号、 12 号、 13 号、 55 号、 38 号和 33 号标本

44 15bp 缺失突变型 DNA 的测序图 sense antisense

45 红色阈值线以上的扩增曲线即 为阳性标本的扩增曲线，按荧 光信号值的高低依次为 2 号、 36 号、和 40 号标本 FQ-PCR 检测 18bp 缺失阳性病例结果

46 目前 K-RAS 突变检测常用技术

47 方法 直接测序 焦磷酸测序 高分辨率熔解曲线 PCR-RFLP 芯片 杂交 Real-Time PCR

48 肿瘤组织的确认和筛选 显微切割肿瘤 提取 DNA 相应的 PCR 反应或杂交 相关的分析和检测 K-ras 突变检测基本流程图

49 直接测序 (Direct Sequencing) PCR 扩增后产物直接测序 双脱氧核苷酸链终止法 (Sanger 法 ) DNA 片段是荧光标记的，这些片 段经过平板胶电泳或毛细管电泳 得到分离，荧光分子被激发而发 光，发出的光信号被检测系统检 测

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51 K-ras 突变检测结果

52 疗效预测标志物与预后判断标志物 疗效预测标志物： 能够预测某种特定治疗方式疗效的标记物 KRAS 基因突变导致肿瘤对 EGFR 抑制剂抵抗 预后判断标志物： 在不考虑治疗因素的情况下能够判断患者结局的标 记物 18 号染色体长臂（ 18q ）缺失 某些分子标志物兼具两种作用 胸腺嘧啶合成酶（ Thymidylate synthase ）

53 EGFR 作为预后因子的价值 EGFR expression correlates with poor prognosis DFS = Disease-free survival; OS = overall survival Tumor typePrognosisSurvival Risk of metastasi s References Colorectal Poor - Decreased OS Increased - Hemming (1992) Mayer, De Jong (1992) Head & Neck (SCCHN) Poor Decreased DFS Decreased OS ---- Grandis (1998) Maurizi (1996) Lung (NSCLC) Poor Decreased OS - - Increa sed Ohsaki (2000) Pavelic (1993)

54 Cetuxamab( 西妥昔单抗 ) 人源化嵌合单抗（ IgG1 ） 靶向作用于表皮生长因子受体（ EGFR ） 阻断 EGF 和 TGFα 与 EGFR 的结合，抑制酪氨酸激酶活性和其后 的肿瘤生长 200 ４年获得 FDA 审批资格治疗结直肠癌 Panitumumab （帕尼单抗） 完全人源化单克隆抗体 (IgG2) 靶向作用于表皮生长因子受体（ EGFR ） 2005 年 7 月获得 FDA 快速通道审批资格治疗结直肠癌 结直肠癌分子靶向治疗药物

55 KRAS 突变 KRAS 突变可不依赖 EGFR 受体途径，自行激活 RAS/MAPK 通路 导致 ERBITUX 耐药 KRAS 突变与 Erbitux 疗效及患者生存相关 KRAS 突变并非孤立事件 KRAS 突变常伴随 BRAF 突变，并与 CpG 岛甲基化表型 (CIMP) 1,2 相关 KRAS 突变常伴随 PI3K 突变 3 Lièvre A, et al. J Clin Oncol 2008;26:374–379 MAPK = mitogen-activated protein kinase

56 K -ras 基因野生型患者能从这类药物治疗中获益。 K-ras 基因突变型患者并不能从抗 EGFR 治疗中获益, 反 而徒增不良反应危险和治疗费用； 抗 EGFR 治疗和 K-ras 突变相互排斥 K-ras 基因抗 EGFR 治疗关系密切

57 2009 年 7 月 FDA 批准了对西妥昔单抗和帕尼 单抗说明书标签的修改： 结直肠癌分子靶向治疗药物 注明 KRAS 基因突变的结直肠癌患者不推荐这 使用这两种用药物。

58 K-ras 基因突变 : 20-60% 结直肠癌 K-ras 基因突变发生在肿瘤恶变的早期，原 发灶和转移灶的 K-ras 基因高度保持一致 K-ras 基因突变

59  NCCN 临床实践指南指南明确指出所有转移性结直肠癌患者 都应检测 K-ras 基因状态。  美国美国临床肿瘤学会 (ASCO) 推荐把 K-ras 基因突变检测作为 结直肠癌患者接受 EGFR 单抗治疗的预测指标。  欧盟药品审评管理局规定： cetuximab 及 panitumumab 用于 mCRC 的治疗前，患者必须确定为 K-ras 野生型。 K-ras 与结直肠癌治疗

60 结直肠癌（ CRC ）缺乏 EGFR 基因 突变 对爱必妥单药治疗转移性结直肠癌 （ mCRC ）临床试验中 110 例活检标本 进行的研究未发现 EGFR 基因突变（外 显子 18 － 21 ） Khambata-Ford S, et al. J Clin Oncol 2007;25:3230–3237

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62 抗 EGFR 治疗前检测 KRAS 基因突变 的理由 1. 避免不必要的不良反应 2. 控制不必要的费用 3. 确认能够从治疗中获益的野生型患者 4. 避免治疗对突变型患者的潜在毒性 CHMP gave a positive opinion for ERBITUX May 29, 2008 — but for patients with wild-type KRAS tumors

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64 810 名胃癌病人有 HER2 基因的扩增，约占参与实验总人 数的 22% ； 晚期胃癌接受标准化疗联合 Herceptin 治疗的患者：平均 生存期由 11.1 个月延长到 13.8 个月； 高倍扩增者甚至可达 16 个月； 将死亡风险降低 26% 。 HER2 与胃癌分子靶向治疗

65 美国临床肿瘤学会 ASCO 提出：  Herceptin 可成为 HER2 阳性晚期胃癌患者的 治疗选择。  晚期胃癌患者在确诊时都应接受 HER2 检测；

66 HER 基因与胃癌预 后 HER2 基因扩增的晚期胃癌患者往往预后不 佳。 无 HER2 基因扩增的晚期胃癌患者中位生存期 12.6 个月，而有基因扩增者中位生存期仅 5.5 个 月。 存在 HER2 基因扩增的胃癌患者术后 5 年生存率 为 21.4% ，而无扩增的则为 63.0% 。