第十三章 基因治疗 一、基因治疗的概念及遵循原则 二、基因治疗的程序 三、基因治疗的策略 四、基因治疗的临床应用 五、基因治疗的问题与前景

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1 第十三章 基因治疗 一、基因治疗的概念及遵循原则 二、基因治疗的程序 三、基因治疗的策略 四、基因治疗的临床应用 五、基因治疗的问题与前景
第十三章       基因治疗 一、基因治疗的概念及遵循原则 二、基因治疗的程序 三、基因治疗的策略 四、基因治疗的临床应用 五、基因治疗的问题与前景 六、裂解型（HSV-Ⅰ）载体用于脑肿瘤的基因治疗(如图)

2 基因治疗的概念 基因治疗就是将有功能的基因转移到病人的细胞中以纠正或置换致病基因的一种治疗方法，是指有功能的目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因发生整合，成为宿主细胞遗传物质的一部分，目的基因的表达产物起到对疾病的治疗作用。若目的基因不与宿主细胞基因组发生整合，但可通过暂时表达产物发挥治疗作用的方法叫基因疗法（gene therapeutics），此法实际上就如同临床上使用的药物治疗一样，这与传统意义上的基因治疗是有区别的。基因治疗常采取四大措施，包括：(1)基因置换(gene reptacement) (2)基因修正(gene correction) (3)基因修饰(gene augmentation) (4)基因失活(gene inactivation)

3 基因置换 基因置换(gene reptacement)：是指将致病基因整个地被有功能的正常基因所置换，使致病基因永久地得到更正。但操作难度大，有伦理学问题。

4 基因修正 基因修正(gene correction)是指将致病基因的突变碱基序列得以纠正，而正常序列部分予以保留，使突变的致病基因恢复正常功能。即使致病基因的突变序列纠正为正常序列（用碱基点突变技术）。

5 基因修饰 基因修饰(gene augmentation)则是指将目的基因导入缺陷细胞或其它细胞，目的基因的表达产物可修饰和改变缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。

6 基因失活 基因失活(gene inactivation)就是应用反义技术(antisense technology)特异封闭某些基因的表达，以达到抑制或阻止某些有害基因的表达。SiRNA的基因干扰可造成靶基因（异常基因）的失活（或沉默）。

7 基因治疗遵循的原则 基因治疗应遵循的基本原则为： 1．治疗的疾病应是指目前治疗方法难以阻止疾病发展的严重疾病。
2．遗传性疾病应是属于染色体“隐性”遗传的疾病，即指来自双亲的二条染色体上同一基因位点都发生改变的疾病，只要通过导入同一正常基因即可纠正缺陷。 3．能治疗疾病的正常基因已经被克隆，并能表达有功能的产物。 4．基因治疗用的基因在体内表达无需精确调控，表达产物过多不会产生危害。 5．注入体内带有外源基因的治疗细胞，应能自然消减去除。

8 二、基因治疗的程序 (一)目的基因的准备 (二)受体细胞(靶细胞)的选择和培养。 (三)载体的选择 (四)目的基因导入靶细胞的基因转移方法

9 目的基因导入靶细胞的基因转移方法 1．基因转移的物理法 2．基因转移的化学法 3．基因转移的融合法 4．基因转移的颗粒轰击技术
5．基因转移的病毒载体法

10 1．基因转移的物理法 (1)显微注射法 ①真正的显微注射法：直接在显微镜下向胞内注入基因 ②穿刺法：先在胞膜、胞核上穿孔后导入基因 (2)电脉冲介导法：在高压电脉冲下，使胞膜瞬间形成孔洞，基因在强电场下导入，电场强度和持续时间随种类而异。

11 2．基因转移的化学法 (1)DNA—磷酸钙共沉淀法 (2)DEAE—葡聚糖法 (3)染色体介导法 (4)聚阳离子—DMSO转染技术

12 3．基因转移的融合法 (1)细胞融合法 (2)脂质体介导法 (3)原生质体融合法 (4)微细胞核介导法

13 4．基因转移的颗粒轰击技术 目的基因DNA质量较轻，在电场中不易获得较高的运动速度，但用重金属钨或金等进行表面包被以后，形成了具一定大小的颗粒，在电场突然充电时包被DNA的金属颗粒可获得较大的能量，并沿电场方向作快速运动，可穿入到器官，组织或培养的细胞中，使外源目的基因DNA也随之穿入，即在电场作用下，基因DNA的金属颗粒发生高速运动，使DNA导入细胞中。它与颗粒大小、电场的电压有关。

14 三、基因治疗的策略 (一)缺陷基因的基因置换疗法 (二)基因修饰疗法 (三)基因失活疗法

15 (一)缺陷基因的基因置换疗法 缺陷基因的基因置换疗法就是以正常的基因置换缺陷基因，而将细胞中原缺陷基因去除后，改用正常而有功能的基因进行替换，使缺陷或突变的基因在原位得到更正，此法可使单基因遗传病达到治愈的最佳疗效，但目前尚不能用于临床，治疗人的遗传病，只能进行动物的实验研究。若不需完整基因置换，而是使致病基因的单个碱基发生突变，以正常的碱基纠正致病基因中的某个突变碱基，也可使单基因遗传病得以永久治疗，此法又称基因修正疗法，但目前尚无基因修正的有力措施。

16 (二)基因修饰疗法 基因修饰疗法又称基因添加疗法，就是将正常的基因导入病灶原发的细胞或其它细胞(如免疫细胞)，其表达产物可以补偿或纠正异常基因的功能，但异常的致病基因本身并未得到改变，仍保留在细胞中，此法导入的基因并非原位导入，因此，表达水平和调控难以取得理想的结果，最理想的应是基因置换和基因修正策略。

17 (三)基因失活疗法 基因失活疗法是将遗传病或肿瘤等患者体内过分表达异常产物的异常基因或在癌细胞中与恶性增加有关的活化癌基因，使其得到抑制或封闭，甚至失活的基因疗法，以达到异常基因的表达受到抑制或封闭，甚至完全停止，反义DNA/RNA及小RNA干涉技术的抗肿瘤基因治疗是基因失活的理想方法。

18 四、基因治疗的临床应用 （一）遗传性疾病的基因治疗（表13-2） （二）肿瘤的基因治疗 （三）抗病毒的基因治疗

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20 （二）肿瘤的基因治疗 1．目的基因的选择和治疗策略 2．基因治疗方法 3．细胞因子的基因治疗 4．提高机体抗肿瘤免疫力的基因治疗

21 1．目的基因的选择和治疗策略 肿瘤的基因治疗就是以正常的或野生型的基因去取代不正常基因或阻止异常基因的表达，以达到抑制或阻止、甚至逆转肿瘤细胞恶性表现之目的，因此目的基因的选择是很重要的，常选用的目的基因有：①增强机体细胞免疫功能，促进杀肿瘤和抑制肿瘤细胞生长的免疫调节和抗肿瘤作用的细胞因子基因如IL-2、IFN和集落刺激因子（CSF）及MHC的HLA-B7，HLA-DR基因。②抑癌基因，如P53，WT-1和Rb三种基因，③原癌基因的反义DNA及RNA和S iRNA基因治疗的策略。

22 2．基因治疗方法 （1）抑癌基因转移的基因治疗 （2） 反义寡核苷酸的原癌基因失活疗法 （3）药物自杀基因在肿瘤基因治疗中的应用
（4）癌抗原基因转移的肿瘤基因治疗如打破原先的肿瘤免疫的耐受，建立肿瘤特异免疫 （5）多重耐药性基因转移的肿瘤基因治疗

23 （1）抑癌基因转移的基因治疗 抑癌基因或肿瘤抑制基因（Tumor Suppressor gene）或血管形成抑制因子基因是肿瘤基因治疗中很重要的基因，这种基因导入肿瘤或其他细胞后其表达产物可抑制肿瘤及肿瘤细胞的恶性增生、血管形成等，甚至可以使恶性肿瘤细胞发生逆转，成为正常细胞，目前研究和应用较多的抑癌基因包括P53、WT-1、Rb、Ango和Endo等基因，这些基因若发生突变、缺失或缺陷，故失去抑制细胞恶性增生和血管形成的功能常会致癌，若导入上述基因进行基因修饰就可抑制癌细胞的恶性增生。

24 （2） 反义寡核苷酸的原癌基因失活疗法 为了抑制肿瘤细胞中癌基因的过高表达，可根据已知癌基因的核苷酸序列合成反义寡核苷酸，来抑制 癌基因的表达（因反义寡核苷酸能与癌基因核酸中的正链的特定顺序互补与结合形成双链体）。反义寡核苷酸有以下几种：（1）反义RNA（2）具核酶（ribogyme）活性的反义RNA（3）脱氧寡聚核苷酸（oligodeo xyribonucleotides,ODN）（4）肽核酸（peitide nucleic acids,PNAS）

25 原癌基因 原癌基因（Proto-oncogene）是在亿万年漫长生物进化过程中高度保留的基因，说明原癌基因在细胞内是具有重要功能的。能调控细胞生长、增殖和分化。正常情况下表达受到严格的控制。一旦调节失控，其基因产物为生长因子，生长因子受体，胞内外传递信号等癌蛋白就会造成分泌过剩，常导致细胞恶性增生和致癌，细胞恶性转化与原癌基因的活化密切相关。原癌基因活化程度对肿瘤的发生和发展具有重要的作用，原癌基因活化包括基因点突变，融合基因形成或异常激活后而引起表达量异常等。

26 反义RNA技术 反义RNA又是一种与mRNA互补的RNA分子，它是双链DNA中无意义链转录的RNA，因此肿瘤癌基因活化表达的mRNA的起始翻译部位就会被相应的反义RNA互补结合形成RNA/RNA双链体，进而就阻止了核糖体与mRNA结合，或阻止核糖体沿mRNA上移，以抑制mRNA的翻译，起到了抑制癌基因过高表达癌蛋白的效果。反义RNA技术与补充基因转移疗法的常规技术相反，它走的是抑制基因（癌基因）表达的路线，是一种干涉性基因治疗，以阻止或抑制原癌基因的过度表达及抑制癌基因突变体mRNA的成熟，属基因失活疗法。

27 具核酶活性的反义RNA 在反义RNA研究的基础上，现又设计出具核酶（ribogyme）活性的反义RNA，它既能与mRNA互补结合阻止mRNA的翻译，同时反义RNA上带有锤头状结构基因能对靶序列（mRNA）进行特异性切割，建立了核酶基因治疗新技术，这种核酶反义RNA可反复使用以降解mRNA，其抑癌效应明显高于反义RNA，这一技术为癌的基因治疗提供了新技术、新思路，有较好的应用前景。 近来又发现SiRNA也能使其mRNA降解，可使肿瘤基因沉默。

28 反基因技术 反基因技术（autigene）,即根据癌基因序列制备出脱氧寡聚核苷酸（oligodeo xyribonucleotides,ODN）这种与癌基因互补的ODN能以DNA双螺旋分子专一性序列为靶物，与癌基因序列形成三螺旋DNA，这样就阻止了癌基因的转录，因此就可在癌基因转录水平上阻止癌基因的活化，有人把三链DNA称为“能够攻击病毒和癌细胞而不损害健康组织的新型基因药物。反基因技术的关键在ODN的设计与合成，其作用机理是通过ODN在DNA结合蛋白的识别位点处，与靶基因（癌基因）形成三螺旋，可专性地发挥干扰DNA与蛋白的结合，激活因子的转录起始或转录延长等，进而阻止了癌基因的转录和高表达，达到“反基因”的目的。

29 肽核酸 目前可通过计算机分析DNA结构，提出用多肽骨架结构取代ODN中的糖-磷酸骨架，并成功地合成了该分子，这种以肽为骨架的多酰基寡聚物称为肽核酸（peitide nucleic acids,PNAS），它保留了ODN与DNA的高度亲和力，因此能与靶基因形成三螺旋结构，尽管此项技术目前只是处于实验研究阶段，还有一些技术性问题尚待解决，但终究会获得解决，应用潜力极大。

30 （3）药物自杀基因在肿瘤基因治疗中的应用 ①药物自杀基因的作用机理 ②药物自杀基因的种类 ③药物自杀基因作用的底物-GCV/ACV
④药物自杀基因靶向转移的特异性，如连接肿瘤相关抗原基因，α-FP针对肝癌 ⑤药物自杀基因的临床应用前景 ⑥

31 ①药物自杀基因的作用机理 HSV- tk基因编码的蛋白质含376个氨基酸，TK为胸苷激酶是催化脱氧胸苷变成脱氧胸苷酸的酶，在细胞中TK的作用底物范围较窄，而HSV中的TK可催化一些核苷酸类似物（NAs）的磷酸化，如GCV、ACV等，对作用底物范围较宽，上述这些NAs不能在细胞TK作用下磷酸化，因此对未转染HSV-tk的细胞不起作用，但在导入和表达HSV-tk的细胞中，NAs可以被磷酸化，其磷酸化过程为NAs→NAsMP→NAsDP→NAsTP。NAsTP对细胞有强烈毒性。可抑制细胞DNA聚合酶活性或作为三磷酸脱氧胸苷（dTTP）的竞争性抑制物掺入到细胞合成的DNA内，使细胞DNA合成受抑或被阻断，进而导致细胞死亡（即凋亡）。

32 ②药物自杀基因的种类 除HSV-tk基因为公认的药物自杀基因外，还有水痘带状疱疹病毒的tk基因（VIV-tk）,大肠杆菌的DeoDa基因，细胞色素P-450基因，黄嘌呤一鸟嘌呤核糖转移酶（XGPPT）等。均可将NAs变为细胞的毒性产物，抑制细胞DNA合成。

33 ⑦多重耐药性基因转移的肿瘤基因治疗 肿瘤化疗中面临的最大问题是肿瘤细胞的耐药性以及造血细胞对化疗药物的敏感性，多重耐药基因（MDR）可诱导产生耐药表型，转移造血干细胞可以提高细胞对化疗药物耐受，近而又可提高化疗剂量，相对提高了肿瘤对药物的敏感性。此外，也可以将耐药基因的反义RNA转入肿瘤细胞中，以抑制肿瘤细胞对耐药基因的表达，降低了耐药性，从而有助于提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

34 3．细胞因子的基因治疗 将细胞因子基因导入细胞，使其在局部持续分泌一定量的细胞因子。细胞因子可直接杀伤瘤细胞（如TNFα），免疫调节因子（如IL-2）可通过调节免疫网络刺激机体免疫系统，增强免疫应答，发挥抗肿瘤作用。目前采用的细胞因子基因有干扰素、白细胞介素，肿瘤坏死因子，集落刺激因子等相关基因，导入免疫细胞，肿瘤和非肿瘤细胞中来实施人体的基因治疗。

35 4．提高机体抗肿瘤免疫力的基因治疗 细胞因子的基因治疗，是提高机体抗肿瘤免疫力的较好的基因治疗方案，但肿瘤细胞有的不表达肿瘤特异性抗原，因而不能被免疫T细胞识别，有的虽能表达特异性抗原，但缺少MHC抗原表达，又使T细胞难以进行限制性识别，因而T细胞不能被激活，使肿瘤细胞避免了机体的免疫监视，有人把病毒基因或抗原基因转移到肿瘤细胞中以增强肿瘤细胞的异质性，这种转基因的肿瘤细胞等于是引起肿瘤免疫应答的“瘤苗” ，有利于T细胞产生共刺激信号，行使对肿瘤细胞的免疫应答，增强机体抗肿瘤免疫力。

36 （三）抗病毒的基因治疗 病毒病的基因治疗主要集中在治疗艾滋病方面，抗病毒的基因治疗策略与抗肿瘤基因治疗大致相同，主要是采用基因修饰和基因失活的治疗策略，具体方案为：①阻止病毒复制策略、②使感染HIV细胞死亡的方法、 ③降解策略。

37 五、基因治疗的问题与前景 前景广阔，但问题也不少。如 1.论理学问题2.安全性问题3.技术性问题4.商品化问题5.疗效问题

38 目的基因的准备 其表达产物已证明有活性，功能确切，在启动子下游可表达，有标记基因筛选，监控重组体。

39 受体细胞(靶细胞)的选择和培养 易取材，易培养，基因易导入，对载体敏感，可培养传代，寿命相对较长。能达足够量，如疾病细胞，造血细胞、基质细胞、上皮、成纤维、内皮细胞等均可。

40 载体的选择 质粒载体（穿梭载体）既具有动物（人）细胞表达元件，又具有细菌质粒相关元件。
病毒载体：1.重组病毒载体：基因重组病毒可直接感染细胞导入基因 2.重组质粒型病毒载体：在细菌中扩增质粒，体外包装形成假病毒，感染靶细胞，将基因导入。

41 DNA—磷酸钙共沉淀法 基因加氯化钙再加入Hepes形成DNA-磷酸钙沉淀颗粒，被细胞吞入。

42 DEAE—葡聚糖法 基因加DEAE-dextron，形成复合物，被细胞吞入或先用DEAE处理细胞再加DNA，而后被吞入。

43 染色体介导法 收集分裂中期染色体，用磷酸钙共沉淀法导入。

44 聚阳离子—DMSO转染技术 先用DMSO处理细胞（改变通透性），再加入聚阳离子处理的DNA（增加细胞表面吸附能力）。

45 细胞融合法 PEG/仙台病毒使供/受细胞融合。

46 脂质体介导法 脂质体包被基因DNA后，加入PEG预处理的受体细胞，使细胞融合。

47 原生质体融合法 将目的基因质粒重组菌制成感受态，在溶菌酶作用下，释放原生质体，再加入原先用PEG处理的受体细胞，发生原生质体与受体细胞融合。

48 微细胞核介导法 供体细胞先用秋水仙素处理，再用细胞松弛素处理（脱核），制成微核细胞，再加PEG处理的受体细胞，再进行细胞融合。

49 5.基因转移的病毒载体法 不同组织细胞和目的基因选用不同的病毒载体 不同的病毒载体选用不同扩增方式、敏感细胞或包装细胞
不同的病毒载体有不同的扩增、包装、感染、整合/游离的表达方式，如表13-1

50 特定组织细胞 可考虑的主要基因转移方法和途径 游离淋巴细胞(ex vivo) 逆转录病毒载体，基因枪，电穿孔 肺组织 腺病毒载体，气溶胶 骨骼肌内组织 裸DNA直接注射，基因枪 脑组织 单纯疮疹病毒载体 动脉管壁组织 逆转录病毒转染内皮细胞(ex VIVO) 通过脂质体或气囊导管回输 肝组织 逆转录病毒，直接注射(腹膜内注射，感染宫内动物)或部分肝切除后门静脉内(或肝实质内)注射，ASOR—PL— DNA复合物ASGP受体结合，基因枪。 乳腺组织 逆转录病毒载体（乳头管注射） 皮肤组织 基因枪，电穿孔

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