厌氧性细菌及检验.

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1 厌氧性细菌及检验

2 厌氧性细菌(anaerobic bacteria)指一群必须在无氧条件下才能生长繁殖的细菌。
第一节 概 述 厌氧性细菌(anaerobic bacteria)指一群必须在无氧条件下才能生长繁殖的细菌。 一、厌氧菌的分类 分为两类：一类为有芽胞厌氧菌，只有一个属，即梭菌属，共有130个种。以芽胞形式存于体外。 另一类为无芽胞厌氧菌， 包括40多个属，300 多个菌种和亚种；多为体内正常菌 群，存在于皮肤、口腔、上呼吸道、肠道和 泌 尿生殖道。易引起这些部位的内源性感染，而不易诊断。

3 （二）厌氧菌感染的原因 1. 局部组织的氧化还原电势降低 如血管损伤、烧伤、动脉硬化、肿瘤压迫、组织坏死等，可造成局部组织的缺血、缺氧，使Eｈ降低；此外，大面积外伤伴有需氧菌感染消耗了氧，为厌氧菌感染提供了条件。 2 . 机体免疫功能下降　如接受免疫抑制剂、放疗或化疗的患者；糖尿病、慢性肝、肾疾病病人及老人、婴幼儿、早产儿等，因免疫力下降易併发厌氧菌感染。

4 二、厌氧菌感染 （一）厌氧菌在正常人体的分布 　　厌氧菌与需氧菌一起组成了人体的正常菌群。人体许多部位厌氧菌在种类和数量上远多于需氧菌，如在结肠中99%的细菌都是厌氧菌。　　 　　临床厌氧菌感染中，由正常菌群的无芽胞厌氧菌的感染最为多见。

5 常见厌氧菌在正常人体的分布 主要菌属 皮肤 上呼吸道 口腔 肠道 尿道 阴道 芽胞厌氧菌 梭菌属 0 0 ＋＋ ＋－ ＋－ 无芽胞厌氧菌
　主要菌属　　　皮肤　　 上呼吸道　 　口腔　　 肠道　 　尿道　　 阴道 　　芽胞厌氧菌　　　　　　　 　　　 梭菌属　　　　　　　0　　　　　　0　　　　　　 ＋＋　　　　 ＋－　　　　＋－ 无芽胞厌氧菌 革兰阳性杆菌 　 丙酸杆菌属　　　 ＋＋　　　　　＋　　　　　 ＋＝　　　　＋－　　　 　＋－　　　　＋－ 　 双歧杆菌属　　　　　 0　　　　　　0　　　　　 ＋　　　　 ＋＋　　　　　 0　　　　　＋－　 　　 乳杆菌属　　　　　　 0　　　　　　0　　　　　 ＋　　　　 ＋＋　　　　 ＋－　　　　＋＋ 　　 优杆菌属　　　　　　＋＋　　　　 ＋－　　　　 ＋　　　　 ＋＋　　　　　 0　　　　 ＋－ 　　 放线菌属　　　　　　 0　　　　　 ＋－　　　　 ＋＋　　　　　＋　　　　　 0　　　　　0　　　　 革兰阴性杆菌　 　　 类杆菌属　　　　　　 0　　　　　　＋　　　　　 ＋　　　　＋＋　　　　 ＋　　　　　＋ 　　 普雷沃菌属　　　　　 0　　　　　　＋　　　　 ＋＋　　　　＋　　　　　 ＋　　　　　＋ 　　 紫单胞菌属　　　　　 0　　　　　　＋　　　　 ＋＋　　　　＋　　　　　 ＋　　　　 ＋　　　　　　　　 梭杆菌属　　　　　　 0　　　　　　＋　　　　 ＋＋　　　 ＋＋　　　　 ＋　　　　＋－ 革兰阳性球菌 　　 消化球菌属　　　　　 ＋　　　　　 ＋　　　　 ＋＋　　　 ＋＋　　　　 ＋－　　　 ＋＋ 　 消化链球菌属　　　　 ＋　　　　　 ＋　　　　 ＋＋　　　　＋＋　　　　 ＋－　　　 ＋＋ 革兰阴性球菌 　　 韦荣菌属　　　　　　　0　　　　　 ＋　　　　　 ＋　　　　　＋　　　　　 ＋－　　　　 ＋

6 3. 机体局部屏障破坏，使厌氧菌进入周围组织和血液引起感染。
（三）厌氧菌感染的临床及细菌学指征 1 .局部有气体产生　为重要指征之一 2 .发生在粘膜附近的感染 3 .深部外伤　　 4 .有特殊的分泌物　　如有恶臭，暗红血色或在紫外光下发出红色荧光。如分泌物或脓汁中有硫磺颗粒即为放线菌感染。

7 5 . 某些抗生素治疗无效的感染 6 . 细菌形态培养有特征性变化 如革兰染色着色不均、形态奇特、呈明显多形性；或镜检查见细菌而需氧培养为阴性者。

8 第二节 厌氧菌的微生物学检验 （一）标本采集
一、标本的采集与运送 （一）标本采集 　　标本种类：血液、关节液、心包液、腹腔液、膀胱穿刺液等体液；深部脓肿渗出液、肺部渗出液、其他组织穿刺液。厌氧菌培养最好的标本是组织标本，厌氧菌在其中更易生长。 　 采集注意事项：避免正常菌群污染，尽量避免接触空气。有些标本如鼻咽拭子、痰液、流出的脓液、阴道分泌物、粪便等因含大量的正常菌群，故不宜作厌氧菌培养。

9 　　采集方法：采取深部的组织标本：需经碘酒消毒皮肤后，用注射器插入病变部位深部，抽取数毫升后，弃去一滴于酒精棉球上。

10 不同部位标本采集法 收集方法 标本来源 封闭性脓肿 针管抽取 妇女生殖道 后窟窿穿刺抽取 胸 腔 胸腔穿刺术 组 织 无菌外科切开
封闭性脓肿 针管抽取 妇女生殖道 后窟窿穿刺抽取 下呼吸道分泌物 肺穿刺术 胸 腔 胸腔穿刺术 窦道 子宫腔 深部创伤　 用静脉注射的塑料导管穿入感染部位抽取 组 织 无菌外科切开 尿 道　 膀胱穿刺

11 （二）标本的运送与处理 注意尽快送检，避免干燥，避免接触空气。
1. 针筒运送法　适宜液体标本。标本抽取后排尽空气，并将针头插入无菌橡皮塞中即可送检。 2. 无氧小瓶运送法　常用于少量脓液标本的运送。用无菌青霉素小瓶，瓶内装入0.5ｍｌ的心脑浸液(含有0.0003%的刃天青---氧化还原指示剂）,加橡皮塞后,铝盖密封，真空泵抽出瓶中空气，充入N2，连续充抽3次，最后充以 CO2，高压灭菌备用。

12 如有氧渗入小瓶，培养基则显粉红色，应弃去。运送时挑选无色小瓶，将标本用无菌注射器注入瓶中即可。
3. 标本充盈法送检 适宜于大量液体标本运送。将液体标本装满标本瓶，加盖密封，可驱除瓶中空气。 4. 组织块运送法 将组织块放在密封的厌氧罐中运送。罐内放入经酸化硫酸铜浸泡过的钢丝绒，其表面即有金属铜，具强还原性，能迅速吸氧，造成厌氧罐中无氧状态。

13 5. 厌氧袋运送法　 6. 棉拭运送法 （略）　 　　应在20~30min内处理完毕，最迟不超过2h，防止标本中兼性厌氧菌过度生长，抑制厌氧菌的生长。如不能及时接种，应将标本保存于室温（因冷藏对厌氧菌有害）。

14 二、检验程序

15 临床标本 肉眼观察及有无气味 分离培养 增菌培养 直接涂片染色镜检 需氧培养 厌氧培养 菌种保存 形态与染色 厌 氧 培 养 2~7d
（接种非选择性及选择性培养基） （接种液体培养基） 直接涂片染色镜检 厌 氧 培 养 2~7d 确定厌氧菌 每个平板挑5个以上菌落 每个菌落接种两个平板　经48ｈ培养 需氧培养 厌氧培养 生 长 无生长 生 长 专性厌氧菌 兼性厌氧菌 菌种保存 分类鉴定 药物敏感试验 形态与染色 菌 落 生化反应 药敏性鉴定 气液相色谱

16 三、检验方法 （一）肉眼观察 应观察标本的性状，如是否为脓性、带血，有无黑色坏死组织或黑色分泌物，有无硫磺样颗粒或恶臭气味等。这些有助于厌氧菌的鉴定和培养基的选择。 （二）直接镜检 在接种前除血液外，各种临床标本均需直接涂片染色、镜检，以了解标本中细菌的数量、形态及染色性，便于选择合适的培养基和培养方法，还可验证培养结果的成功与失败。

17 厌氧菌的初步鉴定 菌 名 革兰染色 形态及其他特征 脆弱类杆菌 G－ 两端钝圆着色深，中间色浅不均匀，有空泡，长短不一，标本有琥珀味
菌 名 　革兰染色　　　 形态及其他特征 脆弱类杆菌　　 G－　 两端钝圆着色深，中间色浅不均匀，有空泡，长短不一，标本有琥珀味 产黑色素普雷沃菌　G－　　球杆菌，可见多形性，长短不一，紫外线照射发红色荧光，标本有恶臭 具核酸杆菌　　　　G－　　菌体细长，两头尖，紫色颗粒沿菌体长轴成双排列，标本有丁酸味 坏死梭杆菌　　　　G－　　菌体细长，高度多形性，长短不一，菌体中部膨胀呈圆球形 韦荣球菌　　　　　G－　　极小的革兰阴性球菌 消化链球菌　　　　G＋　　球形或卵圆形，呈链状的小球菌，易染成阴性 乳酸杆菌　　　　　G＋　　细长无芽胞，有时多形性，标本有乳酸气味 痤疮丙酸杆菌　　　G＋　　排列呈X、Y、V或栅状，标本有丙酸气味 放线菌　　　　　　G＋　　分枝呈棒状， X、Y、V或栅状排列，脓汁中的黄色颗粒呈琥珀酸气味 破伤风梭菌　　　　G＋　　细长鼓槌状，极端芽胞，圆形 产气荚膜梭菌　　　G＋　　粗大杆菌，呈单或双排列，有芽胞，有荚膜 艰难梭菌　　　　　G＋　　粗长杆菌，芽胞卵圆形或长方形，位于次极端

18 （三）分离培养 1、初代培养　　 培养基的选择：　 （1）非选择培养基　　以牛心脑浸液及布氏肉汤为基础，补充0.5%酵母浸出液，5μg/ml氯化血红素、10 μg/ml维生素K1及5%－10%的脱纤维血的强化血平板。 （2）选择培养基　常用的有: 七叶苷胆汁平板（BBE，用于脆脆弱类杆菌） 卡那万古冻溶血平板（KVLB，可抑制大多数兼性厌氧菌，使产黑色素普雷沃菌早期产生黑色素）

19 VS培养基（韦荣球菌选择培养基） CCFA培养基（艰难梭菌）
FS培养基（梭杆菌选择培养基） VS培养基（韦荣球菌选择培养基） CCFA培养基（艰难梭菌） 上述培养基使用注意：①尽量使用新鲜培养基，2~ 4ｈ内用完；②使用前放入无氧环境，预还原处理24~ 48ｈ；③也可采用预还原灭菌法制备的培养基；④液体培养基应煮沸10min，驱除溶解氧，并迅速冷却，立即接种。

20 如只要求厌氧培养，只需种一个厌氧血平板，并将其分为三个区，在第一、二区交界处贴放一枚灭滴灵，如纸片周围出现抑菌圈，表明有厌氧菌存在。
(2)标本接种 初代培养应同时接种固体和液体两种培养基，且每份标本应同时接种3个平板，分别置有氧、无氧和含5~10%CO2环境培养。 如只要求厌氧培养，只需种一个厌氧血平板，并将其分为三个区，在第一、二区交界处贴放一枚灭滴灵，如纸片周围出现抑菌圈，表明有厌氧菌存在。

21 （3）培养方法 原理是通过物理、化学或生物学等方法，创造一种无氧的环境。
1）厌氧罐培养法：即利用物理或化学的方法在一个密闭的罐子里造成无氧的环境。有抽气换气法和冷触媒法。 抽气换气法：将种好的培养基放于罐内，在放于经烘烤的催化剂（钯粒）盘，盖子拧紧。通过罐盖上的三通管，用真空泵抽尽罐内空气，再用 反复充气与抽气 3 次，最后充入含80%N2、10%H2、10% CO2的混合气体。

22 钯粒用过既失活，再次使用前需将其加热至灼红。如此反复使用： 2H2 + O2 2H2O
冷触媒法： 利用化学方法产生 H2 和CO2 ，产生的 H2 在触媒的作用下，与 罐内的氧结合生成水，将氧消耗掉，造 成无氧环境。 使用时同时抽气换气法将钯粒和接种好的平板放于厌氧罐内，然后将配套的气体发生袋剪去一角，加入10ml 水,立即放于罐内，密封厌氧罐即可。 钯催化剂

23 2) 厌氧气袋法： 原理与冷触媒法相同，只是用无毒的塑料薄膜制成的特殊气袋取代厌氧罐。
优点：简便易行，携带方便，尤适宜于床边接种，和基层医院使用。 3）厌氧手套箱：为国际公认的厌氧菌培养的最佳设备。为一个密闭的大型金属箱，由手套操作箱和传递箱两个部分组成，操作箱内还附有小型恒温培养箱，通过自动化装置自动抽气、换气，保持箱内的厌氧状态。 优点：因接种、培养和鉴定等都是在无氧状态下进行，提高了检验的阳性率；缺点：设备昂贵，耗气。

24 4)疱肉培养法：肉渣加适量液体培养基，表面盖以凡士林。
肉渣含不饱和脂肪酸，可吸收氧，并含谷光甘肽，可降低培养基的氧化还原电势。 适用于所有厌氧菌的培养和菌种保存 　　(4)结果观察　厌氧菌的初代培养生长较慢，故应在48ｈ后才能初步观察，如疑为放线菌则应延长至72－96ｈ。 观察时应注意：①厌氧菌在对数生长期对氧非常敏感，故在培养的48ｈ不应使细菌暴露于空气中；②标本镜检阳性，但培养48ｈ却无菌生长，应继续培养5－7ｄ。　　

25 2. 次代培养和厌氧菌的确定 　　初代厌氧培养有细菌生长时，需做耐氧试验，确定是否为厌氧菌。 　方法是：从每个平板上挑取4－5个不同性状的菌落，每个菌落分别接种3个平板（每个平板分4－6个区，可同时做4－6个菌落的次代培养）。分别放有氧、无氧和含5%－10%CO2环境中培养48ｈ，如只在厌氧环境中生长的细菌，即为厌氧菌。

26 初步鉴定；菌体形态、染色反应、菌落性状、对某些抗生素的敏感性；最后鉴定：依据生化反应和终末代谢产物。
四、鉴定试验 初步鉴定；菌体形态、染色反应、菌落性状、对某些抗生素的敏感性；最后鉴定：依据生化反应和终末代谢产物。 1. 形态与染色：对其鉴定较为重要。 2. 菌落性状：包括其形态、大小、色素、荧光及溶血等。 色素：产黑色素普雷沃菌、不解糖紫单胞菌 —2~10天—黑色素 龋齿放线菌 3~4天 粉红色色素 奈氏放线菌 — 培养时间延长 —黄褐色

27 溶血： 产气荚膜芽胞梭菌 血平板）—形成双溶血环
荧光： 产黑色素普雷沃菌、不解糖紫单胞菌某些株 —— 在紫外线照射下—红色荧光 梭杆菌—黄绿色荧光； 艰难梭菌—绿色荧光 3. 抗生素敏感鉴定试验 常用抗生素：卡那霉素、万古霉素、多黏菌素； 一般抑菌环直径＜10mm 为耐药。 分梭杆菌属对卡那霉素（敏感）— 类杆菌（多数不敏感） 革兰阳性厌氧菌对万古霉素（敏感），对黏菌素耐药。

28 4. 聚茴香脑磺酸钠（SPS）敏 感试验 用于鉴定厌氧消化链球菌（特别敏感）。
5. 生化试验 糖发酵、吲哚试验、硝酸盐还原试验、触媒试验等。可用自动微生物鉴定系统如：VITEK-ANT\ Microscan-ANI等； 胞外酶快速鉴定试验：利用厌氧菌产生的酶，与少量的生化基质反应，不需培养，只需浓菌液即可，4小时可观察结果。 6. 气液相色谱技术

29 厌氧袋 厌氧罐

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31 VITEK全自动微生物分析系统的基本配置

32 MicroScan自动微生物鉴定／药敏测试系统

33 衣氏放线菌在厌氧血平板上的光滑型菌落

34 MicroScan自动微生物鉴定／药敏

35 产黑素普氏菌

36 厌氧菌的动力观察法