Structure and Function of Protein

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1 Structure and Function of Protein
第 一 章 蛋白质的结构与功能 Structure and Function of Protein

2 本章主要内容 (Main Content) 组成元素、平均含氮量 (Content)
氨基酸的分类、三字符缩写 (classification) 氨基酸的理化性质 (Characterization) 肽、肽键、多肽的概念及GSH的功能 一级结构的概念 (Primary Structure) 二级结构 (Secondary Structure) 三级结构 (Tertiary Structure) 四级结构 (Quaternary structure) 蛋白质组学及其研究技术平台 (Proteomics) 蛋白质空间结构与功能的关系 (Structure and function) 蛋白质的理化性质及分离纯化 (Purification)

3 一、蛋白质概念 蛋白质(protein)是源自希腊字proteios，意思就是primary。
蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物(polymeric nitrogen compounds)。 蛋白质(protein)是源自希腊字proteios，意思就是primary。

4 二、蛋白质的生物学重要性 1. 蛋白质(protein)是生物体(organism)重要组成成分
分布广：所有器官(organ)、组织(tissue)都含有蛋白质；细胞(cellula)的各个部分都含有蛋白质。 含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45％，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80％。

5 3. 氧化供能(oxidation powering)
2. 蛋白质具有重要的生物学功能 1）作为生物催化剂（酶enzyme） 2）代谢调节(metabolic regulation)作用 3）免疫(immune)保护作用 4）物质的转运(transport)和存储(storage) 5）运动与支持作用 6）参与细胞间信息传递 其他生物学功能：营养蛋白，结构，毒蛋白 3. 氧化供能(oxidation powering)

6 蛋 白 质 的 分 子 组 成 The Molecular Component of Protein
第 一 节 蛋 白 质 的 分 子 组 成 The Molecular Component of Protein

7  组成蛋白质的元素 主要有C、H、O、N和S。 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。

8  蛋白质元素组成的特点 各种蛋白质的含氮量(nitrogen content)很接近，平均为16％。
体内的含氮物质(nitrogen-containing substance)以蛋白质为主，故测定生物样品中的含氮量，可根据以下公式推算蛋白质的大致含量： 每克样品中蛋白质的含量 = 每克样品含氮量（克）× 6.25 （总氮量的测定—凯氏定氮法） 1/16%

9 一、氨基酸(amino acid) —— 组成蛋白质的基本单位
存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L-α-氨基酸（甘氨酸除外）。

10 共同特点： ① 除脯氨酸(proline)外，在a-C上皆有一个氨基，故称a-氨基酸； ② 均为L-氨基酸。

11 氨基酸的D－型和L－型是与甘油醛(glyceric aldehyde)相比较而得。通常把含C基团放在纵轴上，看H的位置，左边为D型，右边为L型。

12 C + N H 3 O - CH3 R H 丙氨酸(alanine) L-氨基酸的通式（R为侧链） 甘氨酸(glycine)

13 （一）氨基酸的分类 1.根据氨基酸的化学结构分为脂肪族(Aliphatic)，芳香族(Aromatic)和杂环族(heterocyclics)三类。 2.根据氨基酸的R基极性分为： 非极性R基氨基酸，不带电荷极性氨基酸，带电荷极性氨基酸 3.根据氨基酸分子中所含氨基和羧基数目的不同分：中性(neutral)、碱性(basic)、酸性(acidic)氨基酸 4.根据氨基酸的R基物理性质，与水的相互作用分为： 疏水氨基酸(hydrophobic amino acid)，亲水氨基酸(hydrophilic amino acid)

14 根据侧链结构和理化性质氨基酸的分类： 非极性疏水性氨基酸 7 极性中性氨基酸 8 酸性氨基酸 2 碱性氨基酸 3
酸性氨基酸 2 碱性氨基酸 3 * 20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:

15 苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48
非极性疏水性氨基酸 甘氨酸 glycine Gly G 丙氨酸 alanine Ala A 缬氨酸 valine Val V 亮氨酸 leucine Leu L 异亮氨酸 isoleucine Ile I 苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 脯氨酸 proline Pro P 目 录

16 2. 极性中性氨基酸 色氨酸 tryptophan Trp W 5.89 丝氨酸 serine Ser S 5.68
酪氨酸 tyrosine Tyr Y 半胱氨酸 cysteine Cys C 蛋氨酸 methionine Met M 天冬酰胺 asparagine Asn N 谷氨酰胺 glutamine Gln Q 苏氨酸 threonine Thr T 目 录

17 天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97
3. 酸性氨基酸 天冬氨酸 aspartic acid Asp D 谷氨酸 glutamic acid Glu E 4. 碱性氨基酸 赖氨酸 lysine Lys K 精氨酸 arginine Arg R 组氨酸 histidine His H 目 录

18 几种特殊氨基酸 脯氨酸(proline) （亚氨基酸）

19  半胱氨酸(cysteine) + -HH 二硫键 胱氨酸 (cystine)

20 胱氨酸(cystine)

21 （二）氨基酸的理化性质 1. 两性解离及等电点 氨基酸是两性电解质(ampholyte)，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度(acidity-alkalinity)。 等电点(isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子(cation)和阴离子(anion)的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。

22 +OH- +OH- +H+ +H+ pH>pI pH<pI pH=pI 阳离子 氨基酸的兼性离子 阴离子

23 ①当氨基酸仅有2个可解离基团时:

24 ②当氨基酸仅有3个可解离基团时,可写出其电离式后取兼性离子两边的pK值的平均值:

25 带电状态判定 pI-pH<0 ……………带负电 pI-pH>0 ……………带正电 pI-pH＝0 ……………不带电 等电点计算 ①侧链为非极性基团(nonpolar groups)或虽为极性基团(polar group)但不解离的氨基酸：pI=½(pK1+pK2) ②酸性氨基酸(Glu、Asp)及Cys：pI=½(pK1+pKR) ③碱性氨基酸(Lys、Arg、His)：pI=½(pK2+pKR)

26 2. 紫外吸收 Trp、Tyr的最大吸收峰在 280 nm 附近。
芳香族氨基酸(aromatic amino acid)的紫外吸收

27 3. 茚三酮反应ninhydrin reaction (定量分析)
氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，故可作为氨基酸定量分析方法。 例外：Pro黄色（440nm）；Gln, Asn棕色

28 二、肽 （一）肽 (peptide) 概念： * 肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。

29 + -HOH 甘氨酰甘氨酸 肽键

30 * 肽(peptide)是由氨基酸通过肽键(peptide bond)缩合而形成的化合物。
* 两分子氨基酸缩合形成二肽(dipeptide)，三分子氨基酸缩合则形成三肽(tripeptide)…… * 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。 * 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。

31 * 多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。
多肽链有两端 N 末端(amino terminal): 多肽链中有自由氨基的一端 C 末端(carboxyl terminal): 多肽链中有自由羧基的一端

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33 （二） 几种生物活性肽 1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH)

34 功能 (1)巯基(sulfhydryl group)为体内重要的还原剂(reducing agent)，保护蛋白质或酶中的巯基免受氧化。
(2)分解H2O2。 (3)解毒功能：巯基的亲核性可与外源性亲电子毒物如致癌剂或药物结合。

35 2. 多肽类激素(polypeptide hormone)及 神经肽(neuropeptide)
体内许多激素属寡肽或多肽 神经肽(neuropeptide)

36 蛋 白 质 的 分 子 结 构 The Molecular Structure of Protein
第 二 节 蛋 白 质 的 分 子 结 构 The Molecular Structure of Protein

37 蛋白质的分子结构包括 高级结构 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure)
三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure) 高级结构

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39 一、蛋白质的一级结构 定义 蛋白质的一级结构(primary structure)是指多肽链中氨基酸的排列顺序。 主要的化学键
肽键(peptide bond)，有些蛋白质还包括二硫键。

40 一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。
目 录

41 二、蛋白质的二级结构 蛋白质的二级结构(secondary structure)是指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基(residue)侧链的构象(conformation) 。 定义 主要的化学键： 氢键(hydrogen bond)

42 （一）肽单元(peptide unit) 肽单元又称为肽 单位，是多肽链中从 一个α碳原子到相邻 α碳原子之间的结构,
由Linus Pauling和 Ro- bert Corey于20 世纪 30年代末确定。

43 1.肽单位是一个刚性平面: 肽键中的C－N键长（0.132nm）介于C-N 的单键长（0.149nm）和双键长（0.127nm）之
间，故具有部分双键性质，不能自由旋转肽 单位的6个原子处于1个平面上肽平面(peptide plane)。

44 2.肽键的原子排列呈反式构型。 参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元 (peptide unit) 。

45 蛋白质二级结构的主要形式 -螺旋 (  -helix ) -折叠 ( -pleated sheet )
-转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( random coil )

46 （二） -螺旋 α-螺旋（α-helix): Pauling和Corey建立了多种分子模型， 仔细
观察了氨基酸和小肽的键角和键长，于1951年提 出了α-螺旋和-折叠结构模型。 1.α-螺旋是一个类似棒状的结构 多肽链中各个肽平面围绕同一轴旋转,形成螺 旋结构，螺旋一圈含3.6个氨基酸残基，螺距0.54 nm。 2.肽链内形成氢键(hydrogen bond)： 第一个肽键的N-H与第四个肽键的CO形成氢 键。

47 目 录

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49 （三）-折叠 1.β-折叠（β-pleated sheet):为由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象。

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51 2.肽链走向分平行(parallel)和反平行(antiparallel)两种。

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53 α-螺旋结构与β-折叠结构的比较 α-螺旋结构 β-折叠结构 氢键 链内氢键 氢键平行于轴 链间氢键 氢键垂直于轴 R基 伸向外侧
分布在片层的上下

54 （四）-转角和无规卷曲 1.β-转角（β-turn): β-转角常发生于肽链进行180°回折时的转角上。通常由4个氨基酸残基组成，其第一个残基的-CO与第四个残基的-N-H形成氢键。氢键包围10个原子。第二个残基常为Pro.

55 -转角

56 2.无规卷曲( random coil ) : 无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。

57 （五）模体 在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构(secondary structure)的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象(conformation)，被称为模体(motif)。

58 钙结合蛋白中结合钙离子的模体 锌指结构

59 （六）氨基酸残基的侧链(side chain)对二级结构形成的影响
蛋白质二级结构是以一级结构为基础的。一段肽链其氨基酸残基的侧链适合形成-螺旋(-helix)或β-折叠(β-turn)，它就会出现相应的二级结构。

60 1.多个酸性氨基酸或碱性氨基酸在同一肽 段内影响α-螺旋的形成。 2.Asn、Leu的侧链很大影响α-螺旋的形成。 3.Pro使α-螺旋中断。 4.氨基酸残基的侧链小的肽段才能互相靠 近，有利于β-折叠的形成。

61 三、蛋白质的三级结构 （一） 定义 蛋白质的三级结构(tertiary structure)是指整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。 疏水键(hydrophobic bond)、离子键(ionic bond)、氢键(hydrogen bond)和 Van der Waals力等。 主要的化学键

62 肌红蛋白 (Mb)

63 （二）结构域 大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain) 。
纤连蛋白(fibronectin)分子的结构域

64 （三）分子伴侣 分子伴侣(chaperon)通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象，或形成四级结构(quaternary structure)。 * 可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合，随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。 * 也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。 * 在蛋白质分子折叠过程中，对二硫键(disulfide bond)的正确形成起了重要的作用。

65 四、蛋白质的四级结构 有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基 (subunit)。
蛋白质分子中各亚基(subunit)的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构(quaternary structure) 。 亚基之间的结合力主要是疏水作用(hydrophobic interaction)，其次是氢键和离子键。

66 同二聚体(homodimer): 两个亚基相同 异二聚体（heterodimer）: 两个亚基不同。

67 血红蛋白(hemoglobin)的四级结构
1 2 2 1 N C 血红蛋白(hemoglobin)的四级结构 成人血红蛋白由2条链和2条链组成,各亚基分别含一个血红素.

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69 The Relation of Structure and
第 三 节 蛋白质结构与功能的关系 The Relation of Structure and Function of Protein

70 一、蛋白质一级结构与功能的关系 （一）一级结构是空间构象(conformation)的基础
构型(Configuration)：指分子中各个原子或基团特有的固定的空间排列。立体异构体中取代基团或原子因受某种因素的限制，在空间取不同位置就形成的不同立体结构。构型的改变涉及共价键(covalent bond)的断裂，也往往使分子的化学活性发生变化。 构象(Conformation)：分子中不同碳原子上的各原子或基团的空间排列关系，即不要改变共价键就可以使分子的立体结构发生改变，此立体结构就称构象。

71 ■蛋白质一级结构(primary structure)是空间结构和生物功能的基础，一级结构决定空间结构；
■一级结构并非决定空间结构的唯一因素。 ■空间结构是生物活性的直接体现。

72 牛核糖核酸酶的一级结构 二硫键

73 天然状态，有催化活性 尿素、 β-巯基乙醇 去除尿素、 非折叠状态，无活性

74 （二）一级结构与功能的关系 1、不同蛋白质之间的比较：相似结构相似功能、不同结构不同功能 【举例】胰岛素(insulin)
胰岛素分子中氨基酸残基的差异部分 来 源 A A A A30 人 Thr Ser Ile Thr 猪 The Ser Ile Ala 狗 Thr Ser Ile Ala 兔 Thr Ser Ile Ser 牛 Ala Ser Val Ala 羊 Ala Gly Val Ala 马 Thr Gly Ile Ala 抹香鲸 Thr Ser Ile Ala 鲸 Ala Ser Thr Ala 表中九种动物之间胰岛素分子一级结构中存在的氨基酸残基组成 的差异不影响胰岛素的生物活性。临床上曾经应用猪和牛的胰岛素治 疗人的糖尿病，取得了显著的疗效。

75 2、同一蛋白质不同状态的比较：一级结构决定空间结构
【举例】酶原激活(activation of zymogen)、蛋白变性(denaturation)与复性(renaturation) 天然状态，有催化活性 尿素、 β-巯基乙醇 去除尿素、 非折叠状态，无活性

76 镰刀型红细胞贫 正常红血球 血症红血球 3、保守序列、保守氨基酸改变，功能改变；保守氨基酸不变，功能不变
【举例】分子病(molecular diseases) 镰刀型红细胞贫 　血症红血球 正常红血球

77 镰刀形红细胞贫血症原因：β链第6位由Glu6 → Val6。
N-val · his · leu · thr · pro · glu · glu · · · · ·C(146) HbS β 肽链 HbA β 肽 链 N-val · his · leu · thr · pro · val · glu · · · · ·C(146) 这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。

78 4、氨基酸序列提供重要的生物进化信息 【举例】细胞色素c

79 人与一些动物细胞色素C 一级结构氨基酸差异的数量比较
人,猩猩 猕猴 马 驴 猪、牛、羊 狗 小灰鲸 兔 袋鼠 鸡、火鸡 企鹅 北京鸭 响尾蛇 啮龟 牛蛙 金枪鱼 螺旋蝇 蚕蛾 鸡，火鸡 猪牛羊 人，猩猩 人与一些动物细胞色素C 一级结构氨基酸差异的数量比较

80 5、一级结构差别很大的蛋白质可能有相似的空间结构【举例】磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶
磷酸丙糖异构酶 丙酮酸激酶 (triose phosphate isomerase) (pyruvate kinase)

81 二、蛋白质的功能依赖特定空间结构 体内蛋白质所具有的特殊的生理功能都与其所具有的特定的空间构象有密切关系的。 例如：角蛋白(keratin)
丝心蛋白(fibroin)

82 （一）肌红蛋白的空间结构与功能的关系 肌红蛋白（myoglobin, Mb）是由153个氨基酸残基组成的单一多肽链的蛋白质，含8个螺旋（A、B、C、D、E、F、G、H），其辅基为血红素(heme)。

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84 血红素结构与氧结合模示图 血红素(heme)是4个吡咯环通过4个甲炔桥相连形成的平板状铁卟啉化合物，2价铁离子居于卟啉环的中央。铁离子有6个配位键，其中4个配位键与4个吡咯环的N原子相连接，1个与F8（-螺旋F中第8个残基）组氨酸（93）相结合，氧分子则与第6个配位键相结合，并与E7组氨酸（64）相接近。血红素未结合氧时，Fe偏离卟啉平面约0.06nm，偏向-螺旋F8组氨酸侧，当结合氧后，Fe被拉入卟啉环中，这样带动F8发生位移，进而引发一系列构象改变。

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86 肌红蛋白与血红蛋白的氧解离曲线 肌红蛋白(myoglubin)的氧饱和曲线为距形双曲线,血氧饱和度为20%时仍能带氧,肌肉
缺氧时(氧饱和度为5%)大量释放氧,以供肌肉收缩需要;血红蛋白的氧饱和曲线 为S形曲线,表明血红蛋白四个亚基对氧的结合具有正协同效应(positive cooperativity)。

87 （二）血红蛋白(hemoglubin)空间结构与功能的关系
成人血红蛋白由2个亚基与2个亚基组成的四聚体（ 22 ）， 每个亚基含1个血红素分子。血红蛋白每1个亚基可结合1个氧分子。 氧分子与血红蛋白的结合具有正协同效应(positive cooperativity)。 紧张态（T态）：铁原子偏离卟啉平面约0.06nm,偏向F8 His侧， 11与22呈双重对称排布， 对氧的亲和力低。 松弛态（R态）：铁原子被氧分子拉入卟啉环中， 牵动作用Hb亚基三维结构发生改变，亚基间 盐键断裂，亚基间结合疏松， 11与22 之间移位15°， 对氧的亲和力高。

88 血红蛋白T态与R态 血红蛋白4个亚基的排布是1/1和22呈双重对称排布。紧张态（T态）Hb对氧 的亲和力低。当血红蛋白结合氧时，由于铁离子的位移带动-螺旋F做相应的移 动，进而引发亚基间的盐键断裂，使亚基间的结合松弛，1/1和22之间移位 15；松弛态（R态）的Hb亚基对氧的亲和力高，容易与氧结合。 15° 1 1 2 2 + O2 – O2 T态 R态

89 2 1 2 1 脱氧血红蛋白各亚基内和各亚基间的盐键
血红蛋白四个亚基(subunit)之间和亚基内共有8个盐键(ionic bond)。在血红蛋白结合氧时，由于亚基的变构和亚基间的协同效应，亚基间的盐键一一断开，使血红蛋白由T态构象(T Structure)转变为R态构象(R Structure)。

90 Hb氧合与脱氧的构象转换 (interconversion of conformations)：

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93 血红蛋白的构象变化与结合氧 Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。

94 肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线

95 协同效应(cooperativity) 一个寡聚体(oligomer)蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应 (positive cooperativity) 如果是抑制作用则称为负协同效应 (negative cooperativity)

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97 变构效应(allosteric effect)
蛋白质分子的特定部位（调节部位regulator site）与小分子化合物（效应物）结合后，引起空间构象发生改变，从而促使生物学活性(biological activity)变化的现象称为变构效应。包括正协同、负协同效应

98 （三）蛋白质构象改变与疾病 蛋白质构象病(protein conformation disease)：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生，此类疾病称为蛋白质构象病。 这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病（Huntington disease）、疯牛病等。

99 例如：疯牛病(BSE)中的蛋白质构象改变
蛋白质构象改变导致疾病的机理： 有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。 例如：疯牛病(BSE)中的蛋白质构象改变

100 疯牛病中的蛋白质构象改变 疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。
朊病毒蛋白（prion protein, PrP）是正常存在于人体神经原、神经胶质细胞等多种细胞的细胞膜上的糖蛋白(glycoprotein)。（由诺奖得主S.Prusiner发现命名的） 朊病毒（prion,PrPsc）是正常朊病毒蛋白（PrPc）的空间构象由螺旋变成折叠所致。朊病毒本身不能自我复制（不含核酸），但可以攻击大脑的正常朊病毒蛋白，使之构象改变并与其结合，形成朊病毒二聚体(dipolymer)。此二聚体现再攻击正常朊病毒蛋白，形成朊病毒四聚体(tetramer)。周而复始，脑组织中朊病毒不断积蓄，造成脑组织发生退行性病变。

101 正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。
PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。 PrPc α-螺旋 PrPsc β-折叠 正常 疯牛病

102 正常朊病毒蛋白结构 （显示-螺旋） 朊病毒结构 （显示-片层结构）

103 第四节 蛋白质的理化性质与分离纯化 The Physical and Chemical Characters and Separation and Purification of Protein

104 一、蛋白质的两性电离(ionization)
1.可解离基团 : α-COOH 、非α-COOH（Asp 、Glu) 、α-NH2 、 非α-NH2 (Lys) 、咪唑基 ( His) 、 -SH (Cys) 、胍基 (Arg) 2.等电点： 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 。

105 二、蛋白质的胶体性质(colloidal property)
蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒(colloidal particle)范围之内。 * 蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷 水化膜(hydration shell)

106 溶液中蛋白质的沉淀(蛋白质未变性) 水化膜 － + + － 带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质 带负电荷的蛋白质 酸 碱 酸 碱 脱水作用
不稳定的蛋白质颗粒 酸 碱 溶液中蛋白质的沉淀(蛋白质未变性)

107 三、蛋白质的变性、沉淀和凝固 蛋白质的变性(denaturation):在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。 变性的本质:破坏非共价键(non covalent bond)和二硫键(disulfide bond)，不改变蛋白质的一级结构(primary structure)。

108 造成变性的因素 (1)物理因素(physical factors)： 加热、X射线、紫外线 、超声波、剧烈搅拌等。 (2)化学因素(chemical factors)： 强酸、强碱、尿素、乙醇、重金属离子、三氯醋酸等。 应用举例 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。

109 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) 。
但是许多蛋白质变性后，空间结构严重被破坏，不能复原，这样的蛋白质变性称为不可逆变性(irreversible degeneration)。

110 天然状态，有催化活性 尿素、 β-巯基乙醇 去除尿素、 非折叠状态，无活性

111 * 蛋白质沉淀(protein precipitation)
在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。 变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 * 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。

112 变性 沉淀 凝固 变性不一定沉淀 沉淀不一定变性 凝固均变性并不溶解 改变pH至pI 物理因素：加热、紫外线照射、超声、剧烈震荡等
化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等 沉淀 改变pH至pI 破坏水溶液中蛋白质 的水化膜和中和电荷 （变性蛋白质） （蛋白质未变性） 凝固 加热 （变性，不再溶解） 变性不一定沉淀 沉淀不一定变性 凝固均变性并不溶解

113 四、蛋白质的紫外吸收(Ultraviolet absorption)
280nm 四、蛋白质的紫外吸收(Ultraviolet absorption) 由于蛋白质分子中含有共轭双键的Tyr和Trp，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定(quantitative assay)。

114 ⒈茚三酮反应(ninhydrin reaction)
五、蛋白质的呈色反应 ⒈茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。 ⒉双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。

115 茚三酮反应

116 3、酚试剂呈色反应（Lowry test）：
除蛋白质分子中肽键与碱性Cu2+发生双缩脲反应外，蛋白质分子中的色氨酸与酪氨酸残基还将试剂中的磷钨酸和磷钼酸盐还原生成蓝色化合物（钼蓝） 4.染料结合法（Bradford法） 蛋白质与考马斯亮蓝G-250反应亮蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。在一定蛋白质浓度范围内，吸收强度与蛋白质含量之间线性关系。

117 The Separation, Purification and Structure Analysis of Protein
第五节 蛋白质的分离纯化与结构分析 The Separation, Purification and Structure Analysis of Protein

118 一、蛋白质的分离(separation)和纯化(purification)
蛋白质的理化性质与常用的纯化方法

119 蛋白质粗制品分离的一般步骤: 1.材料的预处理及细胞破碎 材料必须新鲜，蛋白质含量高。 ①机械破碎法 高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
①机械破碎法 高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 ②渗透破碎法 利用低渗条件使细胞溶胀而破碎。 ③反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。 对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 ④超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 ⑤酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。

120 2、蛋白质的抽提(extraction):
抽提：把生物物质从生物组织中以溶解状态释放出来。 根据所要制备的蛋白质的性质，可选择合适的溶剂将蛋白质与其他杂质分开。 抽提液= 离子强度调节剂 + pH缓冲剂 + 温度效应剂 + 蛋白酶抑制剂 + 抗氧化剂 + 重金属络合剂或重金属 + 增溶剂 膜蛋白的抽提:加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100等)膜结构破坏蛋白质与膜分离。 在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等以防止蛋白质的变性。

121 ①等电点沉淀法：盐浓度要尽量低。 ②盐析法：分级盐析，常用硫酸铵（溶解度大，受温度影响小）。
3.蛋白质粗制品的获得: ①等电点沉淀法：盐浓度要尽量低。 ②盐析法：分级盐析，常用硫酸铵（溶解度大，受温度影响小）。 ③有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，可与水混溶，能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低；有机溶剂本身的水合作用会破坏蛋白质表面的水化层。 　注意：易变性，宜低温下进行。

122 蛋白质常用的纯化方法： （一）透析及超滤法 透析(dialysis)： 1.利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法称为透析。
2.透析袋：用具有超小微孔的膜如硝酸纤维素膜制成，微孔仅允许分子量小于10kD的化合物通过。

123 磁力搅拌器 透析前 透析后 透析袋 透析

124 ·超滤法(ultrafiltration)：
磁力搅拌器 待超滤的蛋白质溶液 加压的氮气 超滤膜 ·超滤法(ultrafiltration)： 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。

125 （二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 *使用丙酮沉淀(acetone precipitation)时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。此外，也可用乙醇沉淀。 *盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。

126 * 免疫沉淀法(immunoprecipitation assay)：将某一纯化蛋白质免疫动物,可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白(antigenic protein)，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。

127 （三）电泳 蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳(film electrophoresis)、凝胶电泳(gel electrophoresis)等。

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129 （四）层析 层析(chromatography)分离蛋白质的原理
待分离蛋白质溶液（流动相 mobile phase）经过一个固态物质（固定相 stationary phase）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力(affinity)等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。

130 蛋白质分离常用的层析方法 * 离子交换层析(ion-exchange chromatography)：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 * 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。

131 目 录

132 目 录

133 （五）超速离心 * 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。
*蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。

134 因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。
根据转速分类：常用离心机 < rpm 高速离心机 ~ rpm 超速离心机 > rpm

135 蛋白质纯度的鉴别标准 可通过电泳或层析的方法鉴定蛋白质纯度 纯度是相对的。 1.在不同pH条件下电泳，蛋白质呈现一条分离带。
2.等电聚焦电泳，蛋白质呈现一条分离带。 3.纯化后，蛋白质应保留活性。 4.在超速离心场中，蛋白质以单一的沉降速度运动。

136 测定多肽链的N端与C端氨基酸残基(Dansyl-氯法,羧肽酶法)
二、多肽链中氨基酸序列分析 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的N端与C端氨基酸残基(Dansyl-氯法,羧肽酶法) 把肽链水解成片段 (胰蛋白酶法,胰凝乳蛋白酶法,溴化氰法) 测定各肽段的氨基酸排列顺序(Edman降解法) 一般需用数种水解法(hydrolysis)，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。

137 (一)分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 (二)末端分析
蛋白质经盐酸水解后成为个别氨基酸，用离子交换树脂将各种氨基酸分开，测定他们的量，计算出各氨基酸在蛋白质中的百分组成或者个数。 (二)末端分析 1. N-末端测定 (1)2,4-二硝基氟苯（FDNB）法 (2)丹磺酰氯（DNS）法 优点：DNS试剂是荧光试剂，灵敏度高100倍。

138 2. C-末端测定: 羧肽酶法(carboxy-peptidase)
作用于除Arg，Lys，Pro和Hyp外的所有氨基酸（ C端倒数第二个是Pro时除外）。 羧肽酶B: 作用于Lys和Arg（C端倒数第二个是Pro时除外）。

139 （三）肽链的拆分 1.非共价键肽链拆分: 蛋白质变性剂(denaturant)。 2.二硫键的拆分
(1)还原法(reduction method): 巯基化合物还原成巯基，再用碘乙酸乙酰化保护。 (2)氧化法(oxidation method)： 过甲酸（HCOOOH）

140 （四）肽链的部分水解和肽段的分离 1.溴化氰（CNBr）裂解法 : 专一水解Met的羧基端

141 2.胰蛋白酶（Trypsin）水解法: 3.胰凝乳蛋白酶法水解法: 水解芳香族氨基酸（Phe, Tyr, Trp）

142 （五）肽段的氨基酸排列顺序的测定 以Edman降解法为基础的氨基酸人工或自动测序 异硫氰酸苯酯 苯氨基硫甲酰基肽 苯乙内酰 硫脲丙氨酸

143 通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列 分离编码蛋白质的基因 测定DNA序列 排列出mRNA序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列

144 三、蛋白质空间结构测定 * 二级结构(secondary structure)测定
通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 -螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198 nm处的正峰三个成分；而-折叠的CD谱不很固定。

145 * 三级结构(tertiary structure)测定
X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance, NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。

146 根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构
* 用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。 * 通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。 1、同源建模，2、折叠识别，3、从无到有

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148 　　　　　本章要求 1、名词：isoelectric point；motifs；domain; subunit；allosteric effect; protein denaturation; molecular disease；proteomics 2、结构层次 元素组成：C、H、O、N（16%）、S 结构单位：20种L-α氨基酸（芳香族、含硫、酸性、碱性氨基酸等） 一级结构：肽键；多肽链；N端C端 二级结构：稳定力（氢键）；类型（螺旋，折叠，转角，无规卷曲） 三级结构特点、四级结构特点 3、重要性质：两性解离及带电状态判定；紫外吸收；沉淀；变性 4、分离纯化：透析、超滤；盐析；电泳；亲和层析；离子交换层析；分子筛层析 5、结构与功能关系（举例）