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(Molecular Luminescence Analysis)
第五章 分子发光分析 (Molecular Luminescence Analysis)
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荧 光 分 析 法 磷 光 分 析 化 学 发 光 分 析 法
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分子发光：处于基态的分子吸收能量(电、热、化学和光能等)被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。发光分析 包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等。 物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光。 一、概述 分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。 第一节 荧光分析法
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荧光分析的特点： 灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.10.001g/mL之间。可见比UV-Vis的灵敏度高得多。 选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。 应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多。
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二、基本原理 (一) 分子荧光的产生 处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。这种跃迁是符合光谱选律的，如果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。单重态与三重态的区别在于电子自旋方向不同，激发三重态具有较低能级。 在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁性，其激发态的平均寿命大约为10-8s; 而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s以上(通常用S和T分别表示单重态和三重态)。
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图5.1 分子内的光物理过程 三重态能级低于单重态(Hund规则) 激发单重态：分子吸收能 量，电子自旋仍然配对， 为单重态，称为激发单
基态：电子自旋配对， 多重度=2s+1=1，为单 重态，以S0表示。 激发单重态：分子吸收能 量，电子自旋仍然配对， 为单重态，称为激发单 重态，以S1，S2…表示 激发三重态：分子吸收能 量，电子自旋不再配对， 为三重态，称为激发三 重态，以T1，T2….表示。 三重态能级低于单重态(Hund规则) 图5.1 分子内的光物理过程
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（二） 去活化过程(Deactivation) 处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程返回至基态。这些过程包括：
处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态。辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫( VR)、内部转移(IR)、系间窜跃(IX)及外部转移(EC)等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。 （二） 去活化过程(Deactivation) 处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程返回至基态。这些过程包括：
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1)振动弛豫(Vibrational Relaxation, VR)
在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振动能层失活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。 2)内转化( Internal Conversion，IC ) 对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。
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3)荧光发射 处于第一激发单重态中的电子跃 迁至基态各振动能级时，将得到最大波长为λ3的荧光。注意：基态中也有振动驰豫跃迁。很明显，λ3的波长较激发波长λ1或λ2都长，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长为λ3的荧光。荧光的产生在 s内完成。
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4)系间窜跃 指不同多重态间的无辐射跃迁，例如S1→T1就是一种系间窜跃。通常，发生系间窜跃时，电子由S1的较低振动能级转移至T1的较高振动能级处。有时，通过热激发，有可能发生T1→S1，然后由S1发生荧光。这是产生延迟荧光的机理。 5)外转换(External Conversion，EC) 受激分子与溶剂或其它溶质分子相互作用发生能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭”或“猝灭”。
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（三 ）荧光效率及其影响因素 荧光量子产率也叫荧光效率或量子效率，它表示物质发射荧光的能力，通常用下式表示 或 = 发射荧光量子数 / 吸收荧光量子数 在产生荧光的过程中，涉及到许多辐射和无辐射跃迁过程，如荧光发射、内转移、系间窜跃和外转移等。很明显，荧光的量子产率，将与上述每一个过程的速率常数有关。
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若用数学式来表达这些关系，得到 = kf /(kf+ki) 式中: kf为荧光发射过程的速率常数，ki为其它有关过程的速率常数的总和。 凡是能使kf 值升高而使其它ki值降低的因素，都可增强荧光。 实际上，对于高荧光分子，例如荧光素，其量子产率在某些情况下接近1，说明ki很小，可以忽略不计。一般来说，kf主要取决于化学结构，而ki则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。磷光的量子产率与此类似。
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分子产生荧光必须具备两个条件： ① 分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构, 才能吸收激发光； ② 吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有 一定的荧光量子产率。
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三 荧光与有机化合物的结构 (1)跃迁类型 对于大多数荧光物质，首先经历，然后经过振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生跃迁而得到荧光。跃迁常能发出较强的荧光(较大的量子产率)。这是由于跃迁具有较大的摩尔吸光系数(一般比n大 倍)。 其次，跃迁的寿命约为10-7—10-9s，比n跃迁的寿命10-5—10-7s要短。在各种跃迁过程的竞争中，它是有利于发射荧光的。此外，在跃迁过程中，通过系间窜跃至三重态的速率常数也较小(S1T1能级差较大)，这也有利于荧光的发射。
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总之，跃迁是产生荧光的主要跃迁类型。
(2)共轭效应 容易实现激发 的芳香族化合物容易发生荧光，能发生荧光的脂肪族和脂环族化合物极少(仅少数高度共轭体系化合物除外)。此外，增加体系的共轭度，荧光效率一般也将增大。例如： 在多烯结构中，Ph(CH=CH)3 Ph和Ph(CH=CH)2 Ph在苯中的荧光效率分别为0.68和0.28。 共轭效应使荧光增强的原因 ：增大荧光物质的摩尔吸收系数,有利于产生更多的激发态分子,从而有利用荧光的发生。
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(3)刚性平面结构 多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性。 (4)取代基效应 芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。给电子基团，如-OH、-OR、-CN、-NH2 、 -NR2等，使荧光增强。因为产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。
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吸电子基团，如-COOH、-NO、-C O、卤素等，会减弱甚至会猝灭荧光。
（5）重原子效应 卤素取代基随原子序数的增加而荧光降低。这可能是由所谓“重原子效应”使系间窜跃速率增加所致。在重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，因此容易发生自旋轨道的相互作用，增加了由单重态转化为三重态的概率。 取代基的空间障碍对荧光也有影响。 立体异构现象对荧光强度有显著的影响。
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四 、金属螯合物的荧光 除过渡元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不产生荧光。但是，在某些情况下，金属螯合物却能产生很强的荧光，并可用于痕量金属元素分析。 (1)螯合物中配位体的发光 不少有机化合物虽然具有共轭双键，但由于不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些化合物和金属离子形成螯合物，随着分子的刚性增强，平面结构的增大，常会发生荧光。
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如8-羟基喹啉本身有很弱的荧光，但其金属螯合物具有很强的荧光。
(2)螯合物中金属离子的特征荧光 这类发光过程通常是螯合物首先通过配位体的跃迁激发，接着配位体把能量转给金属离子，导致dd*跃迁和ff*跃迁，最终发射的是dd*跃迁和ff*跃迁光谱。
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五 影响荧光强度的因素 ① 溶剂对荧光强度的影响 增大溶剂的极性，跃迁的能量减小，而导致荧光增强，荧光峰红移。但也有相反的情况，例如，苯胺、萘磺酸类化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇中，随着醇的极性增大，荧光强度减小，荧光峰蓝移。因此荧光光谱的位置和强度与溶剂极性之间的关系，应根据荧光物质与溶剂的不同而异。 如果溶剂和荧光物质形成了化合物，或溶剂使荧光物质的状态改变，则荧光峰位和强度都会发生较大的变化。
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② 温度对荧光强度的影响 温度上升使荧光强度下降。其中一个原因是分子的内部能量转化作用。当激发分子接受额外热能时，有可能使激发能转换为基态的振动能量，随后迅速振动弛豫而丧失振动能量。另一个原因是碰撞频率增加，使外转换的去活几率增加。 ③ 溶液pH值对荧光强度的影响 带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光与溶液的pH有关。 具有酸性或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构 可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧光物质，因pH值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。
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④顺磁性物质的存在,使激发单重态的体系间窜越速率增大,因而会使荧光效率降低。
六、溶液荧光猝灭 荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。 导致荧光猝灭的主要类型： ① 碰撞猝灭 碰撞猝灭是指处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方式回到基态，产生猝灭作用。
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② 静态猝灭(组成化合物的猝灭) 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液吸收光谱的改变。 ③ 转入三重态的猝灭 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三重态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们在与其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭效应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的荧光物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子和三重态的荧光物质分子，使荧光猝灭。
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④ 发生电子转移反应的猝灭 某些猝灭剂分子与荧光物质分子相互作用时，发生了电子转移反应，因而引起荧光猝灭。 ⑤ 荧光物质的自猝灭 在浓度较高的荧光物质溶液中，单重激发态的分子在发生荧光之前和未激发的荧光物质分子碰撞而引起的自猝灭。有些荧光物质分子在溶液浓度较高时会形成二聚体或多聚体，使它们的吸收光谱发生变化，也引起溶液荧光强度的降低或消失。
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是浓度在临界浓度以上的表面活性剂，如十二
七 胶束增敏荧光 是浓度在临界浓度以上的表面活性剂，如十二 烷基硫酸钠的化合物能增稳、增敏、增溶的作用。
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(三)溶液的荧光强度 1. 荧光强度与溶液浓度的关系 荧光强度If正比于吸收的光量Ia与荧光量子产率 。 If = Ia 式中为荧光量子效率，又根据Beer定律 Ia = I0 - It = I0(1- e -A) I0和It分别是入射光强度和透射光强度。代入上式得 If = I0( A) = I0(1- e -2.3A)
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整理得： If =2.3 I0 bc 当入射光强度I0 和I一定时，上式为： If = K c 即荧光强度与荧光物质的浓度成正比，但这种线性关系只有在极稀的溶液中，当A0.05时才成立。对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。
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(四)荧光激发光谱与发射光谱 1)激发光谱 改变激发波长，测量在最强荧(磷)光发射波长处的强度变化，以激发波长对荧光强度作图可得到激发光谱。
任何荧(磷)光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱。它们是荧(磷)光定性分析的基础。 1)激发光谱 改变激发波长，测量在最强荧(磷)光发射波长处的强度变化，以激发波长对荧光强度作图可得到激发光谱。 激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！这是因为分子吸收光能的过程就是分子的激发过程。
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激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择最适宜的激发波长。
2)发射光谱 发射光谱即荧光光谱。一定波长和强度的激发波长辐照荧光物质，产生不同波长和强度的荧光，以荧光强度对其波长作图可得荧光发射光谱。 由于不同物质具有不同的特征发射峰，因而使用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质。
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图5.2 荧光发射光谱
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3)激发光谱与发射光谱的关系 a 波长比较 与激发(或吸收)波长相比，荧光发射波长更长，即产生所谓Stokes位移。(振动弛豫失活所致) b 形状比较 荧光光谱形状与激发波长无关。尽管分子受激可到达不同能级的激发态，但由于去活化(内转换和振动弛豫)到第一电子激发态的速率或几率很大，好像是分子受激只到达第一激发态一样。 换句话说，不管激发波长如何，电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。
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c 镜像对称 通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系。 图5.3 荧光光谱与吸收光谱关系图
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由于激发态和基态的振动能层分布具有相似性，因而呈镜像对称。
解释2： 位能曲线(Frank-Condon原理) 由于电子吸收跃迁速率极快(10-15s)，此时核的相对位置可视为不变(核较重)。当两个能层间吸收跃迁的几率越大，其相反跃迁的几率也越大，即产生的光谱呈镜像对称。
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三、荧光仪器(光源与检测器处于相互垂直的位置)
第一单色器 或滤光片 记录仪 第二单色器 荧光 光源 激发 样品池 图5.6 荧光分析仪器示意图 1)光源： 氙灯、高压汞灯、激光； 2)样品池：石英(低荧光材料)； 3)两个单色器：选择激发光单色器,分离荧光单色器； 4)检测器：光电倍增管。
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四 荧光分析法的应用 荧光测定必须在极稀的溶液中才可用于定量测定。 标准曲线法测定荧光物质的含量
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四 荧光分析法的应用 (一)无机化合物的分析
大多数无机离子与溶剂之间的相互作用很强,其激发态多以非辐射跃迁方式返回基态,发荧光者甚少。然而很多无机离子可以与一些有机化合物形成有荧光的络合物,利用这一性质可对其进行荧光测定。能够同金属离子形成荧光络合物的有机试剂绝大多数是芳香族化合物,通常含有两个或两个以上的官能团,能与金属离子形成五元环或六元环的螯合物。由于螯合物的生成,分子的刚性平面结构增大,使原来不发荧光或荧光较弱的化合物转变为强荧光化合物。
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(二)有机化合物的分析 脂肪族有机化合物的分子结构较为简单,本身能发生荧光的很少,一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析,如丙三醇与苯胺在浓硫酸介质中反应生成发射蓝色荧光的喹啉，据此可以测定0.1~2µg•mL⁻¹的丙三醇。 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系,多数能发生荧光,可直接用荧光法测定。
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第二节 磷光分析 一、概述 磷光分析法是以分子磷光光谱来鉴别有机化合物和进行定量分析的一种方法。 磷光分析法在药物分析,临床分析等领域的应用日益发展。 1. 磷光的特点： ① 磷光波长比荧光的长(T1<S1)； ② 磷光寿命比荧光的长(磷光为禁阻跃迁产生，速率常数小)； ③ 磷光寿命和强度对重原子和氧敏感(自旋轨道耦合，使kISC增加)。
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1.磷光是处于激发三重态的分子跃迁返回基态时所产生的辐射。
二、 基本原理 (一) 磷光的产生和磷光强度 1.磷光是处于激发三重态的分子跃迁返回基态时所产生的辐射。 2.磷光强度: IP=2.3PI0kbc 式中IP为磷光强度， P为磷光效率， I₀ 为激发光的强度，K为磷光物质的摩尔吸收系数 ， b为试样池的光程，C 为磷光物质的浓度。
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① EPA——乙醇+异戊烷+二乙醚(2+2+5)
在一定的条件下，p、Ip 、k、b 均为常数，因此上式可写成： Ip=Kc (二) 温度对磷光强度的影响 1. 随着温度降低,分子热运动速率减慢,磷光逐渐增强。 2. 低温磷光(液氮) 由于磷光寿命长，T1的非辐射跃迁(内转换)几率增加，碰撞失活(振动弛豫)的几率、光化学反应几率都增加，从而降低磷光强度。因此有必要在低温下测量磷光。同时要求溶剂： ①易提纯且在分析波长区无强吸收和发射； ②低温下形成具有足够粘度的透明的刚性玻璃体。 常用的溶剂： ① EPA——乙醇+异戊烷+二乙醚(2+2+5) ② IEPA——CH3I+EPA(1+10)。
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(三)重原子效应 使用含有重原子的溶剂(碘乙烷、溴乙烷)或在磷光物质中引入重原子取代基,都可以提高磷光物质的磷光强度,这种效应称为重原子效应。前者称为外部重原子效应,后者称为内部重原子效应。 机理:重原子的高核电荷使得磷光分子的电子能级交错,容易引起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用,从而使S1→T1的体系间窜跃概率增大,有利于增大磷光效率。
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(四) 室温磷光 低温磷光需低温实验装置且受到溶剂选择的限制，1974年后发展了室温磷光(RTP)。 1)固体基质：在室温下以固体基质(如纤维素等)吸附磷光体，可增加分子刚性、减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。 2)胶束增稳：利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性。 利用胶束增稳、重原子效应和溶液除氧是该法的三要素。
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(五) 敏化磷光：其过程可以简单表示为： (六)磷光发射 从单重态到三重态分子间发生系间跨跃跃迁后，再经振动弛豫回到三重态最低振动能层，最后，在 s内跃迁到基态的各振动能层所产生的辐射。
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在荧光仪样品池上增加磷光配件：低温杜瓦瓶和斩光片。如右图所示。
三 磷光仪器 在荧光仪样品池上增加磷光配件：低温杜瓦瓶和斩光片。如右图所示。 斩光片的作用是利用其分子受激所产生的荧光与磷光的寿命不同获取磷光辐射。 转盘式 转筒式 图5.7 磷光分析仪器示意图
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第三节 化学发光分析法 一、概述 某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光。这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。利用化学发光反应而建立起来的分析方法称为化学发光分析法。化学发光也发生于生命体系，这种发光称为生物发光。 二、化学发光分析的基本原理 化学发光是吸收化学反应过程产生的化学能，而使反应产物分子激发所发射的光。任何一个化学发光
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反应都应包括化学激发和发光两个步骤，必须满足如下条件：
(1)化学反应必须提供足够的激发能，激发能主要来源于反应焓。 (2)要有有利的化学反应历程，使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态。 (3)激发态能释放光子或能够转移它的能量给另一个分子，而使该分子激发，然后以辐射光子的形式回到 基态。 (二)化学发光效率和发光强度 化学发光反应效率CL，又称化学发光的总量子产率。它决定于生成激发态产物分子的化学激发效率ce和激发态分子的发射效率em。定义为：
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cl =发射光子的分子数 / 参加反应的分子数 = ceem
化学反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由参加反应物质的化学反应所决定。每个化学发光反应都有其特征的化学发光光谱及不同的化学发光效率。 化学发光反应的发光强度Icl以单位时间内发射的光子数表示。它与化学发光反应的速率有关，而反应速率又与反应分子浓度有关。即 Icl (t)= cl dc/dt=Kc
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式中 Icl(t)表示t时刻的化学发光强度，是与分析物有关的化学发光效率dc/dt是分析物参加反应的速率。
（三）化学发光反应类型 1. 直接化学发光和间接化学发光 直接发光是被测物作为反应物直接参加化学发光反应，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子。 A + B C* + D C* C + h 式中A或B是被测物，通过反应生成电子激发态产物C* ，当C* 跃迁回基态时，辐射光子。
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间接发光是被测物A或B，通过化学反应生成初始激发态产物C* ， C* 不直接发光，而是将其能量转移给F，使F跃迁回基态，产生发光。
A + B C* + D C*+F F* + E F* F + h 式中C*为能量给予体，而F为能量接受体 2. 气相化学发光和液相化学发光 按反应体系的状态分类，如化学发光反应在气相中进行称为气相化学发光；在液相或固相中进行称为液相或固相化学发光；在两个不同相中进行则称为异相化学发光。
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(1)气相化学发光 主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等。 臭氧与乙烯的化学发光反应； 一氧化氮与臭氧的化学发光反应。 (2)液相化学发光 用于此类化学发光分析的发光物质有鲁米诺、光泽碱、洛粉碱等。例如，利用发光物质鲁米诺，可测定痕量的H2O2以及Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce等金属离子。
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三、化学发光的测量装置 化学发光分析法的测量仪器主要包括 样品室、光检测器、放大器和信号输出装置。 化学发光反应在样品室中进行，样品和试剂混合的方式有不连续取样体系，加样是间歇的。将试剂先加到光电倍增管前面的反应池内，然后用进样器加入分析物。另一种方法是连续流动体系，反应试剂和分析物是定时在样品池中汇合反应，且在载流推动下向前移动，被检测的光信号只是整个发光动力学曲线的一部分，而以峰高进行定量测量。
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(一)分立取样式仪器 (二)流动注射式仪器 四 化学发光分析的应用 1.广泛应用于大气中O3、NO、NO2、H2O、SO2、CO等组分的检测。 2.鲁米诺—H2O2体系
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考研真题 1.分子荧光光谱中，发射光谱与激发波长的关系 ，激发光谱极大的方法形状________,
并互为___________。（北师大2002年） 2.物质分子在吸收光辐射后产生磷光，经历内部转换， 和 三个过程。 （南开大学2002年） 3.分子荧光与化学发光均为第一激发态的最低振 动能级跃迁至基态中各振动能级产生的光辐射， 它们的主要区别在于（ ）
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A 分子的电子层不同 B无辐射弛豫的途径不同
C产生的光辐射的能源不同 D 跃迁至基态中的振动能级不同 （南开大学2002年） 4.下列那种化合物的荧光量子产率可能最大：（ ） (A) (B) (C) (D) （郑州大学2002年）
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5.用能级图的形式表示分子荧光、分子磷光产生
的历程。 （南开大学2003年）
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