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Extension of UV / Vis Spectrophotometry
紫外-可见分光光度法的扩展 Extension of UV / Vis Spectrophotometry
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紫外-可见分光光度法 Ⅰ 定性分析
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(一)定性鉴别 (二)纯度检查 1 对比吸收光谱特征数据 如max及(E) 2 对比吸收度(或吸收系数)的比值
Ⅰ定性分析 (一)定性鉴别 1 对比吸收光谱特征数据 如max及(E) 2 对比吸收度(或吸收系数)的比值 如 A1/A2(或E1/E2) 3 对比吸收光谱的一致性 (二)纯度检查 1 杂质检查 如乙醇或环己烷中少量苯 2 杂质限量检查 如肾上腺素中肾上腺酮等
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max E E (361nm) E (278nm) E (361nm) E (550nm) 1% 1cm
Ⅰ定性分析 max E 1cm 1% 安宫黄体酮 240±1nm 炔诺酮 ±1nm E (361nm) 1cm 1% VB12 = E (278nm) 1cm 1% E (361nm) 1cm 1% = E (550nm) 1cm 1%
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Ⅰ定性分析 A 否定性鉴别！！！
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Ⅰ定性分析 红外光谱法是肯定性鉴别方法，那么，作为否定性鉴别方法的紫外光谱法，是否在定性分析中用处不大呢？ No!!!
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UV/Vis IR Ⅰ定性分析 Absorbance Wavelength (nm) Transmittance
Wavenumber (cm-1)
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Ⅰ定性分析 糯米、梗米、油、水、糖、豆沙… … 糯米、梗米、油、水、酱油、蛋黄… … 糯米、梗米、油、水、酱油、肉… … A
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正交多项式基本图形 0() 1() 2() + - + - + - 3() 4() 5() + - + - + -
Ⅰ定性分析 0() 1() 2() + - + - + - 3() 4() 5() + - + - + - 正交多项式基本图形
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. . . . . . .
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图、安钠咖 注射液（含苯 甲酸钠和咖啡因 二个组分）通过变 换得到的褶合光谱群
Convolution spectra of caffeine, these figure shows 164 convolution curves of 2-30 points
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200 220 240 260 280 300 5 10 15 20 25 30 -0.45 -0.4 -0.35 -0.3 -0.25 -0.2 -0.15 -0.1 -0.05 0.05 数 学 显 微 镜 Q1 of caffeine Nj wavelength Qij
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Ⅰ定性分析 褶合光谱法定性分析功能 (一)定性鉴别 (二)纯度（杂质限量）检查 (三)稳定性试验
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Ⅰ定性分析 Amax Amin 丙酸倍氯米松-倍他米松紫外光谱图
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丙酸倍氯米松-倍他米松褶合光谱差谱图 λ (差谱比率55.70%) Ⅰ定性分析 Q j=1 j=2 j=3
n= n= n=4-30 λ 丙酸倍氯米松-倍他米松褶合光谱差谱图 (差谱比率55.70%)
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Ⅰ定性分析 R 倍他米松-地塞米松结构图
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Ⅰ定性分析 Amax Amin 倍他米松-地塞米松紫外光谱图
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倍他米松-地塞米松褶合光谱差谱图 λ (差谱比率13.36%) Ⅰ定性分析 Q j=1 j=2 j=3
n= n= n=4-30 λ 倍他米松-地塞米松褶合光谱差谱图 (差谱比率13.36%)
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紫外-可见分光光度法 Ⅱ 定量分析
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(三)含量测定（定量灵敏度10-610-7g/ml）
Ⅱ定量分析 (三)含量测定（定量灵敏度10-610-7g/ml） 1 单组分定量 (1)吸收系数法(绝对法) c=A/El (2)标准曲线法 标准溶液 c1,c2,c3,c4,c5 测定吸收度值 A1,A2,A3,A4,A5 测定样品 AX cX (3)对照法 同条件配制 c标,c样 同条件测定 A标,A样 c样= c标A样 / A标
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Ⅱ定量分析 2 多组分定量 两组分光谱互不重叠 A b 2 1 a 寻找1,2互不干扰，作单组分处理
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寻找1,2，一处不干扰，另一处用A=A1+A2加和处理
Ⅱ定量分析 两组分光谱部分重叠 A b 2 a 1 寻找1,2，一处不干扰，另一处用A=A1+A2加和处理
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两组分光谱完全重叠 (1)解线性方程组法 A1a+b=A1a+A1b=E1aCa+E1bCb
Ⅱ定量分析 两组分光谱完全重叠 A b 2 a 1 A1a+b=A1a+A1b=E1aCa+E1bCb A2a+b=A2a+A2b=E2aCa+E2bCb (1)解线性方程组法
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(2)双波长分光光度法 a.等吸收双波长消去法 Aa+b=A2a+b-A1a+b =A2a+A2b-A1a-A1b
Ⅱ定量分析 (2)双波长分光光度法 a.等吸收双波长消去法 A Aa+b=A2a+b-A1a+b =A2a+A2b-A1a-A1b =A2b-A1b=(E2b-E1b)Cb A a b 1 2
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b.系数倍率法 Ax+y= kA2x+y-A1x+y= k(A2x+A2y)-A1x-A1y
Ⅱ定量分析 b.系数倍率法 A y x Ax+y= kA2x+y-A1x+y= k(A2x+A2y)-A1x-A1y =kA2x-A1x=(kE2x-E1x)Cx . kA2 A1 A2 1 2
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导数光谱法：可以给出更多信息，提高分辨能力，能鉴别分子结构细微差别。 特点：p157 零阶光谱 A=ECl
Ⅱ定量分析 导数光谱法：可以给出更多信息，提高分辨能力，能鉴别分子结构细微差别。 特点：p157 零阶光谱 A=ECl dA d = dE Cl 一阶导数光谱 d2A d2 = d2E Cl 二阶导数光谱 …...
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Ⅱ定量分析 200 250 300 导数光谱法定量分析示意图
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Ⅱ定量分析 褶合光谱法定量分析功能 (一)单组分定量分析 (二)双组分定量分析 (三)多组分定量分析
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苯酚-间苯二酚双组分体系的褶合光谱图-1 苯酚(1)，间苯二酚(2)，混合物(3) 在苯酚的过零点(271.90nm)计算间苯二酚含量
Ⅱ定量分析 3 1 2 苯酚-间苯二酚双组分体系的褶合光谱图-1 苯酚(1)，间苯二酚(2)，混合物(3) 在苯酚的过零点(271.90nm)计算间苯二酚含量
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苯酚-间苯二酚双组分体系的褶合光谱图-2 苯酚(1)，间苯二酚(2)，混合物(3) 在间苯二酚的过零点(280.64nm)计算苯酚含量
Ⅱ定量分析 1 2 3 苯酚-间苯二酚双组分体系的褶合光谱图-2 苯酚(1)，间苯二酚(2)，混合物(3) 在间苯二酚的过零点(280.64nm)计算苯酚含量
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Ⅱ定量分析 其它化学计量学方法 多元线性回归法（MLR） Kalman滤波法 偏最小二乘法（PLS） 主成分回归法（PCR） ……
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紫外-可见分光光度法 Ⅲ 在药学各学科中的应用
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Ⅲ药学应用 (一)无机化学 (二)有机化学/药物化学 (三)天然药物化学/生药学 (四)药理学/生化药学 (五)药剂学
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Na+/Mg2+、Ag+/Cu2+、Fe2+/Fe3+、 Cr3+/Cr6+、Ca2+、Hg2+ etc. 2、其它无机离子
Ⅲ药学应用 (一)无机化学 1、（混合）金属离子 Na+/Mg2+、Ag+/Cu2+、Fe2+/Fe3+、 Cr3+/Cr6+、Ca2+、Hg2+ etc. 2、其它无机离子 HCl/HAc、KIO3/I2、NO2- etc.
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Ⅲ药学应用 常用显色剂： 偶氮胂类、偶氮氯膦类、卟啉类、铬天青S、罗丹明B、四苯基硼酸萘胺、偶氮吡啶间苯二酚、四环素、苯甲酰茚满、氧氟沙星、8-羟基喹啉、二甲酚橙等
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图 KMnO4试剂空白(1)与NaNO2作用(2)的Vis光谱
Ⅲ药学应用 525nm 图 KMnO4试剂空白(1)与NaNO2作用(2)的Vis光谱
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(二)有机化学/药物化学 1、结构解析 2、中间体/产物的纯度检查 3、中间体/产物的稳定性试验 4、其它 反应是否发生及机理研究 etc.
Ⅲ药学应用 (二)有机化学/药物化学 1、结构解析 2、中间体/产物的纯度检查 3、中间体/产物的稳定性试验 4、其它 反应是否发生及机理研究 etc.
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图 偶氮染料Azo7在碱性DMF溶液中光照前后的UV/Vis光谱 图 聚苯胺(PANI)掺杂樟脑磺酸(CSA)前后的UV/Vis光谱
Ⅲ药学应用 图 偶氮染料Azo7在碱性DMF溶液中光照前后的UV/Vis光谱 图 聚苯胺(PANI)掺杂樟脑磺酸(CSA)前后的UV/Vis光谱
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图 卟啉化合物TAPP与cfDNA作用后的Vis光谱(Soret带) 图 白蛋白与苯甲酸钠(0.0-0.50mmol/L)作用后的UV光谱
Ⅲ药学应用 图 卟啉化合物TAPP与cfDNA作用后的Vis光谱(Soret带) 图 白蛋白与苯甲酸钠( mmol/L)作用后的UV光谱
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Ⅲ药学应用 (三)天然药物化学/生药学 1、总生物碱、总黄酮、总皂苷 等的定量分析 2、药材鉴别 紫外光谱/紫外谱线组法 3、其它
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图 枳芩合剂(1)、黄芩苷对照品(2)和阴性对照液(3)的UV光谱
Ⅲ药学应用 278nm △A 242nm 图 枳芩合剂(1)、黄芩苷对照品(2)和阴性对照液(3)的UV光谱
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图 马钱子粉中士的宁(a)与空白(b)的UV光谱 图 复方银黄口服液阳性(a)与空白(b)的UV光谱
Ⅲ药学应用 图 马钱子粉中士的宁(a)与空白(b)的UV光谱 图 复方银黄口服液阳性(a)与空白(b)的UV光谱
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Ⅲ药学应用 酸性染料比色法：在一定pH介质中，生物碱类(B)与氢离子(H+)成阳离子(BH+)，一些酸性染料（如溴麝香草酚蓝、溴甲酚绿、溴酚蓝、甲基橙等）在此条件下可解离成阴离子(In-)，与上述阳离子(BH+)定量地结合成有色的络合物(BH+In-)，从而被某些有机溶剂定量地提取，选择一定的波长测定吸收度值，即得生物碱含量。
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Ⅲ药学应用 紫外光谱法 红曲的甲醇提取液UV/Vis光谱图(1.橙色红曲 2.变红红曲 3.发白红曲 4.巴克红曲 5.红色红曲 6.紫红红曲 7.烟色红曲 8.土曲霉) 半夏、山药的乙醇提取液的UV光谱图(1.半夏 2.水半夏 3.掌叶半夏 4.天南星 5.山药 6.腾冲山药 7.木薯根)
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Ⅲ药学应用 紫外谱线组法 怀牛膝和红牛膝的4溶剂浸液紫外谱线组图谱峰位值比较 紫花地榆和白花地榆的4溶剂浸液紫外谱线组图谱峰位值比较
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(四)药理学/生化药学 1、酶活力（效价）测定 木瓜蛋白酶、谷胱甘肽过氧化 物酶、脂肪酶、碱性磷酸酶、 对氧磷酶、酯酶 etc. 2、其它
Ⅲ药学应用 (四)药理学/生化药学 1、酶活力（效价）测定 木瓜蛋白酶、谷胱甘肽过氧化 物酶、脂肪酶、碱性磷酸酶、 对氧磷酶、酯酶 etc. 2、其它 DNA纯度检查、生物体液药物 含量 etc.
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Ⅲ药学应用 酶活力是酶催化生化反应能力的表征，一般以在规定条件下，每ml酶溶液，每分钟促进或抑制某生化反应达某程度(如50%)时的酶量定义为1个酶活力单位。 酶活力 = K ● △A 其中，K为常数，△A为酶（或底物、产物）作用前后的吸收度差值。
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图 MMO还原酶随NADH(底物)加入量增加(1→4)的UV/Vis光谱变化
Ⅲ药学应用 460nm 图 MMO还原酶随NADH(底物)加入量增加(1→4)的UV/Vis光谱变化
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图 过氧化物酶氧化邻苯二胺(底物)的UV/Vis光谱变化(扫描间隔0.3min)
Ⅲ药学应用 220nm 422nm 图 过氧化物酶氧化邻苯二胺(底物)的UV/Vis光谱变化(扫描间隔0.3min)
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Ⅲ药学应用 图 鱼精DNA(1)、苯酚(2) 、N-乙酰-L-色氨酰胺(3)、N-乙酰-L-酪氨酰胺(4)、N-乙酰L-苯丙氨酸乙酯(5)、内毒素(6)的UV光谱
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Ⅲ药学应用 (五)药剂学 1、均匀度测定 2、溶出度测定 3、制剂、配伍稳定性 4、其它 体外吸附试验 etc.
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? √ / √ ╳ 表 头孢吡肟和甲硝唑混合液的含量、pH值变化(n=3,25±1℃) 图 头孢吡肟、甲硝唑的UV光谱 Ⅲ药学应用
双波长等吸收点法 系数倍率法 头孢吡肟 甲硝唑 √ / ? √ ╳ 表 头孢吡肟和甲硝唑混合液的含量、pH值变化(n=3,25±1℃) 图 头孢吡肟、甲硝唑的UV光谱
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紫外-可见分光光度法 Ⅳ 设计性实验
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目的 教员：提高学员学习兴趣，提升教学质量 发现适合“第二课堂”的苗子 实验教学新模式的改革与探索 学员：见识“验证性”实验以外的实验模式
Ⅳ 设计性实验 目的 教员：提高学员学习兴趣，提升教学质量 发现适合“第二课堂”的苗子 实验教学新模式的改革与探索 学员：见识“验证性”实验以外的实验模式 锻炼初步的科研思维 锻炼综合能力与动手能力
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Ⅳ 设计性实验 内容 利用已学习的紫外光谱定量分析方法（解线性方程组法、等吸收双波长消去法、系数倍率法、导数光谱法、褶合光谱法等），自行设计实验方案并分析下列双组分体系： 乙酰水杨酸(阿司匹林)+水杨酸
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图 水杨酸(1)、乙酰水杨酸(2)和乙酰水杨酸+水杨酸(3)的UV光谱
Ⅳ 设计性实验 A 3 2 1 nm 图 水杨酸(1)、乙酰水杨酸(2)和乙酰水杨酸+水杨酸(3)的UV光谱
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讨论(预)实验的问题原因及解决办法、各方案的优缺点
Ⅳ 设计性实验 查阅文献或图书资料 设计阶段 实验阶段 总结阶段 设计实验方案(多组多个) 列出所需试剂等材料 师生讨论确定实验方案 紫外光谱实验网络教学 准备实验用试剂 熟悉紫外光谱仪 按实验方案开展预实验 讨论并修正实验方案 按最后方案开展实验 讨论(预)实验的问题原因及解决办法、各方案的优缺点 设计性实验汇报
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Ⅳ 设计性实验
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实施 报名方式：自愿报名，择优遴选 时 间：遴选( → 2003.5.09 ) 设计( → 2003.5.26 )
Ⅳ 设计性实验 实施 报名方式：自愿报名，择优遴选 时 间：遴选( → ) 设计( → ) 实验( → ) 总结( → ) 联 系 人： (汪), -5(陆)
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