DNA 损伤与修复 第六章 DNA 损伤与修复 DNA damage and repair DNA damage and repair 分子生物学研究中心.

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2 DNA 损伤与修复 第六章 DNA 损伤与修复 DNA damage and repair DNA damage and repair 分子生物学研究中心

3 第一节 DNA 损伤的原因及后果 电离辐射 可见光可见光 氧自 由基 H+H+ 烷化剂 8-oxoG P/ P 复制错误 核苷类似物 mCmC U

4 DNA 损伤类型 碱基脱落 碱基修饰 & 去氨基化 化学修饰 光损伤 链内交联 DNA- 蛋白质 交联 DNA 链断裂 DNA 重组

5 缺失碱基位点

6 化学损伤 甲基化 氧化损伤

7 DNA 受到大剂量紫外线照射时，形成二聚体 紫外线可引起 DNA 的交联, DNA 与蛋白质的交联。

8 电离辐射引起 DNA 损伤的机理

9 电离辐射引起 DNA 损伤的机 制 自由基损害 损伤 DNA 修复系统 MCI 假说

10 电离辐射引起 DNA 损伤的类型 产生 · OH 自由基，导致碱基变化 脱氧核糖分解 DNA 链断裂 DNA 链、蛋白质的交联

11 电离辐射导致 电离辐射导致 DNA 链的断裂 单链断裂： 单链断裂： 无差错修复 无差错修复 双链断裂： 双链断裂： 错误修复 错误修复 C

12 烷化剂引起 DNA 损伤 碱基烷基化 : G – C → A – T 碱基脱落 : 甲基磺酸甲酯可使鸟嘌呤 7 N 烷基化，活化 β — 糖苷键，连接碱基 与五碳糖间的共价键变弱，容易折断缺 失碱基，造成脱嘌呤作用。 导致 DNA 断链 : 磷酸二酯键上的氧被烷基化 导致 DNA 链交联

13 5-BrdU （酮式 -A ； 烯醇式 -G ） 碱基类似物、修饰剂对 DNA 的改 变 亚硝酸盐氧化脱氨 （ C→U ） 羟胺脱甲基 （ T→C ） 黄曲霉素 B （攻击碱基）

14 DNA 自发性损 伤 碱基错配 Mismatch 互变异构移位 脱氨基作用 ( 环外氨基 ) 碱基丢失 → 自发水解 碱基修饰与链断裂

15 碱基异构式引起 DNA 复制的错 配 错误配对 G(k) T(e)A(a) C(i) A(i) C(a) G(e) T(k) G(k) C(a) 正确配对 A(a) T(k)

16 环出效应

17 其它因素引起 DNA 损 伤 吖啶类化合物 : 吖啶橙 扁平染料分子 ( 不等交换 ) 氧自由基 ( 加成反应 \ 小自由基反应 )

18 DNA 损伤的后果 信号传导异常 长时辰效应 老化肿瘤疾病 DNA 修复机制 短期效应 异常增生和代谢生理功能紊乱 细胞死亡 细胞增殖减少基因表达异常基因组不稳定

19 DNA 损伤后分子的最终改变 点突变 ： 转换与颠换 缺失 插入 倒位或转位 DNA 断裂

20 DNA 重排 DNA 分子内发生较大片段的交换，可以 在同一染色体的两条链间发生，也可在不 同染色体之间发生，可以是原来的方向或 颠倒的方向。

21 第二节 DNA 修复 DNA 的修复主要类型 : 直接修复 光裂合酶修复 切除修复 重组修复 跨损伤修复 (SOS 修复 )

22 常见的 DNA 损伤及其修复机 制 DNA 损伤因素 DNA 损伤类型修复机制 X 射线、氧自由基 、烷化剂 自发脱碱基 单链断裂、无碱基位点、氧化性 碱基（如 8- 氧鸟嘌呤）脲嘧啶 碱基切除修 复 紫外线和多环芳烃环丁烷嘧啶二聚体等大的紫外线 光产物和稳定的多环芳烃化合物 等大分子 DNA 加合物 核苷酸切除 修复 抗癌药（如顺铂和 丝裂霉素） 双链断裂和链间交联双链断裂修 复（同源重 组修复和末 端连接） 复制错误和烷化剂碱基错配和缺失（插入）错配修复

23 （ 1 ） DNA 断裂口直接修复： 在 DNA 5'-P 端和 3'-OH 端未受损害的 情况下，连接酶能够直接修复 DNA 的 断裂口。

24 （ 2 ） DNA 紫外线损伤的光复合酶直接修复

25 （ 3 ） 烷基化碱基的直接修复 在 大肠杆菌中的 Ada 酶，可修复甲基化的 碱基和甲基化的磷酸二酯键。

26 ⑷ 碱基切除修复 指切除和替换由内源性化学物作用产生 的 DNA 碱基损伤, 是切除修复的一种。 受损碱基移除是由多个酶来完成的。 主要针对 DNA 单链断裂和小的碱基改变 及氧化性损伤。

27 (4) Base Excision Repair

28 DNA 的损伤的切除修复 碱基缺陷或错配 碱基丢失结构缺陷 切开 核酸内切酶 核酸外切酶切除 DNA 聚合酶 DNA 连接 酶 AP 核酸内切酶 核酸外切酶 切开 切除 修复 连接 糖苷酶 插入酶 碱基取 代

29 ⑸ 核苷酸切除修复 体内识别 DNA 损伤最多的修复通路 主要修复扭曲双螺旋结构的 DNA 损伤 以及阻断基因转录和不识别任何特殊的碱 基损失，而是识别双螺旋形状的改变。 不识别任何特殊的碱基损失，而是 识别双螺旋形状的改变；修复时切 除含有损伤碱基的那一段 DNA 。

30 (5) 核苷酸切除修复 ( 大肠杆菌 )

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33 核苷酸切除修复 ( 基因组修复 – 人 )

34 核苷酸切除修复 ( 转录偶联修复 - 人类 )

35 GGR 和 TCR 的共同修复通路

36 错配修复 校正活性所漏校的碱基, 使复制的保真性提 高 10 2 ～ 10 3 倍 错配修复 系统 (MRS Mismatch Repair System) DNApol (ξ= 10 -8 ) 经第二次校正 ξ= 10 -11

37 ♪ 错配修复系统组成（ Mismatch repair system ） DNA 腺嘌呤甲基化酶 (m6A 甲基化酶 ) DNA polymerase Ⅲ 填补单链 DNA 缺口 Helicase SSB 外切核酸酶 ( Ⅰ和Ⅶ ) 连接酶 MCE (mismatch correct enzyme) 3 subunits mut H, L, S 扫描新生链中错配碱基 识别新生链中非 m 6 A 的 GATC 序列 酶切含错配碱基的 DNA 区段

38 错配修复

39 大肠杆菌 DNA 甲基化位点 新合成的 DNA Mis-paired bases

40 错配修复

41 重组修复机制

42 重组修复重组修复 ☆ DNA 于复制时会越过受损区域进行复制 ☆ 经重组修复，受损的 DNA 仍然存在于子代的 一个细胞中。 ☆ 重组修复不会浪费时间， 重组修复可让负伤 的 DNA 在细胞中仍可照常进行分裂。

43 非同源末端连接： DNA 分子之间不需要广泛的同 源性，主要是在免疫球蛋白重组时对 DNA 双链进 行连接，在细胞有丝分裂 G 1 /G 0 期起主要作用。 重组修复 根据 DNA 末端连接需要的同源性，分为 同源重组：需要多种蛋白参与；也修复 DNA 复制中的差错；在减数分裂、细胞有丝分裂后 期 S/G2 期起主要作用。

44 (7) SOS 修复 Irradiation of bacteria before virus infection enhanced repair of damaged viral genes but led to mutations. UV UV ’ d T4 phage E. coli Few surviving phage UV ’ d T4 phage E. coli Higher frequency of surviving phage, but many mutants.

45 SOS 修复诱导 DNA 聚合酶活性 LexA ( 一种 DNA 结合抑 制蛋白 ), umuC 和 umuD, 编码 DNA 聚合酶活性, 允 许复制跨过 损伤位点, 常插入一个或几个 A 碱 基. AGCTAGTCAT/TCAGTC TCGATCANNNNGTCAG Replication stops at T/T dimer Error-prone polymerase allows replication to proceed, albeit inaccurately SOS response :

46 RecA-P 的三种功能 a 、 DNA 重组活性 b 、 与 S.S. DNA 结合活性 c 、 少数蛋白的 proteinase 活性 当 DNA 正常复制时 （无复制受阻，无 DNA 损伤， 无 TT dimer ） RecA-p 不表现 proteinase 活性

47 当 DNA 复制受阻 / DNA damaged 细胞内原少量表达的 RecA-p 与 S.S, DNA 结合 激活 RecA-p 的 proteinase 活性 修复损伤 LexA-p 降解 RecA-p 高效表达 SOS open 当 DNA 复制度过难关后 RecA-p 很快消失 LexA gene onSOS off

48 SOS 修复 DNA 复制不很严格，新合成的 DNA 容易造成错误产生突变。

49 线粒体损伤和修复 线粒体的氧化损伤 : 单链断裂、双链断裂、碱基修饰、 DNA 交联、 烷化损伤 线粒体的损伤修复： 碱基切除修复、错配修复

50 DNA 修复 维持 DNA 序列的保真性； 可在复制前后进行； 有多种修复机制来纠正 DNA 损伤； DNA 修复失败可能导致突变和肿瘤。

51 细胞周期检查点控制 真核生物细胞 DNA 受到损伤时细胞除了诱导 修复基因的转录外，还可暂时阻断细胞周期， 防止受损 DNA 继续复制，如无法修复，则可诱 导细胞进入凋亡。这些都是细胞通过细胞周期 检查点控制（ checkpoint control ，又称关卡控 制）对 DNA 损伤的应答反应。 真核生物细胞 DNA 受到损伤时细胞除了诱导 修复基因的转录外，还可暂时阻断细胞周期， 防止受损 DNA 继续复制，如无法修复，则可诱 导细胞进入凋亡。这些都是细胞通过细胞周期 检查点控制（ checkpoint control ，又称关卡控 制）对 DNA 损伤的应答反应。

52 酵母细胞的细胞周期检查点控制机制 DNA 损伤在 S 期 DNA 损伤在 G 1 和 G 2 期 G1G1 SG2G2 M POL2 RFC5 DPB11 RAD9 RAD17 RAD24 MEC3 MEC1,TEL1 RAD53

53 哺乳类动物的细胞周期检查点控制机制 DNA 损伤 P21 Gadd 45 Bax P53 CDK/cyclin Gadd45 Gadd45-PCNA Blocking cell cycleExcision repairingCell apoptosis

54 第三节 DNA 损伤和修复的生物参考标志

55 一、甲基化损伤修复相关基因 甲基转移酶（ MGMT ）把 O 6 - 甲基 鸟嘌呤的甲基转移到自身的半胱氨酸残基 上，修复甲基化的 DNA 。 MGMT 突变可 作为甲基化损伤的基因型标记物。

56 二、切除修复相关的酶和基因 尿嘧啶糖基化酶为主要的始动因素， 可 作 为 DNA 损伤的生物标记物。 大肠杆菌 Uvr 基因家族、人 ecrr 基因和切除 修复基因等

57 三、错配修复相关基因 MSH2 、 MLH1 等蛋白参与 错配修复，而错 配修复的缺陷往往是癌变的第一步。 错配修复基因： Muthls 系统、人类的 hmsh2/3 、 hpmsl1/2 、 Mutsa 、 msh6 。 错配修复基因的微卫星序列的不稳定性 （ microsatellite instability ， MI ）

58 四、 DNA 聚合酶 β DNA 聚合酶 β 参与辐射损伤和化学损 伤的 修复，并对细胞的生长具有调节作 用。 DNA 聚合酶 β 的突变可导致碱基切除修 复功能的缺陷 。

59 五、 DNA 加合物也可作为修复功能的生物标记 物 DNA 加合物可作为 DNA 损伤的暴露 标记物和效应标记物，其去除的速度也可 作为 DNA 修复功能的生物标记物。

60 DNA 损伤和修复的生物学意义 避免基因组的不稳定性、癌症和细胞 死亡是至关重要的。 DNA 修复途径可以识别和修复特异的 DNA 损伤，保证生物物种的遗传稳定 性。

61 与 DNA 修复有关的人类遗传疾病： 着色性干皮病 (Xeroderma pigmentosum) 布伦氏症候群 (Bloom ’ s syndrome) 遗传性大肠癌 (Hereditary nonpolyposis colon cancer ； HNPCC)

62 着色性干皮病 (Xeroderma pigmentosum) 是一种隐性遗传性疾病，有些呈性联遗传。因核 酸内切酶异常造成 DNA 修复障碍所致。临床以光 暴露部位色素增加和角化及癌变为特征。 1. 幼年发病，常有家族发病史。 2. 面部等暴露部位出现红斑、褐色斑点及斑片， 伴毛细血 管扩张，间有色素脱失斑和萎缩或疤痕。 皮肤干燥。数年内发生基底细胞癌、鳞癌及恶性 黑素瘤。 3. 皮肤和眼对日光敏感。 4. 病情随年龄逐渐加重，多数患者于 20 岁前因恶 性肿瘤而死亡。 5. 组织病理 晚期出现表皮非典型性增生、日光角 化及鳞癌和基底细胞癌等恶性肿瘤。

63 着色性干皮病患儿脸部特征

64 着色性干皮病背部, 着色性干皮病组织切片

65 着色性干皮 病的并发症

66 着色性干皮病的治疗 避免紫外线照射 避免肿瘤致病因子 对症治疗

67 遗传性大肠癌的临床特征 发病早 (~45 岁 ) 肿瘤好发部位 肠外肿瘤的类型

68 遗传性大肠癌 (HNPCC) 息肉较少 30-60% 有内膜肿瘤 恶性肿瘤好发部位 胰腺癌发生率

69 大肠癌发生的危险因素 (CRC) 020406080100 General population Personal history of colorectal neoplasia Inflammatory bowel disease HNPCC mutation FAP 5% 15%–20% 15%–40% 70%–80% >95% Lifetime risk (%)

70 错配基因的改变 多发性家族性结肠癌

71 错配基因的改变 : MSH2, MSH6, PMS1 ， MLH1, MSH3, PMS2.

72 HNPCC 中错配基因突变的概率 MSH2 ~30% MLH1~30% PMS1 (rare) PMS2 (rare) MSH6 (rare) Unknown ~30% SporadicFamilial HNPCC FAP Rare CRC syndromes Liu B et al. Nat Med 2:169, 1996

73 HNPCC 发生的危险因素 基因携带者 发生的危险因素 : – 早期 : 20-25 岁 – 妇女 : 年龄 (?) 25-35 岁 HNPCC 家族成员之一发生的概率 : – 胃癌发生 : 早期发生年龄 3-35 岁, 复发 1-2 年 – 尿道肿瘤发生 : 30-35 岁, 复发 1-2 年 NCCN practice guidelines in oncology – v.1.2003

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75 你该怎么做 ?