第七章 花药和花粉培养. 【学习目的要求】 1. 掌握花药培养和花粉培养的区别 2. 了解花药最佳接种时期 3. 掌握花药培养的大致过程 4. 掌握花粉培养的大致过程 5. 掌握雄核发育的四种途径.

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1 第七章 花药和花粉培养

2 【学习目的要求】 1. 掌握花药培养和花粉培养的区别 2. 了解花药最佳接种时期 3. 掌握花药培养的大致过程 4. 掌握花粉培养的大致过程 5. 掌握雄核发育的四种途径

3 第一节 概述 一．花粉培养和花药培养的概念：都指离体培 养花药和花粉，使小孢子改变原有的配子 体发育途径，转向孢子体发育途径，形成 花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植 株，并从中鉴定出单倍体植株并使之二倍 化的技术。

4 二. 花粉培养和花药培养的区别  花药培养其外植体是植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法 和技术来讲，属于器官培养的范畴。  花粉培养的精确定义是：将处于一定发育阶段的花粉从花药中 分离出来，再加以离体培养。有时花粉培养也称为小孢子培养 (microspore culture) 。从培养方法和技术方面来讲，它属于细 胞培养的范畴。

5 三．单倍体植物的特点  所谓单倍体 (haploid) 是指具有配子体染色体数的孢子体 ( 植物个体 ) 。 diploid 植物其 haploid 即为 monoploid 玉米 2n = 2x = 20 n = x = 10 水稻 2n = 2x = 24 n = x = 12 柑橘 2n = 2x = 18 n = x = 9 tetraploid 植物其 haploid 为 dihaploid 马铃薯 2n = 4x = 48 n = 2x = 24 陆地棉 2n = 4x = 52 n = 2x = 26 hexaploid 植物其 haploid 为 triploid 普通小麦 2n = 6x = 42 n = 3x = 21 octoploid 植物其 haploid 为 tetraploid 草莓 2n = 8x = 56 n = 4x = 28 单倍体植物与它们的二倍体相比 较，有三个明显的特点： 1. 体细胞染色体数减半； 2. 生长发育弱，体形小、各器官 明显减小； 3. 雌雄配子严重败育，有的甚至 不能进入有性世代。

6 四. 单倍体的应用潜力 1. 迅速获得纯合型材料，缩短育种年限； 2. 获得育种中间材料； 3. 突变体选育； 4. 体细胞融合； 5. 作为遗传工程受体更为有效 6. 是研究减数分裂，花粉生长机制的生理、生化、遗 传等基础理论的最好方法。

7 第二节 花药与花粉培养技术 一. 花药培养  花药培养是指改变花粉的发育程序，使其分裂形 成细胞团，进而分化成胚状体，产生再生植株， 或形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株。  目前已有 250 多种植物花药培养成功。花药培养 获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作 物、十字花科作物的育种中广泛应用。

8 花药培养的基本程序： 外植体选择 —— 外植体 ( 花蕾 ) 预处理 —— 外植体消毒 —— 剥取花药 —— 接种 —— 诱导 培养 —— 分化培养 —— 移栽

9 1. 花药的材料选择  基因型、生理状态及小孢子发育时期等对花药和花 粉培养效果具有极大的影响，因而是材料选择所要 考虑的主要因素。 (1) 基因型 供体植株遗传背景对花药和花粉培养成败至关重 要。在进行花药和花粉培养时，应选择那些容易培 养成功的材料来做。

10 品种接种花药数产生胚状体数诱导率（ % ） 元帅 赤阳 国光 金冠 978 1410 1073 1302 21 10 7 2.1 0.7 0.6 0.5 不同苹果品种的花药培养胚状体的诱导率

11 (2) 生理状态的选择  花药和花粉供体植株的生理状态，对花粉愈 伤组织的诱导率也有直接的影响。不同季节 接种的花药愈伤组织诱导率也有显著变化。 如小麦早期接种的材料比晚期接种的材料愈 伤组织诱导率可提高 2—3 倍。

12 (3) 花粉发育时期的选择  一般情况下，对大多数植物来说，在单核时 期的花粉比较容易培养成功。确定花粉发育 时期的方法可用涂片法来进行。  PMC→ 四分孢子 → 小孢子单核期 → 小孢子双 核期 → 小孢子三核期（成熟花粉）

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16 表皮 药室内壁 中层 绒毡层 花丝 花粉粒 药隔维管束 百合幼嫩花药结构图

17 百合成熟花药结构图 药隔 花丝 唇细胞 花粉粒 中层 药室内壁 表皮

18  一般选择单核期 细胞核较大居中，称单核中央期。随着细胞体 积迅速增大，细胞核由中央位置推向一边，即单核靠边期。以上 均为单核期花粉。  单核期的确定 根据细胞观察推测，双核期的花粉中开始积累 淀粉，不能使花粉发育成植株。通常采用醋酸洋红或碘化钾染 色，再压片镜检，以确定花粉的发育时期。但是接种前不可能把 所有的花粉都进行一次发育时期的镜检，通常是按照花蕾长度 大小与花粉发育年龄的相关性，在实际操作中取一定大小的花 蕾进行的。如马铃薯在花冠露出萼片一半时大多数花粉处于单核 晚期。

19 烟草小孢子发育时期对胚状体诱导率的影响 小孢子发育时期培养花药数胚状体（ % ） 单核早期 单核中期 单核晚期 双核早 双核晚 15 77 21 63 30 0 7.8 19.4 1.59 0

20 适宜小孢子发育时期代表植物 减数分裂期 四分孢子期 单核早期 单核晚期 单核早期至晚期 单核早期至双核期 四分孢子期至双核期 番茄、草莓 葡萄 油菜、苹果、石刁柏 小麦、茄子、青椒、荔枝、楸子 烟草、柑橘、橡胶、龙眼、杨树 水稻、甘蓝、梨 玉米 一些植物花药和花粉培养适宜的小孢子发育时期

21 二. 预处理  花药和花粉的预处理措施主要是低温处理。在很多情况 下，低温处理可明显提高花药和花粉培养的效果。  一般耐寒植物比喜温植物可耐受较低的温度，处理的温 度可低些。低温处理时间视使用的温度而定，较低的温 度处理时间要短，较高的温度处理时间宜长。

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23 低温处理的作用： 1. 可以激发花粉母细胞产生两个相等核； 2. 保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞 组织的衰老； 3. 激发花粉产生原胚； 4. 促进细胞同步分裂

24  一般情况下，花药和花粉培养所取材料是未开放的花 蕾，其内部的花药和花粉实际上处于无菌状态，表面 灭菌在能杀灭花蕾表面微生物的前提下，处理的强度 以尽可能轻为好。  采集未开的花蕾 → 置于 70% 酒精中浸数秒 → 再置于 0.1% 升汞浸 3 － 5 分钟 → 剖开花蕾，取出花药（去掉花 丝） → 接种在诱愈培养基上（每瓶 3 － 5 个花药）。 三. 外植体制备及接种

25 花药和花粉培养的方法主要有液体培养、双层培养、分步 培养、看护培养、微室培养等。 所选用的培养基中，花药培养常用的基本培养基： MS （ Murashigc & Skoog ， 1962 ）； Nitsch(Nitsch ， 1969) ； N6( 朱至清， 1974) ； B5(Gamborg et al. ， 1976) 。 四. 培养方法及培养基的选择

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29 花药和花粉培养的主要目的是制备单倍体植株， 但其再生植株并不都是单倍体。因此，必须多获 得的花药和花粉植株进行倍性鉴定。由于单倍体 植株只有配子染色体组成，生活力很弱，难以长 期存活，因此，对鉴定的单倍体植株应尽早进行 染色体加倍处理。 五. 单倍体植株的鉴定和染色体加倍

30  鉴定花药和花粉植株染色体倍性的方法有：形态鉴定、结 实性鉴定、染色体数目鉴定和遗传标记鉴定。  花药和花粉有自然加倍的可能，但是发生的频率很低，因 此，一般需对鉴定出的花药和花粉单倍体植株进行人工加 倍。常用的方法是利用 0.02%—0.4% 的秋水仙素处理花药 和花粉单倍体植株，处理方式和部位随植物种类而异。

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33 正常加倍小孢子植株的花序

34 部分加倍的小孢子植株花序

35 未加倍小孢子植株的花序

36 不同加倍情况的花朵形态 1 2 3 4 5 1 — 对照 2 — 正常加倍化 3 、 4 — 部分加倍花 5 — 未加倍按花

37 二. 花粉培养 花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植 体进行离体培养的技术。由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组 织或胚状体发育成的植株都是单倍体植株，且不受花药的药隔、药 壁、花丝等体细胞的干扰。但缺点是较比花粉培养难度大。 1 、取材时期的确定 花粉和小孢子培养的取材适宜期大多为花粉发育处于四分体到单 核早期的材料。

38 2. 花粉的分离 (1) 挤压法：未开的花蕾 → 用流水冲洗 10min → 用 75% 酒精浸 10 － 15min → 无菌水冲洗 2 次 → 用 10 漂白粉溶液浸 20min → 用无菌水冲洗 3 次 → 将花药 放在盛有液体培养基的小烧杯中 → 用镊子挤压花药， 散发出花粉粒 → 过滤，滤液低速离心 → 滤液再过滤 一次（每 ml 含 1000 － 10000 个花粉粒即可）。

39 (2) 漂浮法（自然散落法） 将花药接种于液体培养基中，培养一定天数 后，花药开裂，释放出花粉粒，收集，离心清洗， 重悬。 (3) 机械分离法

40 3. 培养方法 (1) 直接培养 从未经任何预培养或预处理的新鲜花药中 分离花粉粒，直接接种到合成培养基中进行培 养的方法。

41 (2) 预培养 将花药在液体培养基中先漂浮培养 2-4d ， 然后挤出花粉，经离心洗涤纯化后悬浮于液体 培养基中进行培养，密度为 10 4 -10 5 个 /ml 。

42 (3) 看护培养

43 (4) 条件培养 在人工合成的培养基中加入失活的花药提 取物，然后接入花粉进行培养。由于失活的花 药提取物中含有促进花粉发育的物质，有利于 花粉培养成功。添加花药提取物的浓度因植物 种类而异。

44 (5) 微室培养 将花粉粒接种在由盖玻片或载玻片制作的 一个微室环境中进行培养。 (6) 双层培养 先在培养皿中铺上固体培养基，凝固后在 其上接种花粉悬浮液。

45 油菜游离小孢子培养分化成胚的过程

46 油菜游离小孢子分化形成的胚状体

47 油菜小孢子培养形成的子叶型胚状体

48 小孢子子叶型胚状体再生成植株

49 第三节 雄核发育 一. 雄核 发育的 途径

50 1. 营养细胞发育途径 单核花粉粒经一次分裂，产生一个营养细胞 和一个生殖细胞。生殖细胞分裂 1 － 2 次就退化 了，由营养细胞分裂增生形成愈伤组织或胚状 体，进而分化为再生植株。 2. 生殖细胞发育途径

51 3. 营养细胞与生殖细胞共同发育途径 营养细胞与生殖细胞各自脱分化、分裂增生形 成愈伤组织或胚状体的一部分。 4. 花粉粒均等分裂发育途径 花粉粒均等分裂形成两个同样的细胞，各自脱 分化，分裂增生形成愈伤组织或胚状体的一部分。

52 二. 影响雄核发育的因素 1. 植物的基因型 2. 植物的生理状态 3. 花粉发育时期 4. 预处理：冷处理 / 热处理 / 化学处理 / 其它方法 5. 培养基成分：无机盐 / 碳源 / 激素 / 有及附加物 6. 活性炭 7. 花药壁因子 8. 温度和光照

53 【本章小结】 1. 花药培养是器官培养，花粉培养属细胞培养，但二者培养目 的是一样， 都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。 2. 花药培养一般选择花粉的单核期进行接种，因为这一时期尚没有淀粉的 积累。 3. 花药培养包括选择材料 — 消毒 — 接种培养 — 愈合组织生成 — 分化出单倍 体植株。 4. 花粉的发育途径包括营养细胞发育、生殖细胞发育、营养和生殖细胞同 时发育及花粉均等分裂发育途径。 5. 花粉培养包括花粉的分离 — 預处理 — 培养过程。

54 【思考题】 1. 花药培养和花粉培养有何区别？ 2. 花药培养时选择什么发育时期的花药？为什么？ 3. 花药培养时培养基配制有什么特点？ 4. 花粉培养时怎样使用微室培养和看护培养？