东北师范大学生物基础实验教学中心 颜宏 植物生理学基础实验.

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1 东北师范大学生物基础实验教学中心 颜宏 植物生理学基础实验

2 实验一 植物组织水势的测定 （小液流法）

3 一、原 理 当植物细胞或组织放在溶液中时，如果植物的水势小于溶液的渗透势（溶质势），则组织吸水而使溶液浓度变大；反之，则植物细胞内水分外流而使溶液浓度变小；若植物组织的水势与溶液的渗透势相等，则二者水分保持动态平衡，外部溶液浓度不变，此溶液的渗透势即等于所测植物的水势。可以利用溶液的浓度不同其比重也不同的原理来测定试验前后溶液浓度的变化。然后根据公式计算其渗透势。

4 二、仪 器 药 品 试管 毛细吸管（尖端弯成90度） 移液管 单面刀片 镊子 次甲基蓝

5 三、实 验 步 骤 1．首先配制一定浓度蔗糖溶液（0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8M）各10ml，注入试管中，各管都加上塞子，并编号。按编号顺序排成一列，放在试管架上，作为对照组。 2．另取8支试管，编好号，按顺序放在试管架上，作为试验组。然后由对照组中之各试管中分别取溶液4ml移入相同编号的试验组试管中，再将各试管都加上塞子。

6 3．用刀片将马铃薯切成7mm×7mm、厚约2mm大小相等的小块，共80块。向试验组的每一试管中各加相等数目的马铃薯小片，塞好塞子，放置30分钟，在这段时间内摇动数次，到时间后，向每一试管中各加次甲基蓝粉末少许，并振荡，使溶液着色均匀。

7 4．用毛细吸管从试验组的各试管中依次吸取着色的液体少许，然后伸入对照组的相同编号试管的液体的中部，缓慢放出一滴蓝色试验溶液，并观察小液流移动的方向，并记录之。

8 5．计算 记录小液流不动的试管中蔗糖溶液的浓度，按ψπ=－RTiC计算水势值。 C＝等渗浓度（mol/L） R＝气体常数（ MPa/L/mol/K） T＝绝对温度 i＝解离系数（蔗糖＝1，CaCl2＝2.60）

9 【思考题】 1．测定同一植物上部及下部叶片的水势有何差别。 2．用小液流法测定植物组织水势与用质壁分离法测定植物细胞渗透势都是以外液的浓度算出的溶质势为根据，他们之间的区别何在。

10 实验二 氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定根系活力

11 一、原理 氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化还原电位为80mV的氧化还原物质，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯基甲 （TTF），如下式：

12 生成的TTF比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性，并作为根系活力的指标。

13 二、材料、设备仪器及试剂 （一）材料： 水培或砂培小麦、玉米等植物根系。 （二）仪器设备：
分光光度计； 分析天平（0.1mg）； 电子顶载天 平（感量0.1g）； 恒温箱1台； 研钵1套； 三角 瓶50ml； 漏斗； 量筒100ml； 移液管10ml 、2ml 1支、0.5ml 各1支； 刻度试管10ml； 试管架；容 量瓶10ml； 药勺； 石英砂适量； 烧杯10ml、 1000ml； 小培养皿

14 二、材料、设备仪器及试剂 （三）试剂： 1. 乙酸乙酯（分析纯）。 2. 次硫酸钠（Na2S2O4，强还原剂，俗称保险粉），分析纯。
3. 1％TTC溶液：准确称取TTC1.0g，溶于少量水中。定容到100ml。用时稀释至各需要的浓度。 4. 磷酸缓冲液（1／15mol/L，pH7）。 5. 1mol/L硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml。 6. 0.4mol/L琥珀酸：称取琥珀酸4.72g（含6个结晶水10.81g），溶于水中，定容至100ml即成。

15 三、实验步骤 1．定性测定 （1）配置反应液 把1%TTC溶液，0.4moL/L琥珀酸钠和磷酸缓冲液按1︰5︰4比例混合。
（2）把根仔细洗净，把地上部分从茎基切除，将根放入三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，置37℃左右暗处放1h，以观察着色情况，新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色，表明该处有脱氢酶存在。

16 三、实验步骤 2．定量测定 （1）TTC标准曲线的制作 吸取0.25ml 0.4%TTC溶液放入10ml容量瓶，加少许Na2S2O4粉末，摇匀后立即产生红色的TTF。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.5ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定光密度，绘制标准曲线。

17 三、实验步骤 （2）称取根样品0.5g，放入小培养皿，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗处保温1h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，其他操作同上）。 （3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3～4ml和少量石英砂一起磨碎，以提出TTF。把红色提出液移入试管，用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二至三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在485nm下比色，以空白作参比读出光密度，查标准曲线，求出四氮唑还原量。

18  四、结果计算 四氮唑还原强度： 四氮唑还原量（mg） mg/g(根鲜重)/h= 根重（g）×时间(h)

19 实验三 植物体内硝酸还原酶 活力的测定

20 一、原理 硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐 。
产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α–萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。

21 生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以Nμg·g﹣1·h﹣1为单位。

22 二、仪器与设备 分光光度计； 真空抽气泵（或20ml注射器筒）； 天平； 单面刀片； 保温箱（或恒温水浴）； 刻度试管（15ml）；
移液管（5ml×2，2ml×8，1ml×2）。

23 三、试验试剂 亚硝酸钠标准液： 称取分析纯NaNO g水溶后定容至100ml，吸取5ml用水稀释定容至1000ml，即为每ml含NaNO2 5μg（亚硝态氮近似1μg/ml）的标准液。 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液：K2HPO g，KH2PO4 2.2g，加水溶解后定容至1000ml。

24 三、试验试剂 1%（W/V）对-氨基苯磺酸溶液：称取1.0g加入25ml浓HCl中，用蒸馏水定容至100ml。
0.2%（W/V）α-萘胺溶液：称取0.2gα-萘胺溶于25ml冰醋酸中，用蒸馏水定容至100ml。

25 30%三氯乙酸溶液：75.0g三氯乙酸水溶后定容250ml。
KNO3（0.1mol/L）、异丙醇（1% V/V）、磷酸缓冲液（0.1mol/L）混合液：称3.03g KNO3溶于300ml 0.1mol/L的磷酸缓冲液中，再加3ml异丙醇混匀。

26 四、实验步骤 1.标准曲线制作 ： 取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表13-1顺序加试剂，即配成0～2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min，然后在540nm波长下比色。以亚硝态氮（μg）为横坐标，光密度值为纵坐标绘标准曲线或建立回归方程。

27 2．酶反应和酶活性测定 （1）取样 将材料（小麦、玉米等作物叶片）洗净，用蒸馏水冲洗，滤纸吸干。在叶片中部打取直径1cm的圆片（或剪成0.5～1.0cm2的小块），混匀后每个样品称0.5～1.0g 3份，放入试管并编号。

28 （2）反应 向各试管加入KNO3·异丙醇·磷酸缓冲液混合液9ml，其中一管立即加1.0ml三氯乙酸混匀作对照。然后将所有试管置真空干燥器中接真空泵抽气，反复几次直至叶片沉在管底。将各试管置30℃下于黑暗处保温30min，分别向处理管加1.0ml三氯乙酸，摇匀终止酶活性。

29 （3）比色 将各试管静置2min，吸取上清液2ml加入另一组试管，以对照管做参比，按标准曲线做法进行显色测定，并计算酶活性（Nμg·g﹣1·h﹣1）。 酶活性：

30 C—反应液催化产生的亚硝态氮总量（μg）
V1—提取酶液时加入的缓冲液体积（ml） V2—酶反应时加入的粗酶液体积（ml） W—样品重量（g） t—反应时间（h）

31 实验四 钾离子对植物气孔开度的影响

32 一、原理 保卫细胞的渗透系统可由钾离子所调节，无论是环式或非环式光合磷酸化都可形成ATP，ATP不断供给保卫细胞膜上的H+泵作功，使保卫细胞中的H+泵出，并从周围表皮细胞吸收钾离子，降低保卫细胞的水势，使保卫细胞吸水，气孔张开。 要求：了解K＋对蚕豆气孔运动的影响

33 二、实验材料、仪器、试剂 （一）材料：蚕豆叶片 （二）仪器设备： 倒置显微镜；弯头滴管；镊子；打孔器； 培养皿；温箱；盖玻片。 （三）试剂：
0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mol/L硝酸钾、硝酸钠。

34 三、实验步骤 （一）在培养皿中各加入不同浓度梯度的KNO3、NaNO3溶液及蒸馏水15m1。
（二）撕取蚕豆叶下表皮若干放入上述三组培养皿中。 （三）将培养皿放入25℃温箱中，光照条件下照光半小时，然后在镜下观察气孔开度。 （四）每组处理统计150个气孔开度，计算平均值，比较开度大小。

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36 实验五 叶绿体色素的提取、分离

37 一、原理 叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。
这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。 提取液可用色谱分析的原理加以分离：因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。

38 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：菠菜、小白菜叶片 （二）仪器设备 研钵；漏斗；三角瓶；剪刀；滴管；培养皿（直
径11cm）；康维皿或平底短玻管；圆形滤纸（直 径11cm） （三）试剂 95％乙醇；石英砂；碳酸钙粉； 推动剂：按石油醚；丙酮：苯（10:2:1）比例配 制（V／V）。

39 三、实验步骤 1. 叶绿体色素的提取 （1）取菠菜新鲜叶片4～5片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研钵中。
 1. 叶绿体色素的提取 （1）取菠菜新鲜叶片4～5片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研钵中。 （2）研钵中加2～3ml95％乙醇，研磨至糊状，再加10～15ml95％乙醇，提取35min，上清液过滤于三角瓶中，残渣用10ml95％乙醇冲洗，一同滤于三角瓶中。

40 2. 叶绿体色素的分离 （1）取圆形定性滤纸一张（直径11cm），在其中心戳一圆形小孔（直径约3mm）另取一张滤纸条（5cm×1.5cm），用滴管吸取乙醇叶绿体色素提取液沿纸条的长度方向涂在纸条的一边，使色素扩散的宽度限制在0.5cm以内，风干后，再重复操作数次，然后沿长度方向卷成纸捻，使浸过叶绿体色素溶液的一侧恰在纸捻的一端。 （2）将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中，使与滤纸刚刚平齐（勿突出）。

41 （3）在培养皿内放一康维皿，在康维皿中央小室中加入适量的推动剂，把带有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上，使纸捻下端浸入推动剂中。迅速盖好培养皿。
（4）当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤纸，风干，即可看到分离的各种色素：叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。用铅笔标出各种色素的位置和名称。

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44 实验六 叶绿素含量的测定

45 一、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

46 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片 （二）仪器设备： 分光光度计；电子顶载天平（感量0.01g）；
研钵；棕色容量瓶；小漏斗；定量滤纸； 吸水纸；擦境纸；滴管 （三）试剂： 96％乙醇（80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉。

47 三、实验步骤 1. 取新鲜植物（菠菜）叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。
2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2-3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3-5min。

48 三、实验步骤 3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后用乙醇定容至25ml，摇匀。 4. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。

49 四、实验结果计算 将测定得到的吸光值代入下面的式子： Ca=13.95A665－6.88A649 Cb=24.96A649－7.32A665
Cr=18.08 A A665 （Ca、Cb：mg/L） 叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重

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52 实验七 叶绿体光诱导荧光强度的测定

53 一、原理 叶绿体色素在照光时能辐射出荧光。 研究叶绿体色素荧光性质，有助于了解它的分子激发态，分子之间的能量传递以及分子在活体内的排列。叶绿体光诱导荧光强度的变化（以下简称可变荧光）是由于叶绿体吸收光能后，光能在转化和电子传递过程中受阻，能量不能正常的传递下去，而以荧光的形式释放出来，使荧光的强度增加。如果这种变化是由光的影响引起的，就叫光诱导的可变荧光。

54 一、原理 叶绿体在685nm处呈现一个荧光发射峰，它是由光系统II发射出来的，这部分荧光称为固定荧光（F0），是物理性的，它与光系统II的原初反应和电子传递无关当对叶绿体进行光诱导时，而发射出的荧光叫可变荧光（ΔF）。固定荧光和可变荧光之和称为总荧光（Fmax）。由此可见，可变荧光（ΔF）可以代表光系统II反应中心可能利用及转化能量的能力。所以，ΔF在一定程度上代表光系统II反应中心的活性。而可变荧光与固定荧光的比值则表示光系统II的光能转换效率。因此，可作为叶绿体光化学活性的一个重要指标。

55 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：玉米、菠菜叶 （二）仪器设备： 组织捣碎机；冷冻离心机；玻璃匀浆器； 冰箱；动力学分光光度计
 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：玉米、菠菜叶 （二）仪器设备： 组织捣碎机；冷冻离心机；玻璃匀浆器； 冰箱；动力学分光光度计 （三）试剂： 叶绿体制备缓冲液（简称制备液）。  0.05mol/L 磷酸缓冲液，内含0.3mol/L 蔗糖和0.1mol/L KCl，pH7.2。

56  三、实验步骤 叶绿体的制备　 称取10g新鲜植物叶片，用水洗净、吸干，置于预冷的组织捣碎机的玻璃缸内，加入50ml制备液，用4层纱布将匀浆过滤，滤液在0℃下用1000×g离心10min。弃去上清液，在沉淀中加入40ml制备液悬浮，再次用1000×g离心10min，取出沉淀，用15ml制备液在玻璃匀浆器内匀浆，则得叶绿体悬浮液备用。

57 三、实验步骤 2. 在光电倍增管前加一个684nm的滤光片，并把激发光波长调到436nm或480nm。
 三、实验步骤 2. 在光电倍增管前加一个684nm的滤光片，并把激发光波长调到436nm或480nm。 3. 调整基线　将空白缓冲液倒入比色杯中，放入样品室的样品架上，打开激发光谱录基线，如果信号过大，说明滤光片漏光，需更换。 4. 样品测定　将待测的叶绿体样品放入比色杯，并放到样品室内。打开激发光，记录固定荧光。再打开诱导光，记录最大荧光强度（Fmax）。

58 四、结果计算 根据记录的图谱，计算出固定荧光（F0）和总荧光（Fmax）的数值，并按下述公式计算可变荧光和可变荧光产率。
 四、结果计算 根据记录的图谱，计算出固定荧光（F0）和总荧光（Fmax）的数值，并按下述公式计算可变荧光和可变荧光产率。 可变荧光ΔF＝Fmax－F0 可变荧光率＝ΔF/F0

59 实验八 光合作用离体叶绿体 的光还原反应 ——Hill反应

60 一、原理 希尔反应（Hill reaction）是绿色植物的离体叶绿体，在光下分解水放出氧气同时还原电子受体的反应。

61 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料： 菠菜或其它绿色植物新鲜叶片。 （二）仪器设备： 研钵；石英砂；小试管；试管架；漏斗；
纱布；小烧杯； 剪刀 （三）试剂： 0.1％ 2，6-二氯酚靛酚

62 三、实验步骤 取新鲜的菠菜或其它植物叶片0.5g，剪碎后放入研钵中，研磨成匀浆。
加50ml蒸馏水，通过5～6层纱布，过滤到小烧杯中，即得到叶绿体粗悬浮液。 取试管两支。每管中加入叶绿体悬浮液5ml，0.1％2，6-二氯酚靛酚溶液5-6滴，摇匀。将一管置于直射光下，另一管置于暗处，注意日光下的试管液颜色变化。5～8min后，将置于暗处的试管取出，比较两管溶液颜色变化，解释原因。

63 实验九 植物种子生命力的快速测定

64 Ⅰ.TTC法 一、原理 TTC（2，3，5－三苯基氯化四氮唑）氧化态是无色的，可被氢还原成不溶性红色三苯甲月替（TTF）。
种胚生命力衰退或部分丧失生活力则染色较浅或局部被染色，因此，可以根据种胚染色部位或染色深浅程度来鉴定种子的生命力。

65 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料： 小麦种子 （二）仪器设备： 小烧杯；刀片；镊子；温箱 （三）试剂： 0.12％～0.5％TTC溶液
（TTC可直接溶于水，溶于水后，呈中性，pH7±0.5，不宜久藏，应随用随配）。

66 三、实验步骤 将种子用温水（约30℃）浸泡2～6h 随机取种子100粒，然后沿种胚中央准确切开，取其一半备用。
将准备好的种子浸于TTC试剂中，于恒温箱（30～35℃）中保温30min。 反应结束，观察种胚的情况，凡种胚全部或大部分被染成红色的即为具有生命力的种子。种胚不被染色的为死种子，如果种胚中非关键性部位（如子叶的一部分）被染色，而胚根或胚芽的尖端不染色都属于不能正常发芽的种子。 1.使种子充分吸胀。

67 Ⅱ.染料染色法 一、原理 有生命力种子胚细胞的原生质膜具有半透性，有选择吸收外界物质的能力，一般染料不能进入细胞内，胚部不染色。
而丧失生命力的种子，其胚部细胞原生质膜丧失了选择吸收能力，染料可自由进入细胞内使胚部染色。 所以可根据种子胚部是否被染色来判断种子的生命力。

68 二、材料、仪器设备及试剂 三、实验步骤同TTC法 （一）材料： 玉米种子 （二）设备： 小烧杯；刀片；镊子； （三）试剂：
0.02％～0.2％靛红溶液、5％红墨水 三、实验步骤同TTC法

69 Ⅲ.荧光法 一、原理 植物种子中常含有能够在紫外线照射下产生荧光的物质（黄酮类、香豆素类、酚类物质）
种子在衰老死亡时，内含荧光物质虽然没有改变，但由于生命力衰退或已经死亡的细胞原生质之透性增加，当浸泡种子时，细胞内的荧光物质很容易外渗。因此，可以根据前一种情况直接观察种胚荧光的方法来鉴定种子的生命力，或根据后一种情况通过观察荧光物质渗出的多少来鉴定种子的生命力。

70 二、材料及设备 （一）材料： 萝卜种子 （二）设备： 紫外光灯；白纸（不产生荧光的）；刀子；镊子；培养皿；烧杯

71 三、实验步骤（ 纸上荧光） 随机选取50粒完整无损的种子置烧杯内加蒸馏水浸泡10～15min令种子吸胀，然后将种子沥干，再按0.5cm的距离摆放在湿滤纸上（滤纸上水分不宜过多，防止荧光物质流散）以培养皿覆盖静置数h后将滤纸（或连同上面摆放的种子）风干（或用电吹风吹干）。 置紫外光灯下照射，根据滤纸上显现的荧光团的数目就可以测出丧失生命力的种子的数量，并由此计算出有生命力种子所占的百分率。

72 实验十 生长素对植物不同部分 的刺激和抑制作用
实验十 生长素对植物不同部分 的刺激和抑制作用

73 一、原理 生长素及人工合成的类似物质如萘乙酸等对植物生长有很大的调节作用，在不同浓度下对植物生长的效应也不同。一般来说，低浓度的生长素促进生长，高浓度时则抑制生长。不同的植物器官对生长素的反应也不同，通常根比芽、茎对生长素更敏感。本实验据此观察不同浓度的萘乙酸在种子萌发过程中对植物不同器官生长的影响。

74 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料： 小麦种子 （二）仪器设备： 温箱，培养皿，移液管，镊子，滤纸，尺子 （三）试剂：
10mg/L萘乙酸，0.1%升汞

75 三、实验步骤 取小麦种子，用0.1%升汞消毒15min，再用自来水和蒸馏水各冲洗3次，置于22℃的温箱中催芽2d。
取9cm洁净培养皿7套，编号。在1号培养皿中加入10mg/L 萘乙酸10mL，然后从其中吸取1mL放入2号培养皿中，加9mL蒸馏水混匀后即成为1 mg/L 萘乙酸溶液。如此依次稀释到6号培养皿（最后从第6号培养皿中取出1mL弃去），则1号至6号培养皿中的萘乙酸浓度依次为10 mg/L、1 mg/L、0.1 mg/L、0.01 mg/L、0.001 mg/L、 mg/L。第7号培养皿中则加入9mL蒸馏水作为对照。

76 3.在各培养皿中放入一张与培养皿皿底大小一致的滤纸，选取已萌动的小麦种子10粒，用镊子将其整齐地排列在培养皿中，使芽尖朝上并使胚部位朝向同侧，盖上皿盖后，放在22℃温箱中暗培养3d。
4.测量培养皿内小麦幼芽及幼根平均长度以及根数

77 四、实验结果计算与分析 以蒸馏水中材料为对照，计算不同浓度萘乙酸溶液中小麦幼芽及幼根长度的增加或减少值，并填入表中进行比较分析

78 实验十一 赤霉素对α-淀粉酶 的诱导形成

79 一、原理      淀粉性种子在萌动过程中，胚释放出来的赤霉素能诱导糊粉层细胞中α-淀粉酶基因的表达，引起α-淀粉酶生物合成，并分泌到胚乳中催化淀粉水解为糖。通过碘试法比色测定淀粉在酶催化反应过程中的消耗量，可以定量分析α-淀粉酶的活力。

80 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：大麦、小麦种子 （二）仪器设备： 分光光度计；恒温箱；水浴锅；移液管；
烧杯；试管；青霉素小瓶；镊子；刀片

81 （三）试剂： 1%次氯酸钠溶液： 0.1%淀粉溶液： 赤霉素溶液： 2×10–5mol/L、2×10–6mol/L、2×10–7mol/L、2×10–8mol/L ； 10–3mol/L 醋酸缓冲液： I2-KI溶液

82 三、实验步骤 1. 选取大小一致、健康的大麦种子50粒，用刀片将每粒种子横切成两半，使成无胚的半粒和有胚的半粒，分别置于新配制的1％次氯酸钠溶液中，消毒15min，取出用无菌水冲洗数次，备用。  2. 取小瓶6只编好号码，按表（详教材）加入各种溶液和材料，于25℃下培养24小时（进行振荡培养，如无条件，则必须经常摇动小瓶）。

83 三、实验步骤 3. 淀粉酶活性分析：吸取各培养液0.1mL，分别置于1.9mL淀粉磷酸盐的溶液中，摇匀，在30℃温箱或水浴中精确保温10min，然后加I2-KI溶液2mL，蒸馏水5mL，充分摇匀，于波长580nm下测定吸光度，以蒸馏水为空白。从标准曲线查得淀粉含量，以被分解的淀粉量作为淀粉酶的活性。  4. 以不同淀粉浓度（0-7μg/L）或淀粉量（0-100μg）及其吸光度绘制标准曲线。

84 四、结果计算 1. 第1瓶为淀粉的原始量（X）。 2. 第2-6瓶分别为反应后淀粉的剩余量（Y）。
3. 淀粉水解量=[（X—Y）/X]×100%。

85 实验十二 氮蓝四唑（NBT）法 测定超氧物歧化酶（SOD）活力
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑 在光下的还原作用来确定酶活性大小

86 一、原理 在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，还原的核黄素极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。

87 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：水稻或小麦叶片 （二）仪器设备
高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）； 试管或指形管数支

88 （三）试剂　 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8） 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定至100ml； 750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取 gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存； 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取 gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml； 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。

89 三、实验步骤 酶液提取： 取植物叶片0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。

90 三、实验步骤 2. 显色反应：取5ml指形管4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5ml,130mmol/L Met溶液0.3ml,750μmol/L NBT溶液0.3ml，100μmol/L EDTA－Na2液0.3ml，20μmol/L 核黄素0.3ml，酶液0.05ml（2支对照管以缓冲液代替酶液）蒸馏水0.25ml，总体积3.0ml。混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。

91 三、实验步骤 3.SOD活性测定与计算： 至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。

92 四、结果计算 已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个 酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。 SOD总活性以每克鲜重酶单位表示
SOD比活力单位以酶单位／mg蛋白表示 Ack照光对照管的吸光度；AE样品管的吸光度 V样品液总体积（ml）；Vt测定时样品用量（ml） W样鲜重（g）；蛋白质含量单位:mg蛋白／g鲜重

93 实验十三 淀粉酶活性的测定

94 一、原理 β–淀粉酶在高温下易钝化，而α–淀粉酶在pH3.6以下则发生钝化。通常提取液中同时有两种淀粉酶存在，测定时钝化其中之一，即可测出另一酶的活性。 淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3，5–二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原生成3–氨基–5–硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可求出麦芽糖的含量。以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。。

95 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料： 萌发的小麦种子（芽长约1cm） （二）仪器设备： 分光光度计； 离心机； 恒温水浴锅
具塞刻度试管； 刻度吸管； 容量瓶

96 （三）试剂（均为分析纯） 标准麦芽糖溶液（1mg/ml）： 称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100ml 3，5－二硝基水杨酸试剂： 称取1g3，5－二硝基水杨酸，溶于20ml2mol/L NaOH溶液中，加入50ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，溶解后定容至100ml。勿使CO2进入。

97 3. 01mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液： A液（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7.H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L B液（0.1mol/L 柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7.2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：A液55ml+B液145ml混匀 4. 1％淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100ml0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。

98 三、实验步骤 （一）麦芽糖标准曲线的制作： 取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表加入试剂。摇匀，置沸水浴中煮沸5min。
取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20ml。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定。以麦芽糖含量为横坐标，吸光度值为纵座标，绘制标准曲线.

99     （二）酶液制备： 称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加少量石英砂和2ml蒸馏水，研磨成匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管。 提取液在室温下放置提取15～20min，每隔数min搅动1次，使其充分提取。然后在3000rpm下离心10min，将上清液倒入100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。 吸取上述淀粉酶原液10ml，放入50ml容量瓶中，用蒸馏水定至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液。

100 （三）酶活力的测定： 1. α–淀粉酶活性的测定： （1）取试管4支，两支为对照管，两支为测定管。 （2）于每管中各加酶提取液1ml，在70度恒温水浴中加热15分钟，在此期间β–淀粉酶钝化，取出后迅速在自来水中冷却。 （3）在试管中各加入1ml pH5.6柠檬酸缓冲液 （4）向两支对照管中各加入4ml 0.4MNaOH，以钝化酶的活性。 （5）将测定管和对照管置于40度的恒温水浴中准确保温15分，在向各管分别加入40度下预热的淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入40度水浴中保温5分钟，向两支测定管分别迅速加入4ml0.4MNaoH，以终止酶的活性，然后准备下步糖的测定。

101 2.(α+β)–淀粉酶总活性： 取上述酶液5ml，用蒸馏水定容至100ml。混匀后， 取4支试管，2支为对照管，2支为测试管，各加入 吸收后的酶液1ml、pH5.6柠檬酸缓冲液1ml，而后 重复α淀粉酶活性测定的（4）和（5）的操作。 3.样品的测定 取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各 1ml，分别放入15ml具塞刻度试管中，再加入1ml， 3，5-二硝基水杨酸试剂混匀，置沸水浴中煮沸5分 钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至15ml，混匀，用分 光光度计在520nm下比色，记录吸光度值，根据标 准曲线进行计算。

102 （四）结果计算： A为α–淀粉酶测定管中麦芽糖浓度 A’ 为α–淀粉酶对照管中麦芽糖浓度 B为(α+β)–淀粉酶总活性测定管中麦芽糖浓度 B’为(α+β)–淀粉酶总活性对照管中麦芽糖浓度

103 实验十四 植物组织可溶性糖含量测定 蒽酮法测定

104 一、原理 糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内,颜色深浅与糖含量成正比，故可用于糖的定量。 该法的特点是几乎可测定所有的碳水化合物，包括：戊糖、已糖、寡糖类、多糖（淀粉、纤维素），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。 糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为630nm，故在此波长下进行比色

105 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：植物叶片 （二）仪器设备： 分光光度计；电炉；铝锅；20ml刻度试管；
刻度吸管5ml 1支，1ml 2支； 记号笔；吸水纸适量

106 二、材料、仪器设备及试剂 （三）试剂： 1.蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1g，溶于50ml乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中。
2.1%蔗糖标准液： 将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100ml容量瓶中，加入0.5ml浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度； 3.100μg/ml蔗糖标准液： 精确吸取1%蔗糖标准液1ml加入100ml容量瓶中，加水定容。 4.浓硫酸（比重1.84）。

107 三、实验步骤 1．标准曲线的制作 按下表方法加入配置标准的蔗糖溶液
 三、实验步骤 1．标准曲线的制作 按下表方法加入配置标准的蔗糖溶液 按顺序向试管中加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其光密度，以光密度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。

108  三、实验步骤 2．取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10～0.30g，共3份，或干材料。分别放入3支刻度试管中，加入5～10ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25ml容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。 3．显色测定： 吸取样品提取液0.5ml于20ml刻度试管中（重复2次），加蒸馏水1.5ml，以下步骤与标准曲线测定相同，测定样品的光密度。

109 4．计算可溶性糖的含量： C－标准方程求得糖量(μg)； a－吸取样品液体积(ml)； V－提取液量(ml)； n －稀释倍数； W－组织重量（g）。

110 实验十五 吲哚乙酸氧化酶活性的测定

111 一、原理 IAA氧化酶是一种含铁的血红色素蛋白质，参与吲哚乙酸(植物生长素)在植物体内的氧化。
在吲哚乙酸氧化酶的作用下，吲哚乙酸受到氧化，生成无植物生理活性的3一亚甲氧基代吲哚最终产物。 以破坏吲哚乙酸的速度表示酶活性的大小，用比色法测定吲哚乙酸含量的变化。

112 二、材料、仪器设备及试剂 材料：绿豆 仪器设备： 研钵、试管、可见光分光光度计、 恒温水浴锅 试剂： 氯化锰、吲哚乙酸、磷酸

113 三、实验步骤 1．新鲜绿豆芽，去子叶，留胚轴待用。 2．取消20株下胚轴加磷酸缓冲液5ml（预冷），研磨成匀浆，过滤，得酶液待用。
3、取2 支试管，作如下处理： （1）氯化锰1ml+二氯酚2ml+吲哚乙酸1ml+酶液1ml （2）氯化锰1ml+二氯酚2ml+吲哚乙酸1ml+磷酸1ml，于30度下恒温水浴30分钟

114 4.取反应液2ml+吲哚乙酸试剂B4ml，暗处30℃下保温30min。于530nm下比色读取光密度值。
5.标准曲线的绘制：配制浓度为0、25、50、75、100、125ug/ml的吲哚乙酸溶液，按上述方法分别测量光密度值。

115 拟开设实验1 植物过氧化物酶同工酶 的凝胶电泳
拟开设实验1 植物过氧化物酶同工酶 的凝胶电泳

116 一、原理  聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂作用下聚合而成，具有三维网状结构，其网孔大小可由凝胶浓度和交联度加以调节。凝胶电泳兼有电荷效应和分子筛效应。被分离物质由于所载电荷数量、分子大小和形状的差异，因此在电泳时产生不同的泳动速率而相互分离。

117 一、原理 利用特异性的颜色反应使待测酶着色，这样就可在凝胶中展现出酶谱。过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶。植物体内许多生理代谢过程常与它的活性及其同工酶的种类有关。利用过氧化物酶能催化H2O2把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物的原理，将经过电泳后的凝胶置于有H2O2及联苯胺的溶液染色，出现蓝色或棕褐色部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置，多条有色带即构成过氧化物酶同工酶谱。本实验利用连续的盘状凝胶电泳，采用Tris－Gly缓冲系统来分离阴离子过氧化物酶同工酶。

118 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：小麦芽 （二）仪器设备： 稳流稳压电泳仪； 冷冻离心机及离心管； 成套电泳槽（圆盘型）； pH试纸；
（二）仪器设备：　 稳流稳压电泳仪； 冷冻离心机及离心管； 成套电泳槽（圆盘型）； pH试纸； 其它常规用具

119 二、材料、仪器设备及试剂 （三）试剂：　 1. 分离胶缓冲液（pH8.9）：1mol/L HCl 48ml，Tris36.6g，TEMED0.23ml，加水定容至100ml。 2. 分离胶贮液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加水溶解并定容至100ml，过滤后使用。 3. 过硫酸铵溶液：过硫酸铵0.2g，加水定容至100ml制胶时现配现用）。 4. 浓缩胶缓冲液：1mol/L HCl48ml＋Tris5.98g＋TEMED0.46ml，调pH6.7，并定容至100ml。

120 二、材料、仪器设备及试剂 5. 浓缩胶贮备液：丙烯酰胺10g，甲叉双丙烯酰胺2.5g加水定容到100ml，使用前过滤。
6. 电极缓冲液：Tris 6.0g，Gly 28.8g， 用水定容至1000ml（pH8.3），用前稀释10倍。 7. 四甲基乙二胺（TEMED）。 8. 0.1％的溴酚蓝水溶液。 9. 联苯胺染色母液：联苯胺1g＋冰醋酸18ml＋H2O2ml溶解贮于棕色瓶中。

121 三、实验步骤 安装电泳槽 凝胶的配制 过氧化物酶的提取：称取1g待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内，加入1mlH2O或0.05mol/L Tris－HCl缓冲液（pH6，8）研成匀浆，转入离心管，再用2ml前述溶液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部转入离心管，3500rpm离心15～20min，上清液即为酶提取液，供电泳分析用。

122 三、实验步骤 3.点样：用微量注射器吸取上清液，每管加样50μl，再分别加入40％蔗糖溶液5μl，之后再用注射器将电极缓冲液慢慢加入每支胶管至浸没顶部为止.最后向上、下电泳槽倒入电极缓冲液（上槽必须淹没管顶，下槽液要能浸泡着凝胶管），最后在上槽液中滴入1～2滴溴酚蓝溶液。 4.电泳：将电泳槽放至低温处，最好在4℃左右，或接通电泳槽水冷却系统按上“一”下“＋”接好导线，通电，电泳开始电流应低，每管1mA，10min后，再加大电流，使每管达到2～3mA，当溴酚蓝指示剂达到距管底约1cm处时，切断电流，停止电泳。

123 三、实验步骤 6. 剥胶：电泳完毕，将电泳槽取出，倒去缓冲液，取下凝胶管，放入培养皿中。用一个带有长针头的注射器，吸满水，将针头沿管壁插入，同时慢慢地将注射器中的水推出，并不断转动凝胶管，将凝胶管挤脱出来，也可用洗耳球挤压。 7. 染色：取0.5ml联苯胺母液＋H2O 9.3ml＋0.2ml3％H2O2，混匀后倒入盛有凝胶条的培养皿。10min后用自来水冲洗，这时蓝色带也慢慢变成棕褐色。 8. 记录酶谱，并计算各同工酶的迁移率。

124 拟开设实验2 植物体内游离脯氨酸 含量测定

125 一、原理 采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减小了其他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。

126 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：受环境胁迫的植物叶片 （二）仪器设备：
分光光度计；水浴锅；漏斗；20ml大试管数支；20ml具塞刻度试管9支；5～10ml注射器或滴管。

127 二、材料、仪器设备及试剂 （三）试剂： 3%磺基水杨酸水溶液；甲苯；
2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol/L磷酸以3︰2混合，作为溶剂进行配制，此液在4℃下2～3日有效； 脯氨酸标准溶液：称取25mg脯氨酸，蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg/ml。再取此液10ml用蒸馏水稀释至100ml，即成10μg/ml的脯氨酸标准液。

128 三、实验步骤 1．标准曲线制作 （1）取7支具塞刻度试管按下表加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40min。

129 三、实验步骤 （2）取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以“0”管为对照在波长520nm下比色。
（3）以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。

130 三、实验步骤 2．样品测定 （1）脯氨酸提取 取不同处理的剪碎混匀小麦叶片0.2～0.5g（干样根据水分含量酌减），分别置于大试管中，加入5ml 3%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10min。 （2）取出试管待冷却至室温后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml显色液，于沸水浴中加热40min，下一步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色。

131 三、实验步骤 （3）结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量的百分数。 C—提取液中脯氨酸浓度（μg）
V—提取液总体积（ml） a—测定时所吸取的体积（ml） W—样品重（g）

132 拟开设实验3 植物抗逆性的鉴定 （电导仪法）

133 一、原理 植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着 重要的作用。在正常情况下，细胞膜对物质具有选
择透性能力。当植物受到逆境影响时，细胞膜遭到 破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗， 以致植物细胞浸提液的电导率增大。 膜透性增大的程度与逆境胁迫强度有关，也与植物 抗逆性的强弱有关。因此，电导法目前已成为作物 抗性栽培、育种上鉴定植物抗逆性强弱的一个精确 而实用的方法。

134 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：小麦、女贞叶片 （二）仪器设备： 电导仪；天平；温箱；真空干燥器； 抽气机；恒温水浴锅；注射器；
（三）试剂：NaCl溶液。

135 三、实验步骤 选取小麦或其他植物在一定部位上生长叶龄相似的叶子若干，剪下后A，先用纱布拭净，称取二份，各重2g。
2. 一份插入小杯中放在40℃恒温箱内萎蔫0.5～1h，另一份插入水杯中放在室温下做对照。处理后分别用蒸馏水冲洗二次，并用洁净滤纸吸干。然后剪成长约1cm小段放入小玻杯中（大小以够容电极为度），并用玻棒或干净尼龙网压住，在杯中准确加入蒸馏水20ml，浸没叶片。

136 三、实验步骤 4. 放入真空干燥器，用抽气机抽气7～8min以抽出细胞间隙中的空气；重新缓缓放入空气，水即被压入组织中而使叶下沉。
6. 测过电导率的之后，再放入100℃沸水浴中15min，以杀死植物组织，取出放入自来水冷却10min，在20～25℃恒温下测其煮沸电导率。

137 实验4 植物激素对愈伤组织 形成和分化的影响

138 一、原理 愈伤组织分化根和芽受培养基中生长素和细胞分裂素的相对浓度的影响，生长素/细胞分裂素比值高时，促进根的分化；比值低时，则促进芽的分化；两种激素比值适中时，则愈伤组织生长占优势或不分化。这样，通过改变两种激素的相对浓度即可有效地调节愈伤组织再分化的进程。

139 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：植物器官 （二）仪器设备： 超净工作台；高压灭菌锅1个；手术刀一把；长柄镊
（二）仪器设备：　 超净工作台；高压灭菌锅1个；手术刀一把；长柄镊 子1把；三角瓶4 支； 容量瓶：25ml、50ml、 500ml、1000ml各1支；吸量管：1ml、2ml、5ml、 10ml各1支；培养皿1个；下口杯1个；烧杯1000ml 1个；酒精灯1个；牛皮纸；白线绳；培养室。 （三）试剂：　 75％乙醇；1％次氯酸纳；1mol/L HCI；琼脂；6-苄基腺嘌呤；萘乙酸；MS培养基中各种化合物。

140 三、实验步骤 1.配制培养基 按MS培养基配方，先配制各母液。 (1)按表1，配置10倍的大量元素母液： 用蒸馏水溶解并定容至1000ml。

141 三、实验步骤 (2)按表2配置100倍的微量元素母液：用蒸馏水溶解并定容至1000ml。

142 三、实验步骤 (3)200倍的铁盐母液：称EDTA-Na2 3.37g， FeSO4·7H2O 2.78g，用蒸馏水溶解并定容至500ml。
(4)有机成分： ①20mg/ml的肌醇溶液 称取2g肌醇，用蒸馏水溶解后定容至100ml。 ②0.5mg/ml的烟酸溶液 称取12.5mg的烟酸，用蒸馏水溶解后定容至25ml。 ③1mg/ml的甘氨酸溶液 称取25mg甘氨酸，用蒸馏水溶解后定容至25ml。表2 100倍的微量元素母液配置表无机盐重量（mg）

143 三、实验步骤 ④0.5mg/ml的盐酸吡哆醇（维生素B6） 称取12.5mg盐酸吡哆醇，用蒸馏水溶解后定容至25ml。
(5)植物激素： ①0.1mg/ml的萘乙酸溶液 称取10mg NAA，用少量95％乙醇溶解后，用蒸馏水定容至100ml。

144 三、实验步骤 ②1mg/ml 6-苄基腺嘌呤 称取50mg6-BA，用少量1mol/L的HCl溶解后，用蒸馏水定容至50ml。
将各种元素的母液混合，配制成MS培养基，其中1升体积中所含各种元素的母液含量如表3：

145 三、实验步骤 再按表4分别加入NAA和6-BA母液：

146 三、实验步骤 先在三角烧杯（或不锈钢锅）加入600ml蒸馏水，加入所需的琼脂和糖，在水浴锅里将琼脂溶化，如果直接加热应不停地搅拌，防止在瓶底（或锅底）烧焦或沸腾溢出。再将溶解的琼脂糖溶液倒入盛有上述各种物质母液的下口杯中，混匀，用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调pH至5.8，用蒸馏水定至1升。

147 三、实验步骤 将培养基分注到三角瓶或试管中，按容器的大小和培养要求放入适当量的培养基。分装时注意不要把培养基沾附到瓶口或管口附近的内壁上，以免培养过程中发生污染。分装中还要不时搅动下口杯中的培养基，否则先后分装的各瓶培养基凝固能力不同。盖上棉塞，用牛皮纸包扎好后，放入高压灭菌锅，1.2大气压下灭菌15min，冷却后备用。

148 三、实验步骤 2.材料的灭菌与接种 取植物材料，先用自来水冲洗，然后在75％乙醇中浸泡15秒钟，后用无菌水冲洗2次，再用1％次氯酸纳溶液浸泡15min，并不时轻轻搅动。用无菌水清洗三次，再转入放有滤纸而又无菌的培养皿中，用剪刀5毫米见方大小的小块，一个100ml的三角瓶中6～8个小块。接种后放到培养室中培养。培养室内的温度为25±2℃，日光灯每天照明12h，光照强度约2000lx。

149 三、实验步骤 3.结果观察和记录 接种后注意观察记录外植体上愈伤组织和根芽出现的时间和数量，加以分析比较。

150

151 拟开设实验5 植物组织中丙二醛 含量测定

152 一、原理 丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5-三甲基恶唑-2，4。二酮)，其最大吸收波长在532nm。 测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA-TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。

153 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：植物叶片 （二）仪器设备： 紫外可见分光光度计1台；离心机1台；电子天平1台；
10ml离心管4支；研钵2套；试管4支；刻度吸管： 10ml1支，2ml1支；剪刀1把。 （三）试剂： 10％三氯乙酸(TCA)； 0．6％硫代巴比妥酸：先加少量的氢氧化钠(1mol·L-1)溶解，再用10％的三氯乙酸定容；

154 三、实验步骤 1．实验材料 受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官。
2．MDA的提取 称取剪碎的试材1g，加入2mll0％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆， 再加8mlTCA进一步研磨，匀浆在4000r·min-1离心10min，上清液为样品提取液。 3．显色反应和测定 吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml 0．6％TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532、600和450nm波长下的消光度。

155 三、实验步骤 4．计算含量 (1)直线方程法 MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的消光度值为零。不同浓度的蔗糖(0-25mmol·L-1)与TBA显色反应产物在450nm的消光度值与532nm和600nm处的消光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的消光度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的消光度值。 UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为： Y532＝-0．O0l98十0．088D （1）

156 三、实验步骤 (2)双组分分光光度法 据朗伯一比尔定律：D＝kCL，当液层厚度为1cm时，kD／C， k称为该物质的比吸收系数。当某一溶液中有数种吸光物质时，某一波长下的消光度值等于此混合液在该波长下各显色物质消光度之和。 已知蔗糖与TBA显色反应产物在450nm和532nm波长下的比吸收系数分别为85．40、 7．40。MDA在450nm波长下无吸收，故该波长的比吸收系数为0，532nm波长下的比吸 系数为155，

157 三、实验步骤 根据双组分分光度计法建立方程组，求解方 程得计算公式： 式中 C1＝11．71D450 （2）
C2＝6．45(D532-D600)--0.56D （3） C1--可溶性糖的浓度(mmol·L-1)， C2----MDA的浓度（umol·L-1）， D450、0532、D600分别代表450、532和600nm波长下的消光度值。

158 三、实验步骤 以直线方程法计算时，按公式（1）求出样品中糖分在532nm处的消光度值Y532，用实测532nm的消光度值减去6nm非特异吸收的消光度值再减去Y532，其差值为测定样品中MDA-TBA反应产物在532nm的消光度值。按MDA在532nm处的毫摩尔消光系数为155换算求出提取液中MDA浓度。

159 三、实验步骤 以双组分分光光度法计算时，按公式（3）可直接求得植物样品提取液中MDA的浓度。
用上述任一方法求得MDA的浓度，根据植物组织的重量计算测定样品中MDA的含量： MDA含量(umol·g-1)＝MDA浓度(umol·L-1)x提取液体积(ml)／植物组织鲜重(g)

160 植物生理学大实验 主讲人:石连旋