膜片钳技术简介 辜冬香 20132501102.

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1 膜片钳技术简介 辜冬香

2 膜片钳技术 1991 Nobel基金会的颁奖评语： 膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化，它和基因克隆技术并驾齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。

3 膜片钳技术 膜电钳技术 一种以记录离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的(或多个的)离子通道分子活动的技术，被奉为研究离子通道的“金标准”。

4 膜片钳技术 · 1976年，德国生理学家Neher和Sakmann在完成电极与膜之间50MΩ的封接后，首次记录到去神经蛙肌纤维膜上的乙酰胆碱激活的单通道电流，首次建立膜片钳技术。 1976年以前，关于离子通道的研究都是通过电压钳记录整个细胞的电信号间接进行的。由于细胞膜上离子通道数量相当大，这样由电压钳方法测得的结果就是大量通道的总和效应。为了获得单离子通道的精确信息必须提高细胞膜电流的空间分辨率，即减小测量膜电流的膜面积以分辨单通道电流。

5 膜片钳技术 · 1980年，Sigworth等在记录电极内施加负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接(Giga-seal)，大大降低了记录时的噪声，实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。 · 1981年，Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，使其电流测量的灵敏度达到1pA、时间和空间分辨率分别达到10μs和1μm。 · 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。

6 膜片钳技术 Erwin Neher Bert Sakmann
合作发明了膜片钳技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜上存在离子通道。被授予1991年诺贝尔医学或生理学奖。

7 膜片钳技术 基本原理 利用负反馈电子线路,将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上,对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察,从而研究其功能。

8 膜片钳系统 机械部分：防震工作台、屏蔽罩、仪器设备架 光学部分：倒置显微镜、视频监视器等
电子部件：膜片钳放大器、数据采集和分析软件、计算机和微操纵器

9 膜片钳系统 膜片钳放大器是整个实验系 统中的核心，它可用来作单通道或 全细胞记录，其工作模式可以是电 压钳，也可以是电流钳。细胞级别
的单通道电流为pA级别，属于极其 微弱的电信号，对干扰极其敏感。 膜电钳放大器的作用就是将细胞中的极其微弱的电生理信号进行放大处理，变为可视化信号。

10 膜片钳系统 倒置显微镜 倒置显微镜是膜片钳实验系统的主要光学部件，它不仅具有较好的视觉效果，便于将玻璃电极与细胞的顶部接触，而且是借助移动物镜来实现聚焦，具有较好的机械稳定性。 玻璃微电极 玻璃微电极是将玻璃毛细管用电极拉制仪经两次拉制，直径约1um,并在电极前端涂以硅酮树脂（sylgard)进行抛光处理，使电极变得光滑，且将尖端的杂质烧去，得到较干净的表面，从而有利于和细胞膜紧密封接，并在分解后更易保持稳定。

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12 外面向外模式 优点：细胞外液容易更换，常用于配体门控离子通道。
在全细胞模式上将微管电极向上提起，得到切割分离的膜片，断端游离部分自行融合成脂质双层，此时高阻封接仍然存在，而膜外侧接触浴槽液。 优点：细胞外液容易更换，常用于配体门控离子通道。 不足：难以改变胞内成分。 且为获得该记录模式，细胞一般需要贴附（紧密或轻附）在记录浴槽底部，因为漂浮的细胞很难将膜片撕下。

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14 外面向外模式 模式 特点 应用 细胞吸附膜片(cell-attached patch mode)
1、优点是不破坏细胞的完整性， 内环境保持正常。 2、缺点是不能人为直接地控制细胞内环境条件，不能确切判明细胞内电位。 1、研究正常或异常离子环境中递质与电压激活的离子通道活动。 2、研究细胞膜不同部位的电流差异及不同功能状态下离子通道活动的变化。 全细胞记录式(Whole-cell recording) 1、全细胞记录反映的是整个细胞膜上所有离子通道电活动的总和。 2、优点在于，能保持细胞及其反应性的完整性。 3、不足之处是由于电极与细胞间交换快，细胞内环境很容易破坏。 1、研究多种离子通道的变化对细胞功能的影响。 研究细胞内环境变化对离子通道的影响。 3、研究通道活动的电生理特性及通道活性的受体和第二信使的调节。 4、研究生理、病理机制及药物作用机制，从而指导新药开发等。 内面向外膜片(inside-out patch) 1、可直接且自由地经浴液介导而调控细胞内液的条件。 2、由于胞质渗漏，可能丢失某种通道调控因子，离子通道活动出现run-down （或run-up）现象。 1、研究胞浆成分对离子通道的影响。 2、研究细胞内激素及第二信使对通道的调节作用。 3、研究细胞内钙依赖的离子通道，如钙敏感钾通道。 外面向外膜片(outside-out patch) 1、因细胞外液容易更换，故加药方便。 2、缺陷是实验中难以改变胞内成分。且为获得该记录模式，细胞一般需要贴附（紧密或轻附）在记录浴槽底部，因为漂浮的细胞很难将膜片撕下。 1、多用于研究细胞膜外侧受体控制的化学依赖式离子通道。 2、研究由膜的特异受体蛋白质、G蛋白和膜的效应器酶组成的跨膜信号传递系统对离子通道型受体功能的调节。 外面向外模式

15 膜电钳技术的应用 可分辨单通道电流，直接观察通道开启和关闭的全过程。通过测得的单通道特征参数可鉴别通道类型，同时可验证和研究通道的开关动力学模型。 膜片钳的空间分辨率高，在中枢神经系统中可分离细胞体与轴突和树突的电流，在周围神经系统中可深入了解受体的分布区域，绘制细胞表面的特定离子通道的分布图。

16 膜电钳技术的应用 单通道记录可以解释某些药物的作用机制，以研究特定药物对电压和递质依赖通道的影响。如徐龙河等采用全细胞膜片钳技术，比较局部麻醉药罗哌卡因和布比卡因对大鼠背根神经节(DRG)中河豚毒素敏感TTX-S和不敏感TTX-R钠通道的阻滞作用，探讨罗哌卡因感觉运动分离的机理。 。

17 膜电钳技术的应用 大鼠背根神经节 DRG 罗哌卡因 布比卡因 河豚毒素敏感钠通道 TTX-S 河豚毒素不敏感钠通道 TTX-R
全细胞膜片钳记录钠电流 结论：罗哌卡因优先阻滞TTX-R钠通道，罗哌卡因对TTX-R钠通道和TTX-S钠通道的选择性阻滞是其硬膜外麻醉时感觉运动分离的原因之一。

18 膜电钳技术的应用 “内面向外”和“外面向外”膜片记录允许任意改变膜片内外溶液成分，分别研究单一组分对通道特征的影响，避免了其他成分的干扰。而全膜片记录可用来研究常规电压钳无法研究的小型细胞，在控制细胞内一定离子浓度的同时监测整个细胞膜的电活动。 膜片钳技术还可用于研究第二信使的作用。如对于胰腺泡细胞，在电极内无Ach，电极外有Ach时也可以激活通道，提示有第二信使的作用。

19 参考文献 [1]NEHER E, SAKMANN B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres[J]. Nature, 1976, 260(5554): [2]林燕飞，欧阳守．膜片钳技术研究进展及其应用[J]．海峡药学，2008（09）：8-11． [3]万影，潘传芳，周专．生物膜通道检测的新技术—膜片钳[J]．生物学杂志，1991（03）：1-3+43． [4]陈军．膜片钳实验技术系列讲座[J]．神经解剖学杂志，1994（04）： ． [5]徐龙河，姜雨鸽，张宏．罗哌卡因和布比卡因对大鼠背根神经节钠通道阻滞作用的比较[J]．中国临床药理学与治疗学，2006（05）： ．