第四章 微生物农药.

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1 第四章 微生物农药

2 昆虫疾病： 非传染源疾病：不良环境、创伤、营养、生理失调及先天性不足。 传染源疾病：细菌、真菌、病毒、原生动物、线虫、立次克体。

3 微生物农药是指应用生物活体（包括细菌、真菌、病毒、 原生动物、线虫或基因修饰的微生物）制成的防治作物病、 虫、草、鼠等有害生物的制剂，也包括保护生物活体的助剂、 保护剂和增效剂。
微生物农药是目前生物农药的一个最主要的组成部分， 其基础研究和产业化研究均走在整个生物农药研究领域的前 列。

4 微生物可分为： 无细胞结构真病毒、亚病毒； 具有原核细胞结构的真细菌（细菌、放线菌、蓝细菌、立克次氏体、支原体、衣原体）、古细菌； 具有真核细胞结构的真菌（酵母菌、霉菌）、单细胞藻类、原生动物等。

5 按微生物种类分类： 细菌类：苏云金杆菌、日本金龟子杆菌、球状芽孢杆菌 真菌类：白僵菌、绿僵菌 病毒：核多角体病毒、颗粒体病毒
寄生线虫：小杆线虫、斯氏线虫 微孢子原虫类

6 用于制备生物农药的主要微生物类群 生物类别 致病生活阶段及传播 作用方式 适用环境 形成孢子的细菌杀虫剂 晶体毒素，抗性强的孢子 胃毒，侵染
植物表面，水，土壤 原生动物杀虫剂 抗性强的孢子 中肠侵染 植物表面 昆虫病毒 抗性强的包涵体 枝霉菌素杀虫剂 相对弱或抗性强的孢子 接触侵染 土壤、植物表面，水、昆虫表皮 霉菌除草剂 相对弱的孢子 土壤、植物表面 细菌除草剂 弱的细菌细胞，抵抗力强的孢子 拮抗植物病原菌的真菌、细菌 抗性强的或弱的孢子 接触侵染或抑制 细菌真菌共生体 细菌，传播能力弱 土壤 嗜虫线虫 传染阶段（相关的细菌），传播能力弱 寻找寄主后侵染 土壤、水

7 第一节 细菌农药 电子显微镜下的细菌三型 球菌 螺旋菌 杆菌

8 细菌的结构模式图 细胞质 夹膜 细胞壁 DNA 细胞膜 鞭毛

9 染色法 革兰氏染色 Gram stain：由丹麦细菌学家革兰(Hans Christian Gram)创建的一种鉴别染色法。采用4 种 试剂分4 步： 结晶紫 碘液 %乙醇 复红 （初染） （媒染） （脱色） （复染） 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 （菌体为紫色 ） （ 菌体为红色） G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，番红染液复染后呈红色。

10 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌 革兰氏染色的意义：鉴别细菌、选择用药、研究细菌的致病作用
大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌

11 有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏阳性反应；
弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现阴性反应。

12 细菌农药的分类 按用途分 按是否产芽孢分 细菌杀虫剂 芽孢杆菌类 细菌农药 细菌杀菌剂 细菌杀鼠剂 非芽孢杆菌类 细菌杀线虫剂 微生态制剂

13 一、细菌性杀虫剂 蜡状芽孢杆菌 杆状菌 假单孢菌 链球菌

14 具有杀虫作用的昆虫病原细菌大多属于3个科： 芽孢杆菌科（Bacillaceae）、 肠杆菌科（Enterobacillaceae）、
假单胞菌科（Pseudomonodaceae）。 其中能成为杀虫剂的主要分布在芽孢杆菌科的2个属： 芽孢杆菌属（Bacillus） 梭状芽孢杆菌属（Clostridium）。 筛选的杀虫细菌大约有100多种，大部分病原性细菌属于：芽孢杆菌、假单胞菌、肠杆菌科、链球菌和微球菌科 。 寄主范围广：鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、螨类等1000多种昆虫和螨。

15 1、细菌性杀虫剂的特性 (1) 细菌属于原核生物，单细胞的有机体，个体较小，一般体长都在微米级，缺乏完整的细胞核，有的可以运动，有些种在有氧和无氧的条件下都能生存。多数以二分裂法进行无性生殖，有些也可以进行有性生殖。许多细菌具有质粒可以把基因导入菌体中 。

16 (2) 大多数的昆虫病原细菌是通过口和消化道感染昆虫的，只有少数通过卵、体壁和气管感染。细菌也可以通过寄生虫和捕食昆虫携带感染。

17 (3) 细菌繁殖速度极快，种类繁多，广泛分布在自然界中，因此其与昆虫接触的机会很多，容易感染昆虫。
昆虫被细菌感染后都表现一些共同的特征，例如活动缓慢，食欲减退，腹泻和呕吐等。 大多数的细菌侵入昆虫体腔后，常常先引起感染而最终引起败血病导致昆虫死亡。死亡的虫体颜色加深，迅速变成褐色和黑色，虫体软化腐烂，稍为触及，虫体破裂，流出带有臭味的黏稠液体 。

18 (4) 在昆虫病原菌中，有寄主范围很窄的专性病原细菌和寄主范围很宽的兼性病原细菌。
专性细菌一般在合成培养基上不能生长，对特定的昆虫具有很强的致病力； 兼性细菌在培养基上能生长，具有易繁殖、易生产等特点，是微生物农药的主要病原菌。 目前应用较广的专性病原细菌有日本金龟子芽孢杆菌和缓病芽孢杆菌，兼性病原细菌有芽孢杆菌属和沙雷铁杆菌属。

19 (5) 细菌杀虫剂有独特的作用方式和杀虫机理，通过营养体、芽孢在体内繁殖并产生生物活性蛋白毒素等杀死目标昆虫。具有很高的选择性和很少的交互抗性。

20 (6) 实际应用的部分细菌农药的缺点 1) 杀虫谱比较窄 2) 不具有内吸作用，不能杀死取食作物内部的害虫 3) 作用速度比较慢
1) 杀虫谱比较窄 2) 不具有内吸作用，不能杀死取食作物内部的害虫 3) 作用速度比较慢 4) 生产工艺比较复杂 5) 持效期比较短，受日光照射容易失效等，从而影响了该类农药的发展。

21 1、苏云金芽孢(胞)杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)
1901年，石渡繁胤 (Ishiwata)， 生病的蚕蛾。 1911年，Berliner在德国苏云金地区的面粉厂里的地中海粉螟中分离出Bt ，并于1915年首次对其命名。 20世纪20年代中期，才首次用Bt对鳞翅目幼虫(欧洲玉米螟)进行了田间药效试验，引起了当时许多昆虫学家的注意。 1938年 法 Sporeine 第一个商品制剂。 1953. Hannay 伴孢晶体 杀虫作用 1971. 日本农林省解除禁令，植保局成立Bt研究会 相继发现了对鞘翅目，螨类、同翅目、膜翅目、直翅目昆虫，动植物寄生线虫，鞭毛虫，变形虫，扁虫中的吸虫、绦虫有致病性的Bt菌株。

22 中国： 1940年代：用苏云金杆菌防治菜粉蝶（中大蒲蛰龙） 1950年代：从法国引进苏云金杆菌 1964年，湖北和湖南两省设厂生产 1970年代初，大规模群众性生产 1980年代后：“七五”“九五”“十五”攻关，863， 年中长期规划 资源调查、生产工艺改进、质量标准化、蛋白基因克隆、转BT基因植物。

23 (1) Bt形态特征及生理生化 1) 形态特征：3个阶段 营养体：杆状，横裂生殖、革兰氏阳性。
芽孢囊：菌体老熟时，一端斜生一个椭圆形芽孢，另一端同时出现伴孢晶体。晶体典型为菱形、也有圆形、方形、椭圆形、不规则形，通常1个，也有几个毒素主成分，但亦有发现对昆虫无毒。 芽孢和伴孢晶体的释放：芽孢囊破裂，释放出游离的芽孢和伴孢晶体。

24 苏云金芽孢杆菌的特征

25 细菌的芽孢类型 苏云金芽孢杆菌芽孢及伴孢晶体

26 苏云金芽孢杆菌菌落在斜面培养基上的形态 苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种菌落 在平板培养基上的形态

27 2) 生理生化 Bt对营养条件要求不高。所需主要营养物质属动植物蛋白质衍生物。能在多种N源，碳源和无机盐中正常发育。通常所利用的营养:

28 无机盐：K2HPO4、MgSO4、CaCO3。主要元素有磷、硫、镁、钾、钠、钙6种，微量元素的锰、锌、硅、铁等，微量元素所需甚微，水中含的微量无素即可满足，多了有毒。
温度：10-40℃都能生长，以28-32℃较适。35-40℃生长很快，但易衰老，温度低则生长缓慢。因此在一定范围内提高温度会缩短生长期，但菌数量会降低；而温度低则生长慢，生长期延长，菌数相对来说则增高。

29 pH：与其他细菌类似，该菌适于微碱性条件，最适pH是7.5，当pH达8.5时还能形成芽孢，如pH降至5以下则不能形成芽孢。
氧: 是一种好氧细菌，需要充足的空气才能生长发育良好。尤其当芽孢形成时，若缺乏足够的空气时会延迟芽孢的形成或不能形成。它还影响到生长速度、菌数和晶体。在深层培养时通气不良会造成细菌溶解，使菌数降低。

30 紫外线:阳光对芽孢有致死作用。芽孢暴露在紫外光下很快失活:1分钟失活12%、2分钟50%失活、10分钟99%失活。在自然阳光下，30分钟50%失活，60分钟80%失活。在 nm处死亡率最高。 抗生素及化学物:放线菌素、氯霉素、红霉素及一些化学物质都有影响。乳化剂对芽孢萌发有抑制作用，TritonX-100在100μg/ml时，全部抑制了芽孢萌发。

31 (2) 分类、命名及来源 1) 分类 苏云金杆菌亚种在生物化学、血清学、孢子体、抗原、抗生素的合成、酶、噬菌体和外原凝集素组成等方面都有差异。 Krieg等人在1983年提出了一种非常简单的利用致病类型对细菌类微生物杀虫剂进行分类的方法，虽然这种方法不太适合Bt（例如，许多亚种产生的毒素涵盖了多种不同致病型），但是对于Bt商品化产品来说是一种比较适合的分类方式。

32 这些注册的品种覆盖了大部分危害严重的鳞翅目昆虫，如黏虫、地老虎、卷叶蛾、螟虫、小菜蛾、舞毒蛾、云杉食心虫和烟草食心虫等）
致病型A 包括对鳞翅目的致病菌（BTS在美国已注册应用于50多种蔬菜、30多种水果、30种田间谷物、15种牧草及香料、草垫植物、观赏植物、景观植物和多种热带植物。 这些注册的品种覆盖了大部分危害严重的鳞翅目昆虫，如黏虫、地老虎、卷叶蛾、螟虫、小菜蛾、舞毒蛾、云杉食心虫和烟草食心虫等） 另外有些公司利用遗传工程技术使得Bt菌寄主范围扩大，并且延长了其在田间的存活时间。同时利用融合两个不同株系发展出一些新产品，甚至新的株系。

33 致病型B包括对双翅目的致病菌（以色列亚种，首先在美国注册，已在全球范围内作为控制蚊虫和蚋的人工合成有机杀虫剂的替代品使用。在德国广泛用于控制当地的顽固性公共卫生害虫——伊蚊，该菌同时也被WHO和UN纳入到其蚊虫控制计划中。作用机理都为孢子体中的四个主要活性蛋白起作用）

34 致病型C则主要包括对鞘翅目的致病菌（日本金龟子芽孢杆菌和缓病芽孢杆菌是美国注册的最早的微生物杀虫剂，对鞘翅目害虫的活性均来自于外毒素和内毒素的混合或单独的作用）。

35 2) 鉴定 种以下可按鞭毛抗原、生理生化，酯酶电泳分为变种(var.)或亚种(subsp.)，现在已有60多个血清型80多个亚种。

36 生理生化: 细菌、病毒常用对生理生化反应的正负和强弱来区分。Bt可利用各亚种间生理生化上的差异，如对碳源和氮源的利用及某些酶类和代谢产物的有无来区分。这种方法简便易行常用，但亲缘较近的变种之间差别往往很小，容易导致错误。

37 酯酶电泳:比一般生化反应具有较高的特异性，实验条件要求较严格，应有对照酯酶型菌种。
PCR技术用于Bt基因分类

38 H抗原: H为德语Hauch(扩散)之意，不同亚种抗原分析的血清学反应则具有较高的鉴别能力，是利用细菌或其某一部分构造具有的特异性抗原注射动物体内，促使动物血清中产生和抗原起作用的抗体，抗体存在于动物血清中，利用已知的抗血清可以检定未知的菌种。抗原和抗体可以发生多种不同的作用，常用凝集反应。根据未知菌种和已知抗血清在试管中有无凝集现象便可判别此菌是否为与抗血清相应的菌种。Bt鞭毛具有这种特异抗原性，能用血清方法加以鉴别。

39 苏云金杆菌的分类方式

40 3) 命名 苏云金芽胞杆菌新亚种的命名主要是根据以下四条: 采集地: 如苏云金亚种、肯尼亚亚种、加拿大亚种、以色列亚种、九州亚种、东北亚种(九州和东北为日本省名)、云南亚种、武汉亚种、华中亚种、山东亚种等。 根据寄主虫名:如蜡螟亚种、玉米螟亚种、松毛虫亚种等。 根据分离者名字：如Kurstak、Thompson、Morrison等。 根据病症进行命名：如猝倒亚种、亚毒亚种、杀虫亚种等。

41 4) 苏云金芽胞杆菌的来源与分离 Martin等1990年在澳洲Adelaide举行的第五届ICIP会议上，统计了Bt菌株的分离情况：22%来于昆虫体、44%来源于土壤，18%来自贮藏物，其他(粉尘、植物等)占16%。 地理区域 ： 目前除南极洲未见报道外，其他地区均有发现BT。在海拔近4英里的高处几乎没有昆虫生存，而在那里科学家仍发现了能杀死毛虫、蚊子和甲虫的Bt菌种。

42 昆虫：许多Bt分离自蚕(场)等饲养昆虫体上。
存在环境： 昆虫：许多Bt分离自蚕(场)等饲养昆虫体上。 贮藏产品：第一株正式命名的Bt分离于德国苏云金地区面粉厂的地中海粉螟上。

43 土壤：土壤是微生物的大本营，苏云金芽胞杆菌是一种土壤习居菌。Martin和Travers从土壤中找到新的Bt菌种，这一事实改变了Bt菌的历史。因为起初科学家们认为，只有找到死昆虫才能找到这些细菌。本来以为它是一种昆虫病，但实践证明，Bt实际上是多种土壤中的正常组份。 植物体表面：近年来随着研究的不断深入，发现植物体表面亦存在Bt。

44 Bt芽孢具有高度的抗逆性，经几十年后仍保持萌发能力，并能正常发育成营养细胞。
(3) 苏云金芽胞杆菌的菌种保藏 1) 原理和要求 Bt芽孢具有高度的抗逆性，经几十年后仍保持萌发能力，并能正常发育成营养细胞。 菌种保藏要求的总原则是代谢速度尽量低，同时又不失活。主要有采用液氮、冷冻等的低温保藏。石蜡油的隔氧保藏和砂土管的干燥保藏等方法。

45 2) 保存方法 砂土管保藏： 取干净河沙，用0.1N盐酸和0.1N氢氧化钠溶液交替处理后，用自来水冲洗至中性，烘干后用磁铁吸去其中铁屑，60目过筛后待用。同时取有机质少的砂壤土烘干、研碎、120目过筛。按2:1混合砂和土，2-3g/管装入1×10cm厚壁指形管，用棉塞塞好，湿热灭菌2次，干热灭菌1次，用LB液体培养基检查无菌后使用。 在无菌条件下，在每支砂土管吸入0.3ml左右芽孢悬液，塞上棉塞。置真空干燥器内用真空泵抽干。

46 美国农业部Brownsville Lab常采用此法。它的原理是首先使微生物冷冻，然后减压升华其中的水分，最后达到干燥的目的。 滤纸条保藏法：
冷冻干燥法： 美国农业部Brownsville Lab常采用此法。它的原理是首先使微生物冷冻，然后减压升华其中的水分，最后达到干燥的目的。 滤纸条保藏法： 法国Pasteur研究所采用此法。将Bt芽孢悬液吸附到滤纸条上，干燥后加以保存。 将滤纸剪成长条，每支安瓿管内放1-3条，湿热灭菌后烘干备用。用脱脂牛奶制成浓的菌悬液后，再用灭菌注射器或长的毛细管把悬液滴在滤纸条上，以滤纸条完全湿润为止。将安瓿管置于真空干燥器内抽真空使其干燥再封口保存。

47 液体石蜡斜面保藏法： 日本九州大学常用斜面橡皮塞法保存，此法主要是利用低湿和缺氧来保藏菌种。当菌种接种于LB斜面30℃培养72小时后，倾入已灭菌的液体石蜡至完全淹没斜面为止。 菌膜保藏法： 该法存活力高，便于邮寄，使菌种保藏微型化。把菌种膜片干燥后装入无菌乙烯薄膜，菌种袋封口后即可邮寄。

48 3) 研究和保存机构 目前国内外许多研究和生产单位均保藏有大量Bt菌种。
美国Ecogen公司保存9000株左右Bt菌，美国农业部Brownsville Lab保存了HD-X系列，俄亥俄州州立大学保存的大量的突变株。 法国巴斯德研究所昆虫病原研究中心亦是WHO昆虫病原细菌参考中心，保藏有3500株芽孢杆菌。

49 英国温室作物研究所H.Burges博士以HB-X系列编号保藏。
日本九州大学Aizawa和Ohha博士及北海道大学IIZUKA教授均保存有较多的Bt资源。 国内的华中农大农业部微生物重点实验室芽孢杆菌研究室、中国林业科学院、湖北农科院Bt研究及开发中心、中国科学院武汉病毒所、福建农林大学生物中心均保存有一定数量的Bt菌株。

50 (4) 杀虫作用机理 1） Bt毒素：内毒素：伴孢晶体；外毒素：分泌到体外的代谢物 甲体外毒素(-exotoxin)：
蛋白质先于晶体产生，口服使虫中毒，被热破坏(120℃，20min) 乙体外毒素(-exotoxin)： 热稳定性毒素(120℃，15min)，核苷酸，溶于水，先于晶体产生 丙体外毒素：酶

51 丁体内毒素(-exotoxin)： 晶体毒素，伴孢晶体，蛋白质晶体，主要杀虫毒素。 与芽孢同时产生，不溶于水或许多有机溶剂，能溶于碱性溶液。 热敏性毒素，但具有一定耐热性。65℃中保持1h，80~130℃ 30min破坏。

52 2) 杀虫作用机理 ① 晶体毒素的致病机理 昆虫取食后，内毒素首先在昆虫中肠水解为具有活性的小分子肽，通过围食膜与中肠上皮细胞上的受体结合。昆虫中肠被麻痹，停止取食。 毒素插入膜内并引起损伤或穿孔。这种穿孔破坏了钾离子梯度平衡，从而导致细胞表面突起膨胀，坏死，使昆虫中肠的完整性受到破坏，其中的内含物渗漏到体腔中。 芽孢萌发可以使昆虫发生致命的“败血症”而死亡。

53 类型1：家蚕、榨蚕、烟草天蛾、番茄天蛾 食入毒素，立即停止取食，20~30min肠道麻痹，1~7h全身麻痹而亡。 肠道上皮破坏，内含物渗入血腔。肠道pH值下降，血腔pH值升高。肠通透性失调，特别是钾离子。

54 类型2：天幕毛虫、美国白蛾等大多数敏感的昆虫
食入毒素，数小时内肠道麻痹，停止取食，2~4天死亡。 肠道内含物不渗入血腔，无全身麻痹。 类型3：地中海粉螟 单独芽孢或晶体，或两者混合，都不能杀死所有个体。 类型4：甘蓝夜蛾、小地老虎、黄地老虎 对内毒素不敏感。

55 (5) 安全性 国内外进行了一系列大量而细致的试验，证明对脊椎动物是安全的。Bt已在9种鱼、鸡、鼠、猪、兔、猴、牛、鸟、鸭、鹅等动物以至于人体上进行了口服、饲喂、吸入、注射等一系列试验，均未发现中毒症状，故WHO和FAO极力推荐生产应用。 使用Bt制剂仍需慎重：产β-外毒素菌株对哺乳动物有害。 Bt近缘种有能产生食物毒素、引起腹泻、呕吐、恶心的蜡螟芽孢杆菌和引起人、畜炭疽病和肺损伤和肠道感染的炭疽芽孢杆菌；以色列亚种溶液的伴孢晶体毒素对动物有毒。 对于Bt制剂的开发，从长期的眼光来考虑仍需注意安全性问题。

56 (6) 毒力评价标准与质量标准 早先，Bt质量是以芽孢含量为标准的。但不同制剂的毒力并不与芽孢的含量成正相关。一些芽孢含量相等的制剂其毒力并不相同，有时芽孢含量高的制剂毒力反不如芽孢含量低的制剂。 产生这种情况的原因是因为Bt杀虫活性是由晶体毒素、芽孢及其他因素共同决定的，而且晶体是主要的杀虫因素，芽孢是较次要的杀虫因素，单是芽孢含量高并不能决定毒力也高。 另外，芽孢数随产品贮存时间延长而降低，特别是液剂下降速度更快。所以发展了用生物测定的方法来检测制剂的毒力（IU单位，国际标准单位）。

57 法国巴斯德研究所生产的E-61作为国际标准制剂，该剂的毒力效价定为1000IU(国际单位)，试虫为地中海粉螟。
1966年国际昆虫病理和微生物防治学会建议： 法国巴斯德研究所生产的E-61作为国际标准制剂，该剂的毒力效价定为1000IU(国际单位)，试虫为地中海粉螟。 其它BT制剂用生测方法与E-61比较毒力，用IU/mg来毒力效价。 样品的毒力效价=(标准品的LC50/样品的LC50)*标准品的毒效(IU/mg)

58 (7) 生产 中国在农业部的注册厂家已超过76家(2010年)，年产量达20-30万吨，在国内的东西南北地区均有建厂。
自1938年法国第一个产品Sporeine面世以来，60年代后，美国、前苏联、加拿大、捷克、比利时、法国、德国、罗马尼亚、朝鲜、芬兰、泰国等国均相继办厂。 中国在农业部的注册厂家已超过76家(2010年)，年产量达20-30万吨，在国内的东西南北地区均有建厂。 目前Bt生产主要有液体深层发酵和半固体发酵两种。生产工艺主要牵涉到菌种、培养基和培养条件，后处理工艺、防止噬菌体污染等几方面。

59 产品登记要求： 综合WHO、Burges(1982)、SIP协议、EPA（美国环保署）、EEC（欧洲经济共同体）等方面法规，在产品登记时应提供以下10个方面的材料: ① 产品资料:名称、类型、含菌数、稀释剂、惰性成份、保护剂 ② 细菌鉴定:学名、俗名、鉴定标准及程序 ③ 细菌生物学特性:目标寄主种类、病原性、应用历史、最高、适宜温度、天然发生、地理分布、寄主范围、稳定性

60 ④ 质量检验:标准化方法等 ⑤ 应用和应用方法:农业、园林、森林保护种类、控制害虫阶段、应用时间、方法和比例 ⑥ 有效性的实验数据:室内、野外、田间、抗性资料 ⑦ 残留 ⑧ 对哺乳动物感染和毒性 ⑨ 对人的影响 ⑩ 对环境和野生动物的危险

61 (8) 剂型 液剂：100亿个芽孢/克悬浮剂、乳剂、水剂和油剂等
(8) 剂型 液剂：100亿个芽孢/克悬浮剂、乳剂、水剂和油剂等 使用普遍和方便的剂型，是经发酵后收获到的芽孢和晶体以水悬液保存，再加适当的展着剂，粘着剂及防腐剂而成。除水剂外，尚有乳剂。乳剂是将离心收集到的芽孢、晶体加入乳化剂中均匀混合而成。此外，还有以油类作为载体的油剂，它多用于空中喷雾防治森林害虫。 液剂保存时间不太长，一般3-6个月内不会沉淀失效。

62 2) 可湿性粉剂： 100亿个芽孢/克可湿性粉、16000国际单位WP
其用途是制成悬液喷雾用，为此，产品中加入了湿润剂。其作用在于使菌剂的微小颗粒有亲水性，能在水中很好地溶化和分散，并使菌悬液能在植物表面展着和附着。 该产品是目前主要产品，保存两年质量不变，包装、运输方便，杀虫效果稳定，用于低矮作物(如蔬菜类)或潮湿地区效果很好。

63 3) 胶囊剂 可湿性粉剂赋形后的颗粒外边包以易溶于水的胶囊，这样既可防止阳光、高温和干燥对芽孢和晶体的伤害和破坏，又可使毒性成分在较长时间内逐渐释放出来，在较长时间内保持毒效。保护剂可防止紫外辐射的伤害作用。

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66 应用 1) 蔬菜 2) 棉花 3) 水稻 4) 玉米、高梁、小麦 5) 果树、茶叶、花卉 6) 烟草和油料害虫 7) 森林害虫
8) 仓贮害虫 9) 卫生昆虫

67 (10) 注意事项 1) 药效缓慢，提前2~3天用药，第二次施药 2) 不能与内吸性有机磷农药或杀菌剂混用 3) 对家蚕毒力强，养蚕地区慎用
4) 防潮、防晒，贮于阴凉干燥处 5) 菌液随配随用，以免孢子荫发

68 ——由苏云金杆菌蜡螟变种发酵、加工成的制剂
2、青虫菌——蜡螟杆菌三号 ——由苏云金杆菌蜡螟变种发酵、加工成的制剂 1）作用特点： 胃毒作用。昆虫食入后很快停止进食。芽孢在虫体内发芽，进入体腔，利用昆虫体液大量繁殖，使虫得败血症而死。病虫粪便和死虫再传染其他害虫，引起流行病，从而控制害虫危害。 杀虫范围：主要对鳞翅目害虫有效。 杀虫速度慢，施药后一般2~3天见效，有时要4~5天。 因是活芽孢起杀虫作用，故药效受环境影响大。

69 2) 制剂 100亿活芽孢/克青虫菌粉剂 辽宁生物农药厂 3) 毒性 对家蚕有毒 对人畜无毒 对蜜蜂安全 对植物安全 不污染环境

70 以喷雾、喷粉、泼浇方式施用，或拌毒土及制成颗粒剂撒施
4) 使用方法 可防治菜青虫、大豆造桥虫、烟青虫、玉米螟、松毛虫、刺蛾、舟形毛虫、稻纵卷叶螟、稻苞虫、粘虫、小菜蛾、棉铃虫、灯蛾、瓜绢螟等农林害虫。 每公顷用100亿个/克的菌粉750—1500克 以喷雾、喷粉、泼浇方式施用，或拌毒土及制成颗粒剂撒施

71 5) 注意事项 菌粉应贮存于干燥阴凉处，避免水湿、曝晒、雨淋等。 禁止在养蚕区使用。 杀虫击倒速度比化学农药慢，在施药前应做好病虫测报，掌握在卵孵化盛期及二龄前期喷药。为提高杀虫速度。可与一般性杀虫剂混合使用。但不能与化学杀菌剂混用。 喷雾时可以加入0.5-l％的洗衣粉作粘着刺，以增加药液展着性。 药效易受气温和湿度条件的影响，叶面有一定的湿度时可以提高药效。喷雾最好选择傍晚或阴天进行。喷粉在清晨叶面有露水时进行为好，中午强光条件下会杀死活孢子，影响药效。 喷雾要力求均匀。

72 3、苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种（B.t.k.） 来源：该菌种在土壤、面粉场、仓库以及其他害虫聚集的 环境中普遍存在。
使用范围：主要用于蔬菜、果树及森林鳞翅目害虫的防治。

73 4、苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种（B.t.a.） 来源：产生于自然界土壤中。血清型H-7，SA-2菌株筛选 的一种杀虫剂。
生物活性：具有胃毒作用。 使用范围：用于防治粮食作物、水果及其他树木、蔬菜和 棉花作物上的鳞翅目害虫。由于控制对B.t.k.产生抗性的害 虫具有更好的防治效果而得到发展。

74 5、苏云金芽孢杆菌以色列亚种（B.t.i.） 来源：产生在自然界的土壤中。血清型H-7，SA-3菌株筛选 的一种杀虫剂。
生物活性：具有胃毒作用。从B.t.i.得到的晶体包涵体只能 在pH值（＞11）下才能完全溶解。其产生的5种不同杀虫蛋 白都对双翅目的昆虫具有活性。 使用范围：用于水、污水的过滤及在温室中防治双翅目害虫， 如蚊子和蚋的幼虫等。

75 6、苏云金芽孢杆菌拟步甲亚种（B.t. t.） 来源：广泛存在自然界土壤中，在昆虫中含量非常高。
生物活性： B.t. t.只产生一种73kDa的杀虫蛋白。对昆虫 中肠超微结构的影响和其他多数毒素的影响一样。成虫和 幼虫对该产品都敏感。 使用范围：用于茄科作物，主要是马铃薯上一些鞘翅目害 虫的防治，特别用于科罗拉多马铃薯甲虫的防治。

76 7、苏云金芽孢杆菌日本亚种（B.t. j.） 来源：存在自然界土壤中，日本人首次从土壤中分离得到。
生物活性：该菌株除了对甲虫有特效和对草食性土壤害虫 控制效果非常好外，也对鳞翅目害虫有一定效果。作用机理 与B.t.k.一样。 使用范围：用于防治草坪、观赏植物等的土栖鞘翅目害虫。

77 8、杀螟杆菌——Bacillus sp. —— 虫状芽孢杆菌
从我国染病稻蝗虫体上分离得到的蜡状芽孢杆菌群，能在多种人工培养基上培养。最适pH值为中性到弱碱性。

78 1）作用特点： 胃毒作用兼有触杀作用。进入昆虫体内后产生毒素和芽孢，麻痹消化系统，使之停止取食，并很快破坏中肠壁，使昆虫死于饥饿和败血症。 孢子在形成过程中，消耗大量组织和器官，同样杀死昆虫

79 2) 制剂 100亿个活芽孢/克杀螟杆菌可湿性粉剂 上海西郊农药厂 3) 毒性 对家蚕有或柞蚕致病力强 对人畜无毒 对害虫天敌安全 对植物安全 不污染环境

80 4) 使用方法 稻苞虫、稻纵卷叶螟、菜青虫：50~100g，*1000~1500倍 棉铃虫、粘虫：50~100g，*1000~1500倍 玉米螟：50~80g，1500~2000倍，灌心叶。 *200~300倍，混土撒施 果树害虫：50~80g，1500~3000倍 小菜蛾、豆天蛾等：100~150g，300倍药液 0.5kg+1.5kg细土，拌匀后撒毒土 死虫再利用：收集黑烂虫，于纱袋中，于水中揉搓。 50~100g虫，加水50~100kg，喷雾.

81 5) 注意事项 严禁桑园应用：0.1%漂白粉消毒 效果慢，提前用药，卵期或低龄期用药较好 温度20度以上用药时较好，温度越高，效果越好，作用越快 不与内吸性有机磷农药或内吸性杀菌剂混用 干燥阴凉处贮存，避潮及曝晒。

82 9、乳状芽孢杆菌——Bacillus popillae.
—— 日本金龟子杆菌 从染病的日本金龟子体上分离得到的专化性较强的昆虫病原细菌。对50多种金龟子幼虫有活性。 革兰氏阳性，菌体形成芽孢和伴孢晶体，只能在寄主体内生长发育，形成营养体和芽孢。 芽孢抗干燥能力强，在土壤中可存活多年。 蛴螬染病后呈乳白色，故称乳状病。

83 1）作用特点： 对蛴螬起胃毒作用。经口器进入蛴螬体内，在中肠萌发，生成营养体，穿过肠壁进入血腔，在血淋巴中大量迅速繁殖。破坏虫体各组织器官，虫体充满芽孢而死。 长效细菌杀虫剂。 病虫死前可大量活动，扩大细菌的感染面

84 2) 制剂 活体生产：通过在昆虫活体内繁殖获得芽孢，再将虫体干燥粉碎，加入填料制成粉剂。 1亿活芽孢/g粉剂。 湖北仙桃化工厂、河南焦作生物农区厂

85 3) 使用方法 250g粉剂拌土或拌麦糠，撒入1亩地中，防治效果为49~85%.

86 10、 球形芽孢杆菌 球形芽孢杆菌（B.s.）是Kellen等人1965年从美国的蚊子幼 虫上分离的。
生物活性：其作用方式和苏云金杆菌菌株一样。在蚊子1~4 龄幼虫期均可使用，中毒症状通常在取食1h后出现。其即使 在有机物含量高的水环境中也能有效控制蚊子幼虫。强光照 可使稳定性下降，弱碱性条件下会迅速破坏。 使用范围：蚊子幼虫。

87 其芽孢萌发过程中B.s.可产生一种伴胞晶体， 晶体中含有一些对蚊类幼虫有毒的蛋白。库蚊属的 幼虫对这些蛋白特别敏感，伊蚊对其则有很强的抗 性，按蚊介于两者之间。

88 通过对球形芽孢杆菌晶体毒素组分鉴定和DNA序列分析 发现存在51kDa和42kDa两种蛋白，是从一个双顺反子转录 单元分别翻译而成。伴孢晶体被蚊类幼虫吞咽后，上述蛋白 在碱性肠腔内分别水解为43kDa和39kDa的蛋白。通过电镜 观察表明毒害作用最初是发生在胃盲囊的细胞，然后中肠后 部形成空泡，线粒体膨胀。同时试验表明只有与51kDa蛋白 结合时42kDa的蛋白才能表现出毒性。 B.s.的局限性在于寄主范围小；不同种的蚊种对其敏感 性差异显著，主要表现为受体和作用位点不同；英法等国已 经产生田间抗性。

89 11、苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种δ-内毒素胶囊 生物活性：从鲇泽亚种得到的编码基因通过对荧光假单胞 菌的改造，改造后的细菌表达δ-内毒素。可以通过发酵大量 生产菌体，杀死后通过交联剂使细菌细胞壁与囊壳结合制成 的胶囊产品。 使用范围：用于防治玉米、花生、大豆、棉花、果树、烟 草、蔬菜、葡萄及草莓等作物上的鳞翅目幼虫。在作物收获 前后都允许使用。

90 12、苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种δ-内毒素胶囊
来源：通过对苏云金杆菌血清型H-3a，3b内毒素基因改造 的荧光假单胞菌生产。菌体被杀死后制成包裹有杀虫蛋白的 微胶囊。 生物活性：产品不含活的菌体。但制成胶囊后产品性能得 到改善。 使用范围：用在蔬菜、玉米、棉花、果树、烟草、葡萄及 马铃薯等作物上可有效防治鳞翅目幼虫和某些甲虫。

91 13、 嗜虫黏质赛氏杆菌 又称为灵杆菌或神灵色杆菌，革兰氏阴性，无芽孢
生物活性：其作用方式是在虫体体腔繁殖，导致宿主败血症， 使其运动缓慢，对外界刺激不敏感，食欲减退，经常腹泻， 在1d~3d内迅速死亡。临死时幼虫全身呈鲜红色是这一类细 菌感染极其明显的特征。 使用范围：草地螟、玉米螟、黄地老虎、棉铃虫、舞毒蛾等。 有时对某一种昆虫有极强的毒力。

92 14、 梭状芽孢杆菌 是一类对毒蛾类幼虫致病专性的芽孢杆菌，包括变短梭状芽 孢杆菌和天幕毛虫梭状芽孢杆菌。
生物活性：被毛虫吞食后，经16～24h，芽孢在宿主肠道内 萌发成营养体，24h后开始形成芽孢，36h后宿主粪便中出现 病原菌的营养体和芽孢，42h即出现症状，如行动不安、呕 吐、减食、粪便稀湿、虫体缩短等，经5～6d幼虫进入濒死 状态，并维持这一状态可达4d之久，然后死亡。 这种专性病原菌只在肠道中繁殖，并不侵入体腔，而且宿主 昆虫病死后，虫尸收缩，干燥而僵化，不腐败。

93 二、细菌杀菌剂 革兰氏阳性菌 细菌杀菌剂 芽孢杆菌 假单胞菌 革兰氏阴性菌 放射土壤杆菌

94 在生长发育过程中产生多种拮抗性或竞争性的代谢产物，通过直接或间接作用达到阻碍或杀死植物病原菌的效果
大多是从植物的根围和叶围等处分离得至，对植物具有较好的亲和性，接种后易于在植物上定植，生防效果持久稳定。

95 1、假单胞菌 荧光假单胞菌：繁殖速度快，与根围适应性好 洋葱假单胞菌 恶臭假单胞菌

96 抗病机理 ①竞争作用： A营养竞争：可充分利用大量不 同种类的碳源。通过营养竞争占据有利位置，并吸收根系分泌物，从而抑制植物根部病类的发生
B位点竞争：是荧光假单胞菌在根围定殖和大量繁殖的重要机制。产生嗜铁素，通过与病原物竞争铁而使病原物受到抑制。 ②诱导植物系统抗性（ISR） 可能机制是产生抗微生物的低相对分子质量化学物质，如植物保卫素、双萜、多聚物、木质素等，并诱导一些水解酶和氧化酶 ③抗生作用 通过产生次生代谢物质抑制植物病原物的生长，目前已鉴定了许多抑制病害的抗生素，如2,4-二乙酰藤黄素、藤黄绿脓菌素、吡咯素、1-羧基吩嗪、嗜铁素、卵菌素、氢氰酸等 一种微生物在不同根围环境中竞争能力的强弱，首先取决于能否有效地利用土壤中的碳源、氮源、硫、磷和一些微量元素

97 应用 应用于控制一些农业生产中危害严重的土传作物病害，例如棉花幼苗猝倒病、棉花立枯病、小麦全蚀病、马铃薯软腐病、番茄青枯病、烟草根黑腐病和桃树根癌病等

98 2、枯草芽孢杆菌 是内生芽孢的革兰氏阳性菌，根据菌落的形态以及形成芽孢的特点而命名为枯草芽孢杆菌。
在芽孢形成初期分泌各种抗菌物质，对病原真菌有特异性的防治作用。

99 抗病机制 拮抗作用：指微生物产生抗菌物质，抑制有害病原菌生长或直接将病原菌杀死。枯草芽孢杆菌产生的抗菌物质主要通过溶解细胞壁或细胞膜，造成原生质泄露，使菌丝断裂或畸形，同时抑制孢子萌发。有些抗菌物质还能在植物根部形成一层生物膜，该膜能保护植物根部免受病原菌的入侵。 结构不同的抗菌物质抑菌机理不同，而某些菌株同时分泌的多种结构相似的抗菌物质可表现出协同的抑菌效果。

100 竞争作用：以位点竞争为主，少数具有营养竞争。植物附生或内生芽孢杆菌有很好的繁殖和定殖能力，对维管束和土传病害有很好的防效。
诱导植物抗性作用：是枯草芽孢杆菌生物防治的重要机制之一。如产生与植物抗性蛋白合成基因表达相关的信号蛋白，诱导植物抗性。

101 应用 可通过浸种、灌根、涂叶等方法接种进入非自然宿主植物体内定殖。
在植物病害如水稻纹枯病、玉米纹枯病、玉米枯萎病、玉米小斑病、洋葱白腐病、甜菜猝倒病、绿豆猝倒病、苹果幼苗根腐病等的防治应用中取得了卓著成效

102 3、地衣芽孢杆菌 是一种内生芽孢的革兰氏阳性菌，是土壤和植物微生态优势种群之一。
可产生多种抗生素，对多种动植物及人类病原菌有很好的抑制作用。 是植物病害防治中具应用潜力的细菌之一。

103 抗病机制 主要是通过所产生的抗菌物质发挥作用。这些抗菌物质主要有蛋白质如抗菌蛋白、多肽类、几丁质酶和非蛋白类如苯乙酸
同时具备位点竞争能力和诱导植物产生抗性的能力。

104 应用 对番茄灰霉病、烟草黑胫病、棉花枯萎病和黄萎病都的较好的防效。 对番茄灰霉病的田间防效与化学杀菌剂腐霉利相当。

105 三、细菌杀线虫剂 根结线虫天敌细菌目前报道的主要是巴氏杆菌属的三个种，其中最有潜力的研究最多的是穿刺巴斯柄菌(Pasteuria penetrans)。 迄今为止，全世界共有116属的323种线虫可作为穿刺巴氏柄菌的宿主。

106 穿刺巴氏柄菌生活史 附着在 线虫体壁 土壤中的内生孢子 进入植物根中 连同腐烂的 植物根和线虫 4-10d 内生孢子发芽、 芽管出现
穿透线虫体壁 芽管发育 成菌落

107 由于缺乏大规模生产的有效技术，穿刺马氏杆菌的商品化受到了限制，目前大量生产该菌的方法是在温室植物的线虫中繁殖，药效试验也大多数是在温室盆栽中进行。

108 四、细菌杀鼠剂 肉毒梭菌为厌养性梭状芽孢杆菌，能产生剧烈的细菌外毒素，即肉毒毒素。该外毒素是一种蛋白质，根据其抗原可分为A，B，C，D，E，F和G等7型。 一般一种菌株只产生一种神经毒素，动物和人类对不同的肉毒梭菌神经毒素的敏感性有很大差异： A和B主要引起人类、马中毒 C型引起牛、羊、水貂、禽类中毒 D型引起牛羊中毒 E型中毒多发生于鱼类 F和G型较少见

109 应用 肉毒毒素在草原农田进行了大量灭鼠应用，目前应用较为广泛的生物毒素灭鼠制剂为C型肉毒杀鼠素，应用于青海、甘肃、四川、新疆、西藏、辽宁、内蒙古、河北、陕西、江苏、福建等省的部分草场和农田，灭鼠效果良好。

110 思考题 1、细菌农药有什么特点？ 2、细菌杀虫剂有哪几种？ 3、苏云金杆菌的抗虫机制是什么？ 4、细菌抗菌剂有哪几种？各自的抗菌机制是什么？
5、简述最有应用前景的细菌杀线虫剂和杀鼠剂。