食品中致病菌的初筛鉴定 和污染源的追溯 ------ 分子生物学技术在食品 检验中的应用 张志坤 2009.3.10.

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1 食品中致病菌的初筛鉴定 和污染源的追溯 分子生物学技术在食品 检验中的应用 张志坤

2 大纲 一.概述 二.致病菌的初筛及鉴定系统 三.致病菌污染源的追溯系统 (一).目前食品安检中致病菌常规的检测方法
(二).常规检测方法的优缺点 (三).食品微生物检测的发展趋势 (四).分子生物学理论基础 (五).分子生物学检测技术---PCR技术和Real-Time PCR技术详解 (六).分子生物学检测技术---生物芯片技术（探针技术）简介 (七).分子生物学检测技术的优缺点 (八).分子生物学鉴定技术简介 三.致病菌污染源的追溯系统 (一).概述 (二).目前常用的污染源追溯方法---PFGE电泳方法简介 (三).DuPont公司RiboPrinter® System简介

3 一.概述 食品微生物检测 常规微生物检测 致病微生物检测 常规微生物项目：细菌总数、大肠菌群、大肠杆菌、酵母总数、霉菌总数，此
类细菌不致病，但会严重影响食品的外观及风味。目前常用 微生物培养法来计数菌落，允许有该类菌落，但菌落总数不 能超标。 致病微生物项目：沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157： H7、弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞 菌等。致病微生物在食品中是绝对不允许存在的，所以快速 检测食品中是否存在有致病微生物，是食品安全检验的重中 之重。下面我们重点来谈一下致病菌的检验方法。

4 一.概述 食品中致病微生物的检测 为什么要进行污染源的追溯? 致病微生物检测 致病微生物检出及鉴定 污染源的追溯
1.可以搞清楚致病菌污染的源头,进而分析出污染爆发的原因; 2.可以更为有效地消除污染源,杜绝污染的再次爆发; 3.在食品生产的各个环节可以有效地进行质控.

5 二.初筛及鉴定 常规检测步骤： (一).目前食品安检中致病菌常规的检测方法 收集样品 无选择性富集细菌（4-8小时）
1.平板培养纯化细菌，根 据菌落形态，生理生化 特征等检测。 2.免疫检测 选择性的富集增菌（18-24小时） 收集样品 富集细菌 选择增菌 培养检测 免疫检测

6 二.初筛及鉴定 (一).目前食品安检中致病菌常规的检测方法 1.生物梅里埃选择性培养基平板法 （1）.chromID™ 阪崎肠杆菌显色平板
2种显色底物用来显示2种阪崎肠杆菌的特异性酶活性：α-D-吡喃葡萄糖苷酶glucopyranosidase and β-D-纤维二糖酶,并可以检测低活性的α-D吡喃葡萄糖苷酶菌株。抗生素用来抑制大多数革兰氏阳性菌、酵母菌和一些革兰氏阴性菌的生长 24小时培养后获得典型的菌落（蓝灰色到蓝黑色），48小时培养后出现特有的菌落形态。因此可以在48小时一次判读结果。 35-37°C和 41.5°C培养均通过评估，通过评估可在mLST＋新生霉素或EE肉汤增菌培养后使用 (FDA/CFSAN:2002) （2）. chromID 沙门菌显色平板 特异性: 3种显色底物能更好地选择性分离和区分 包括伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌和绝大多数乳糖阳性地沙门氏菌在内的沙门氏菌。 营养成份: 在强选择性成分作用下，沙门氏菌经过 37° C 18-24小时培养形成较大、边缘不规则、显色明显的菌落。 选择性: 强选择性确保抑制污染食物的其它菌落如：革兰阳性球菌、酵母菌和大部分非发酵革兰阴性细菌。

7 二.初筛及鉴定 (一).目前食品安检中致病菌常规的检测方法 2.生物梅里埃免疫检测法---VIDAS系统 VIDAS 金葡菌肠毒素
葡菌肠毒素是引起食物中毒的常见原因。 7种不同的血清型可被鉴定。这些毒素蛋白最初仅由金黄色 葡萄球菌产生，但目前有报道中间型葡萄球菌和猪葡萄球菌也能产生毒素。尽管葡萄球菌可通过加热 破坏，但这些毒素是热稳定性的，可在高温下存活。 生物梅里埃采用尖端科技的ELFA技术，运用能更好的捕获抗原的新抗体 工作。移去粘附在酶结合抗体上的Fc片断，明显增强了试剂盒的性能。 移去Fc片断减少了可能产生潜在错误信号干扰的食物成份和非特异性结 合的其它细菌，提高了特异性。释放2个小的Fab’片断优化了抗体的位置， 更好地结合抗原，提高了敏感性.VIDAS SET2是一个由包含成品试剂和SPR （固项容器）管组成的单剂量试剂。 VIDAS全自动仪器进行整个检测步骤并打印结果：阳性或阴性 检测食品中的葡萄球菌毒素 检测时间: 80 分钟 整个检测周期: 少于1天

8 二.初筛及鉴定 (二).常规检测方法的优缺点 1.常规检测方法的优点 (1).直观 2.常规检测方法的缺点 (1).周期长
由于常规检测方法是用微生物的培养法来进行的，所以此类方法很直观，经过一定时间的培养后，进行菌落形态和细菌形态及细菌生理生化的鉴定，有没有一目了然，非常直观。 (2).经济 由于常规方法不需要特殊的试剂，显色培养基和普通染色镜检即可完成检验和鉴定，所以成本低廉。 2.常规检测方法的缺点 (1).周期长 由于常规检测用的是微生物的培养法，需要不断的选择性培养纯化，再加上生理生化的鉴定，周期非常长（一周左右）。 (2).不能准确鉴定变种致病菌 打个比方，常规的鉴定方法就像鉴定一个人一样，先看人群的形态（物以类聚，人以群分，类似于菌落形态），再看此人穿什么样的衣服（类似于有无鞭毛和荚膜），接下来看此人的外貌（有无特殊的标志，类似于细菌的形态学观察），最后看此人的习惯（类似于细菌的生理生化特点，遇染色培养基变色等）。但是细菌的变异率是非常高的，遇见变异的致病菌和未知的致病菌，我们往往会束手无策，常常会得出是是而非的结论。

9 二.初筛及鉴定 (三).食品微生物检测的发展趋势 1.准确
这是任何一种检测方法的基本要求，其他有点要在此基础上建立。对于变异的致病菌和未知的细菌 也要能准确无误的做出鉴定。 2.快速灵敏高效，操作简便 在准确的基础上，能够快速得出检测的结果，以减轻仓储和物流的压力，达到快速出货加快产品流 通的目的。 3.能有效的避免样品检测中带来的交叉污染 在微生物的检测中，样品间的交叉污染是个让人十分头疼的问题，好的检测方法应该能有效的避免 交叉污染的发生。 4.经济 检测成本不能太高，尽量减少企业的检验成本。 5.和国际标准接轨 随着我国加入世贸组织，国内企业越来越多的产品走向了世界，但其他国家为了保护本国企业的利 益，往往会在检验标准上设置贸易壁垒，所以这就要求我们的检验标准和国际检验标准接轨，这样才能 顺利的把我们的产品销往国外。 （以上是本人自己总结的几点，希望各位同仁能够不断添加。）

10 二.初筛及鉴定 (四).分子生物学理论基础 1.分子生物学检测技术是基于基因水平的检验技术。 2.首先让我们来认识一下基因、DNA和核酸。
基因决定着生物的种类和性状。大千世界，各种生物千姿百态，这一切皆源于各种生物所携带基因的 差异。随着科技的不断发展，人们认识物种的水平已经从形态及生理生化水平进入到了基因水平。举个 例子来说，门，纲，目，科，属，种，亚种，人类都是属于同一个种---人种，人种又可分为黄，白， 黑，棕等亚种；就拿黄种人来说吧，不同的生物，其基因也是不同的，这就是DNA鉴定的理论基础。 在致病菌的检验上，我们同样可以用DNA---这个基因的载体来进行检验和鉴定。 2.首先让我们来认识一下基因、DNA和核酸。 基因是一段核酸序列，用来编码特定的氨基酸序列，和指导蛋白质合成及加工，从而使生物体具有 特殊的性状。核酸经水解可得到很多核苷酸，因此核苷酸是核酸的基本单位。核酸就是由很多单核苷酸 聚合形成的多聚核苷酸。核苷酸可被水解产生核苷和磷酸，核苷还可再进一步水解，产生戊糖和含氮碱 基。核苷酸中的碱基均为含氮杂环化合物，它们分别属于嘌呤衍生物和嘧啶衍生物。核苷酸中的嘌呤碱 (purine)主要是鸟嘌呤(guanine,G)和腺嘌呤(adenine,A)；嘧啶碱(pyrimidine)主要是胞嘧啶 (cytosine,C)、尿嘧啶(uracil,U)和胸腺嘧啶(thymine,T)。DNA和RNA都含有鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)和 胞嘧啶(C)；胸腺嘧啶(T)一般而言只存在于DNA中，不存在于RNA中；而尿嘧啶(U)只存在于RNA中，不存 在于DNA中。 脱氧核糖核酸（DNA）,其戊糖环为脱氧戊糖 核酸 核糖核酸 （RNA）,戊糖环为非脱氧戊糖

11 二.初筛及鉴定 (四).分子生物学理论基础 细胞结构图

12 二.初筛及鉴定 (四). 分子生物学理论基础 2.首先让我们来认识一下基因、DNA和核酸。
核酸 核苷+磷酸 戊糖+磷酸+碱基，其分子式如下图： 水解 水解

13 二.初筛及鉴定 (四).分子生物学理论基础 2.首先让我们来认识一下基因、DNA和核酸 核酸的性质：
结构。碱基之间的连接是有严格的配对原则的即:A-T;G-C。如下图：

14 二.初筛及鉴定 (四).分子生物学理论基础 2.首先让我们来认识一下基因、DNA和核酸 核酸的性质：
结构。碱基之间的连接是有严格的配对原则的即:A-T;G-C。如下图：

15 二.初筛及鉴定 (四).分子生物学理论基础 2.首先让我们来认识一下基因、DNA和核酸 核酸的性质：
2.核酸的变性，复性和杂交 DNA双链之间以氢键连接，氢键是一种次级键，能量较低，易受破坏，在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链，即为DNA变性。DNA变性只涉及二级结构改变，不伴随一级共价键的断裂。DNA的变性从开始到解链完全，是在一个相当窄的温度内完成的，在这一范围内，紫外光吸收值增加达到最大增加值的50％时的温度叫做DNA的解链温度（Tm）。一种DNA分子的 Tm值的大小与其所含碱基中的 G＋C的比例相关也与DNA分子大小及变性条件有关，G+C的比例越高，DNA分子越长，溶液离子强度越高，Tm值越大。④加热、低盐及强酸、强碱均可使DNA变性。 2.复性 变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，这种现象称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程也叫退火，一般认为，比Tm值低 25℃ 的温度是DNA复性的最佳条件。 3.DNA复性的实际应用——杂交：通过变性DNA的复性性质，我们可知道，DNA单链之间、RNA单链之间、一条DNA和一条RNA链之间只要存在序列互补配对区域，不管是整条链互补，还是部分序列互补，即可重新形成整条双链或部分双链，这即为核酸分子杂交，这在分子生物学研究中有极大的应用，比如：可用于在基因组中对特异基因的定位及检测，PCR技术扩增目的基因等，很多分子生物学实验技术应用的都是核酸分子杂交的原理，如Southern Blot, Northern Blot,这个性质也是PCR的理论基础。

16 二.初筛及鉴定 (四).分子生物学理论基础 2.首先让我们来认识一下基因、DNA和核酸 核酸的性质： 变性 复性 杂交
2.核酸的变性，复性和杂交 变性 复性 杂交

17 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术PCR技术详解 1.PCR概论
聚合酶链锁反应，Polymerase chain reaction，简称PCR，PCR这项技术是由凯利·穆利斯(Kary Mullis)发明，并因此在七年之后，1993年10月，获得了诺贝尔化学奖该项殊荣。穆利斯的想法是，利用一种人工方法，和反覆相同程序的方法，并利用一种特殊的酶——即DNA聚合酶来扩增特定的DNA片段。 DNA聚合酶天然存在于生物体内，在细胞分裂前进行DNA的复制。当DNA开始复制时，解旋酶将双股的DNA分开成两个单股。DNA聚合酶便结合在两DNA单股链上，生成互补链。在穆利斯最初的PCR反应中，将DNA聚合酶用于体外试验。双链DNA被加热到96℃，使得双链分离成为两条单链。但是在这个温度下，DNA聚合酶被破坏，因此在每个循环的加热步骤后必须补充新的聚合酶。穆利斯的原始PCR反应效率极低，需要大量时间和DNA聚合酶，并且在整个PCR反应中都需要人来照看。 后来，由嗜热细菌水生栖热菌(Thermus aquaticus)体内产生的DNA聚合酶改善了这种低效的PCR反应。由于嗜热细菌生活在温度超过110℃的间歇泉中，它的DNA聚合酶具有耐热性。在用于PCR反应时，高温并不能破坏这种DNA聚合酶，因此不需要不断加入新的聚合酶，PCR反应由此变得简单并且可以由机器操作。 最初的具有耐热性的DNA聚合酶来自于水生栖热菌(Thermus aquaticus)，因此被称为Taq。Taq酶被广泛用于当前的PCR操作中。Taq酶的缺点是它缺少3'->5'校正外切酶活性，因此在复制DNA时有时会出错，造成DNA序列突变(错误)。从古菌中获得的Pwo酶及Pfu酶均有校正机制，能够大大降低PCR反应中的突变。将Taq与Pfu结合使用可以保证真实准确得扩增DNA。

18 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术PCR技术详解 2.操作过程
PCR用于扩增一小段已知的DNA片断，可能是单个基因，或者仅仅是某个基因的一部分。与活体生物 不同的是，PCR只能复制很短的DNA片断，通常不超过10kbp。DNA是双链分子，因此用互补DNA双链的构造单位(核苷酸)来度量其大小，单位为碱基对（base pair, bp）。某些特定的方法可以扩增40kbp左右的片断，但是这种大小与真核细胞的染色体DNA相比仍然是很少的。例如，人的体细胞DNA含有大约30亿个碱基对。 目前应用的PCR反应需要几个基本组成： （1）.DNA模板（template），含有需要扩增的DNA片断。 （2）.2个引物（primer），决定了需要扩增的起始和终止位置。（见下面引物一节） （3）.DNA聚合酶（polymerase），复制需要扩增的区域。 （4）.脱氧单核苷酸（dNTP），用于构造新的互补链。 （5）.缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。 PCR反应在热循环设备中进行。PCR仪可以将反应管加热或冷却到每步反应所需的精确的温度。为防止反应体系中液体蒸发，通常在反应管上加盖加热的盖子，或者在反应体系表面加入一层石蜡油。

19 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术PCR技术详解 3.操作步骤 一般的PCR反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下4个步骤：
(1).利用高温(93-98℃)使双链DNA分离(熔解)。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之 前，通常加热长一些时间以确保模板和引物完全分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分 钟。 (2).在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上(降温或称接合)。此阶段的温度通 常低于引子熔点5℃。错误的黏合温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间 1-2分钟。新技术的融合型核酸聚合酶在此阶段的温度会高于熔点3~5℃，仅需时间5~10秒。 (3).最后，DNA聚合酶由降温时结合上的引子开始沿着DNA链合成互补链(延长)。此阶段的温度依赖 于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片断长度。传统的Taq估计合成 1000bp大概需要1分钟、较新的Tbr(来自于嗜热菌Thermus brockianus)约40秒、融合型聚合酶 仅约15秒。 (4).琼脂糖电泳检测PCR产物,主要是片段大小。

20 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术PCR技术详解 4.图解 PCR简图 96℃高温下使双股DNA打开
(3) 在72℃ DNA延长 (P=聚合酶). (4) 第一循环完成，做出的两段双股DNA又可当作下一个循环模板，这样每次循环都使得扩增的DNA片段加倍。 (5).经过20-40轮的PCR反应，目的基因被放大了上百万倍。 PCR简图

21 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术PCR技术详解 5.动画演示

22 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术PCR技术详解 6.电泳检测PCR产物 琼脂糖凝胶电泳 经过20-35轮的扩增后，特异的目
的基因（代表该微生物）被放大 了近百万倍，将PCR所得的产物进 行凝胶电泳，根据标准DNA分子量 Marker进行比对，得出PCR扩增有 没有得到目的基因，进而推断出 待检物中有没有该基因（该微生物）。 琼脂糖凝胶电泳

23 完美的引物对于任何一家定量PCR公司来说都是至高无上的机密！
二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术PCR技术详解 7.PCR特异性扩增的关键---引物 任何一个生物体，总是有不同于其他同类的地方（更何况是和不同的物种比了），这也就是我之所以是我的原因，造成这一切的差异皆源于基因的差异。所以我们只要能找出每个生物的特异基因的话，也就能够在基因层面上实现对该生物的确认了。换句话说，只要能检出这段特异基因就能等于我们检验到了这个生物。这就像只要能找出二七纪念塔就等于找到了郑州一样。 然而这一切都要依靠引物的寻找！ 完美的引物 特异性的基因 该生物的确认 完美的引物对于任何一家定量PCR公司来说都是至高无上的机密！

24 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术PCR技术详解 8.PCR技术的应用领域 1.微生物的检验 2.传染病的诊断(肝炎病毒)
3.法医学(亲子鉴定)上的应用 4.遗传性疾病的基因诊断 5.癌基因检测 6.DNA测序 7.基因克隆 8.引入基因点突变,基因融合等

25 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术PCR技术详解 9.普通PCR技术检验的优缺点 (1).准确
每种致病菌的引物和特异基因都是该试剂公司经过长期研究和并反复试验准确无误的，尤其是拿到了国际或国家检验标准认证的公司。 (2).快速高效 PCR检验不需要选择性增菌，只需简单富集一下，即可进行PCR检验。一次可检测96—384个样品（大型PCR检测的样品还可以更多）。一般24小时之内出结果。 (3).容易造成样品间的交叉污染 由于普通PCR的检验是在一个开放的系统中进行的，所以容易形成样品间的交叉污染。现在国家已经明令禁止在医院检验系统采用普通PCR检验。 实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）的出现有效地解决了上述的问题，并成为了现在医院检测传染性疾病（肝炎，性病，细菌感染）的首先。在食品微生物安检领域，美国DuPont公司研发的BAX系统已获AOAC的认证，并被多个国家所采纳，2007年7月9日被我国作为官方标准用于食品的检验，北京奥运会期间作为被用于奥运会食品安检。

26 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术Real-Time PCR技术详解 1.Real-Time PCR 概论
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程， 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增和检测同时进行，最终结果不需进行电泳检测，所以有效地避免了样品间的交叉污染。 常 规 PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无 法对扩增反应实时检测。 实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化， 通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析

27 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术Real-Time PCR技术详解 2.定量PCR常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、Ct值
(1).扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动记录荧光强 度的变化 每个循环进行一次荧光信号的收集

28 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术Real-Time PCR技术详解 2.定量PCR常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、Ct值
(2).荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动 设置的原则要大于样本的荧光背景值 和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归 系数大于0.99。 (3).CT值： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

29 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术Real-Time PCR技术详解 (1).非特异性荧光标记： SYBR Green
(2).特异性荧光标记： TaqMan探针 Molecular Beacon分子信标

30 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术Real-Time PCR技术详解 4.非特异性荧光染料---SYBR Green的特性
(1).SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 (2).SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 (3).变性时，DNA双链分开，无荧光 (4).复性和延伸时，形成双链DNA,SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。 SYBR Green SYBR Green

31 二.初筛及鉴定 SG (五).分子生物学检测技术Real-Time PCR技术详解 5’ 3’ SG 5’ 3’ Emission
4.非特异性荧光染料---SYBR Green的工作原理图解 5’ 3’ SG No Emission Excitation SG 5’ 3’ Emission Excitation 伴随着每轮PCR的进行，特异的基因片段不断积累，SYBR Green不断的与新增加的基因片段结合而发出荧光，荧光信号不断积累，荧光定量PCR仪实时记录了荧光信号的变化。

32 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术Real-Time PCR技术详解 5.非特异性荧光染料SYBR Green的优缺点 优点：
(1).对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA (2).使用方便-----不必设计复杂探针 (3).非常灵敏 (4).便宜 缺点： (1).容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线 的分析，优化反应条件 (2).对引物特异性要求较高

33 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术Real-Time PCR技术详解 与目标序列互补 6. TaqMan---水解型杂交探针
(1).5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 (2).3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) (3).探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分 开，发荧光 (4).Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针

34 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术Real-Time PCR技术详解 6. TaqMan---水解型杂交探针工作原理
每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光

35 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术Real-Time PCR技术详解 7.探针法的优缺点 (1).极高的特异性和准确性
由于探针法除了引物序列的特异性之外，还有探针序列的特异性，从 两个方面保证了所 扩增基因的特异性。 (2).良好的重复性 (3).目前价格昂贵，进口的更贵。 但是目前市售荧光定量PCR试剂盒采用的都是TaqMan探针法。如国内 的达安公司，匹基公司，申友公司，太太公司，实业科华，杭州博日，杭州艾康等，探针法的技术已经相当成熟。

36 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术Real-Time PCR技术详解 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应：
X=X0* (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率

37 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术Real-Time PCR技术详解 8.荧光定量PCR的数学原理 在扩增产物达到阈值线时:
XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量

38 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术Real-Time PCR技术详解 8.荧光定量PCR的数学原理
模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量

39 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术Real-Time PCR技术详解 8.荧光定量PCR的数学原理 确定未知样品的 C(t)值
Sample 25 确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量

40 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术Real-Time PCR技术详解 9.DuPont公司BAX系统
---国际上唯一一家被AOAC认证的Real-Time PCR食品微生物检测系统

41 杜邦Qualicon 上世纪90年代中页，从杜邦中心研发实验室发展出来 Outgrowth of DuPont CR&D
业务遍布美洲，欧洲和亚太地区的很多国家 Presence in the Americas, Europe and Asia-Pacific

42 BAX® system is used worldwide.
Approvals Certifications USDA-APHIS NPIP Brazil MAPA People’s Republic of China AQSIQ Health Canada Danish Veterinary and Food Administration Russian Rospotrebnadzor Japanese Ministry of Health, Labour and Welfare AOAC International AOAC Research Institute AFNOR NordVal USDA-FSIS Adoption

43 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术Real-Time PCR技术详解 DuPont Qualicon在中国
1.2008年7月9日被我国作为官方 标准用于食品的检验。 2.北京奥运会期间作为被用于奥 运会食品安检。

44 二.初筛及鉴定 (五).分子生物学检测技术Real-Time PCR技术详解 10. Real-Time PCR在食品检测中的优缺点
(1).准确 荧光定量PCR检测技术是基于基因水平上的检测，毋庸置疑，其特异性和准确性是目前所有检测方法中最高的。 (2).快速高效 荧光定量PCR检测不需要选择性增菌，只需简单富集一下，即可进行PCR检验。一次可检测96—384个样品（大型PCR检测的样品还可以更多），使用复合引物的话，一次可检测好几种致病菌，一般24小时之内出结果。 (3).在目前食品致病菌的所有检测方法种，荧光定量PCR检测技术最为先 进。 (4).完全封闭的检测系统，有效杜绝了样品的交叉污染。 (5).容易和国际检测标准接轨。 (6).所用试剂和仪器价格昂贵。

45 二.初筛及鉴定 (六).分子生物学检测技术基因芯片(探针)技术简介 1.概述
基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列 (DNA或RNA)。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。 基因芯片(gene chip)的原型是80年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。 基因探针 固相支持物 流程略图

46 二.初筛及鉴定 (六).分子生物学检测技术基因芯片(探针)技术简介 2.制备步骤 (1).探针的制备
选取某种致病菌的特性基因序列，PCR扩增该序列，将得到的PCR产物经纯化后，点于固相支持物（尼龙膜、玻璃片等）上，制成基因探针。 (2).将细菌选择性增菌后，提取细菌的总DNA，以此总DNA为模板，以（1）中该致病菌的特性基因序列的引物为引物，以经过化学发光基团标记的单核甘酸（如dATP﹡）为dNTP,进行PCR，将得到的PCR产物与探针进行杂交（变性，复性）。 (3).洗脱 将没有杂交上的DNA片段洗脱掉 (4).检验，用扫描仪检验。有化学发光则为阳性，没有化学发光则为阴性。

47 二.初筛及鉴定 分子生物学检测技术是基于基因水平上的检测，毋庸置疑，其特异性和准确性是 (2).快速灵敏高效
(七).分子生物学检测技术的优缺点 (1).准确 分子生物学检测技术是基于基因水平上的检测，毋庸置疑，其特异性和准确性是 目前所有检测方法中最高的。 (2).快速灵敏高效 分子生物学检测技术检验致病菌一般不需要选择性增菌，只需简单富集一下，即可 进行PCR检验。一次可检测96—384个样品（大型PCR检测的样品还可以更多），使用复 合引物的话，一次可检测好几种致病菌，一般24小时之内出结果。 (3).在目前食品致病菌的所有检测方法种，分子生物学检测技术最为先 进。 (4).容易和国际检测标准接轨。 (5).所用试剂和仪器价格昂贵。

48 二.初筛及鉴定 (八).分子生物学鉴定技术简介 1.16SrRNA基因序列鉴定法
rRNA分子在生物体中普遍存在，生物细胞rRNA分子的一级结构中既具有保守的片段，又具有变化的碱基序列。在生物进化的漫长过程中,rRNA分子保持相对恒定的生物学功能和保守的碱基排列顺序,同时也存在着与进化过程相一致的突变率,在结构上可分为保守区和可变区, 保守的片段反应了生物物种间的亲缘关系，而高变片段则能表明物种间的差异，那些保守的或高变的特征性核苷酸序列则是不同分类级别生物（如科、属、种）鉴定的分子基础。研究rRNA基因序列可以发现各物种间的系统发生关系。细菌rRNA按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23SrRNA。其中位于原核细胞核糖体小亚基上的16SrRNA长约1540bp,结构和碱基排列复杂度适中,较易于进行序列测定和分析比较。16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成。因此可用PCR扩增其相应的rDNA片断，来快速、灵敏地检测样品中是否存在某些细菌或致病菌，或进行细菌多样性分析，尤其是那些人工无法培养的微生物。 rRNA分子结构

49 二.初筛及鉴定 (八).分子生物学鉴定技术简介 2.16SrRNA基因序列鉴定法操作步骤
1.分离出两种不同的菌种。（亦可使用选择性培养基，如PEA plate或MCA plate）； 2.分离出两种不同的菌落后，分別接种至新的TSA plate上，直到平板上的菌落为单一菌种为止； 3.提取单一菌落的细菌，进行DNA的提取，分光光度计法及琼脂糖凝胶电泳测定DNA的质量完整性和得 率； 4.以16SrRNA的通用引物为引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物； 5.切取对应的PCR条带，回收并纯化PCR产物； 6.PCR产物直接测序，以16SrRNA的通用引物为引物； 7.将测序所得的序列在GeneBank中进行Blast分析以确定该细菌所属的类别。 此方法适于突发性未知菌或变异菌污染的紧急检测鉴定，而常规手段无法鉴定该细菌的种类，只有从基因水平来鉴定该细菌的种类。从细菌的分离纯化到富集到检测鉴定出结果，周期为2天左右，整个费用RMB200.00左右。

50 三.污染源的追溯 (一).概述 1.首先我们了解一下什么是致病菌污染源的追溯? 2.为什么要进行污染源的追溯?
致病菌污染源的追溯就是在食品中检出有致病菌时,对原辅料及各个生产加工环节 中存在的致病菌进行分离、纯化、分型,并最终查找出导致终产品污染的源头和原因的 过程. 2.为什么要进行污染源的追溯? 1.可以搞清楚致病菌污染的源头,进而分析出污染爆发的原因; 2.可以更为有效地消除污染源,杜绝污染的再次爆发; 3.在食品生产的各个环节可以有效地进行质控.

51 三.污染源的追溯 (一).概述 3.污染源追溯的过程 4.必须对致病菌进行亚型分析才能更为准确地找出污染源头 就是进行致病菌的亚型分析.
终产品致病菌的分离与纯化与分型 原辅料及生产环节存在的致病菌的分离纯化与分型 终产品中致病菌各亚型与中间环节致病菌各亚型的比对 找出污染的源头和原因 4.必须对致病菌进行亚型分析才能更为准确地找出污染源头 每一种致病菌都可分为各种不同的亚型,这就像人可以分为黄种人白种人和黑种人一 样,只有更为精细的分型才能更为有效的进行污染源的追溯.所以污染源的追溯主要 就是进行致病菌的亚型分析.

52 三.污染源的追溯 (二).目前常用的致病菌污染源追溯方法 1.致病菌的免疫学分型法
以生物梅里埃为代表.用致病菌的不同亚型免疫动物以产生不同的抗体,再用 这些不同的抗体来鉴定致病菌不同的亚型.优点是速度快,但极易出现假阴性,尤其 是致病菌产生变异或其毒力基因表达和遗传成分不稳定时.目前已经很少被用来作 为致病菌污染源追溯了. 2.致病菌的表型分型法 Biolog公司为代表，用致病菌不同亚型细微的形态差别和生理生化特性的不 同进行分型分析，优点是速度快，但极易出现假阳性和假阴性，而且分型时常常会 遇到似是而非的情况。目前基本不被用来做为致病菌的污染源追溯。

53 三.污染源的追溯 (二).目前常用的致病菌污染源追溯方法 3. PFGE电泳方法简介
脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)是一种非常有效的分子分型技 术,基本原理是通过电场的不断改变，使包埋在琼脂糖凝胶中的DNA分子的泳动方向做相应改变， 小的DNA分子比大的变化快，故小分子泳动得快，从而在凝胶上按染色体大小而呈现出电泳带 型。DNA带的密度在一定程度上反映了细菌内DNA的含量以及DNA分子的大小，最终达到分型的目 的。PFGE常用于基因组DNA的分析，是目前分子流行病学调查最经典的方法，已成功用于众多微 生物的遗传性分析，被世界上许多实验室作为菌株基因分型的参考方法，是迄今最常用的亚分类 方法。 优点：PFGE具有重复性好、分辨率高、结果稳定、易于标准化的优点，能在细 菌基因组很庞大的情况下，尽可能反映较多的变异信息。 缺点：但是也存在一定的缺点，比如耗时；电泳带型易受人为等多种因素的影响；并不是对 所有情况都适合；不能同时优化胶的每个部分的条带分布；不能确切地认为相同大小 的条带就是相同的DNA片段；不同条带之间并不是无关的、相互独立的，而是互相联 系的；一个酶切位点的变化可能引起不止一个条带的变化；结果不易分析，没有国际 统一标准，不易于在实验室之间进行比较，且仪器价格昂贵。

54 三.污染源的追溯 (二).目前常用的致病菌污染源追溯方法 3. PFGE电泳方法简介 PFGE电泳系统

55 三.污染源的追溯 (二).目前常用的致病菌污染源追溯方法 3. PFGE电泳方法简介

56 三.污染源的追溯 (三).DuPont公司RiboPrinter® System简介
目前全球唯一的可用于致病菌污染源追溯的全自动细菌基因分型的系统.整套系统基于细菌核糖体基因分型设计,使用EcoRI限制性酶切rRNA 操纵子产生的不同的基因片段,然后凝胶电泳,对电泳结果进行分析.整套系统高度自动化,只需检测人员培养分离纯化致病菌,然后上样,上样后所有操作由系统完成,结果分析也由系统给出,从而避免了人为操作和认为判读带来的误差. DuPont公司RiboPrinter® System

57 三.污染源的追溯 (三).DuPont公司RiboPrinter® System简介

58 三.污染源的追溯 (三).DuPont公司RiboPrinter® System简介 Production QA/QC 生产质控
Research & Development 研发 Product Development Clinical Trial Support 临床试验支持 ...the essential tool Assess efficacy of sanitation programs 评估卫生设施的有效性 Track Sources of Contamination 追踪污染源 Read slide Expedite accurate decision-making 迅速准确的决策 Ensure culture integrity 确保培养的完整性 Definitive genetics-based Identifications 确定的基于基因的鉴定方法

59 谢谢！