血清 ALT 活性的测定 生物化学与分子生物学教研室. 【实验目的】 1 ．掌握血清 ALT 活性测定的基本原理。 2 ．了解血清 ALT 的测定方法 ( 赖氏法 ) 及临床意义。

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1 血清 ALT 活性的测定 生物化学与分子生物学教研室

2 【实验目的】 1 ．掌握血清 ALT 活性测定的基本原理。 2 ．了解血清 ALT 的测定方法 ( 赖氏法 ) 及临床意义。

3 【实验原理】 丙氨酸氨基转移酶 (ALT) ，又称谷丙转氨酶 (GPT) ， 在 37 ℃、 pH7.4 的条件 下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与 α- 酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：

4 生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的 2,4 二硝基苯肼发生加成反应，生 成丙酮酸 -2,4- 二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合 物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与 ALT 活性的高 低成正比关系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过 标准曲线查出血清中 ALT 的活性。

5 一是金氏法（ King 法）、穆氏法（ Mohun 法）和赖氏法（ Reit man-Frankel 法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完 全相同。不同之处在于作用时间： King 法 60min ， Mohun 法 和 Reiman 法 30min 。因此它们的单位定义和标准曲线制备也 不同。赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套 用速率法的卡门氏单位作表示的。 ALT 活性测定主要有两类方法：

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7 二是卡门氏（ Karman ）法，其原理如下： 由于 NADH 在波长 340nm 处有特异吸收峰，因此 ALT 的活性 可通过 NADH 的减少量，亦即通过 340nm 吸光度的减少量间 接作出定量测定。这一方法特异性、准确性高。 1 个卡门氏单位的定义是：在温度 25 ℃， pH7.4 ，波长 340nm ，光径 1cm 的条件下， 1ml 血清使 NADH 的吸光度下降 0.001 的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质的量浓度，而是 用物质的吸光度表示酶的活性单位的。 【方法评价 】 丙酮酸 +NADH+H + 乳酸 +NAD + LDH

8 【试剂】 1 ． 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液 (pH7.4) ：将 420mlNa 2 HPO 4 溶液和 80ml0.1mo1/LNaH 2 PO 4 溶液混匀，置冰箱保存。 2 ．基质溶液 (DL- 丙氨酸 200mmol/L ， α— 酮戊二酸 2mmo1/L) ：精确称取 DL- 丙氨酸 1.7 9g 和 α— 酮戊二 29.2mg ，溶于 50ml0.1mo1/L 磷酸盐缓冲液中，用 1mol/LNaOH 溶液 （约 0.5ml ）调至 pH 至 7.4 ，再加磷酸缓冲液至 100ml, 最后加入麝香草酚（每 L 可加 0.9g ） 防腐，置冰箱中保存，可用一个月。 3 ． 2.4— 二硝基苯肼溶液 (1mmol/L) ：称取 2.4— 二硝基苯肼 19.8mg, 溶 100ml/L 盐酸中， 置室温保存。 4 ． 0.4mol/L 氢氧化钠溶液： NaOH16g 溶于蒸馏水中调至 1000ml 。 5 ．丙酮酸标准液 (2mol/L) ：丙酮酸钠 22.0mg ，置于 100ml 容量瓶中，加 0.05mol/L 硫 酸至刻度。 6. 0.1mol/LNa 2 HPO 4 溶液：称取 Na 2 HPO 4 ·2H 2 O17.6g 溶于少量蒸馏水中，待溶解后加 蒸馏水至 1000ml ，至冰箱中保存。 7. 0.1mol/LKH 2 PO 4 溶液：称取 KH 2 PO 4 13.6g 溶于少量蒸馏水中，待溶解后加蒸馏水至 1000ml ，至冰箱中保存。 【器材】 恒温水浴锅， 723 型分光光度计，刻度吸量管，滴管，试管等。 【试剂与器材】

9 【步骤】 加入物 (ml) 管号 01234 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液 0.10 2mmol/L 丙酮酸标准液 00.050.100.150.20 基质溶液 0.500.450.400.350.30 相当于酶活力单位 0285797150 （ 2 ）分别向各管加入 2 ， 4 二硝基苯肼液 0.5ml, 混匀后置 37 ℃ 水浴箱， 20 分钟后取出， 分别向各管加入 0.4mol/LNaOH 溶液 5.0ml 。 （ 3 ）混匀，放置 10 分钟在 505nm 波长比色，以蒸馏水调零点，读取各管光密度。各 管光密度值分别减去 0 号光密度，以所得差值与相应的卡门氏酶活力单位作图即得标准 曲线。 （ 4 ）当血清标本的酶活力单位超过 150 时，应将血清用生理盐水稀释 5 倍或 10 倍后再 进行测定。 （ 5 ）加入 2 ， 4 二硝基苯肼溶液后，应充分混匀，使反应完全。 （ 6 ）绘制标准曲线：第 1-4 管的光密度值值分别减去 0 管光密度值值，所得差值为纵坐 标；对应的卡门氏单位为横坐标，作图，画出标准曲线。（标准曲线已绘） 1 ．标准曲线的制作： (1) 取 5 支试管，编号，按下表操作：

10 加入物（ ml ） 测定管对照管 血清 0.1 基质溶液 0.5 — 混匀，置水浴箱中保温 30 分钟 2,4- 二硝基苯肼液 0.5 基质溶液 — 0.5 混匀，置水浴箱中保温 20 分钟 0.4mol/L 氢氧化钠溶液 5.0 2. 在测定前将底物液在 37 ℃水浴中预温 5 分钟，然后按下表操作： 【参考值】 5 - 25 卡门氏单位。 室温放置 10 分钟后，在 505nm 波长，以蒸馏水校正零点，读取各管的光密度值， 测定管光密度值减去对照管光密度值后，从标准曲线查出。

11 1. 酶测定中，温度、时间对酶的活力影响很大，故应控制好测定时的温度 （要求准确到 37±0.5oC ），并准确掌握保温时间。 2. 丙酮酸的显色受温度影响，故应于季节变化时及底物成份之批号更换时 重新制作标准曲线。 3. 因为 α- 酮戊二酸也能与 2.4- 二硝基苯肼作用生成苯腙而显色，为了减少 其对丙酮酸测定的干扰作用，底物中 α- 酮戊二酸的浓度很低，不能保证酶 反应的充分进行；且 2.4- 二硝基苯肼的浓度也比较低，因此标准曲线不呈 直线。 【注意事项】

12 谷丙转氨酶广泛存在于机体组织中，在肝细胞中此酶活性极 强，心肌细胞中此酶活性亦很强，故在肝疾患 ( 如肝炎、肝癌 等 ) 及心肌受损时，该酶可大量释放入血，使血清谷丙转氨酶 活性大大增加。临床上常借此帮助诊断。另外，血细胞中亦 含有谷丙转氨酶，若取血时发生溶血，血清谷丙转氨酶也可 增高，故应避免溶血。 【临床意义】 1. 血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意义？ 2. 血清谷丙转氨酶的测定有何注意点？为什么要避免溶血？ 【思考题】

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14 改良赖氏法的反应温度 (40 ℃改为 37 ℃ ) 和底物浓度 ( 改为 低浓度 ) 的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比 色法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法 较为一致，能较好反映酶的真实活性。 由于赖氏法设计的底物浓度, 如 α- 酮戊二酸不足，反应速 度只能达到最大速度的 65% ；显色剂 2,4- 二硝基苯肼的用 量只及反应液中酮酸浓度的一半；保温 30min 的酶促反应 后，新生成的丙酮酸和未用完的 a- 酮戊二酸存在着无法人 为控制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重 现性较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。

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16 尽管基质液中余下的 α- 酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝 醌化合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对 505nm 的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用 标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光 度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，结果比其他 比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续 监测法的单位使用赖氏法。 1981 年全国常规生化检验方法 学术讨论会认为赖氏法测定 ALT 活性较为合理，全国肝炎 协作会议也建议统一使用改良赖氏法。