第四章 样品的全息制备 1 生物大分子的制备 2 蛋白质（酶）的分离纯化.

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1 第四章 样品的全息制备 1 生物大分子的制备 2 蛋白质（酶）的分离纯化

2 1 生物大分子的制备 1.1 概述 1.2 生物大分子制备的前处理 1.3 生物大分子的分离纯化 1.4 样品的保存

3 1.1 概述 　　在生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，如果没有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前提，结构与功能的研究就无从谈起。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作。

4 与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点：
　　与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点： ⑴ 生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。 ⑵ 许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多、流程长。 ⑶ 许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。 ⑷ 生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。 ⑸ 生物大分子中的各种具体物质的组成比例不同。

5 生物大分子的制备通常可按以下步骤进行： ① 确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。
② 建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。 ③ 通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。 ④ 生物材料的破碎和预处理。 ⑤ 分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。 ⑥ 生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。 ⑦ 产物的浓缩、干燥和保存。

6 分析测定的方法主要有两类： 即生物学和物理、化学的测定方法。 生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等； 物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法 (紫外/可见、红外和荧光等分光光度法)、电泳法、以及核磁共振等。 实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。

7 要了解生物大分子的物理、化学性质主要有：
① 在水和各种有机溶剂中的溶解性。 ② 在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。 ③ 固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 ④ 各种物理性质：如分子大小、穿膜能力、带电情况、在电场中的行为、离心沉降时的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。 ⑤ 其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。 ⑥ 对其他生物分子的特殊亲和力。

8 　　生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。
各种方法的基本原理可以归纳为两个方面： ①利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等； ②将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等。 　　目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是 电泳、层析和高速与超速离心。

9 1.2 生物大分子制备的前处理 1.2.1 生物材料的选择 　　制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。 　　选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。 　　动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。 　　植物要先去壳、除脂。 　　微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。 　　生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。

10 1.2.2 细胞的破碎 　　不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。 (1) 机械法： ① 研磨：将剪碎的动物组织或其它生物材料置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨成匀浆。 ② 组织捣碎器：这是一种较剧烈的细胞破碎方法，通常可先用家用食品加工机械将组织打碎，然后再用10000～20000r/min的内刀式组织捣碎机（即高速分散器）将组织的细胞打碎。

11 ②超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。
(2) 物理法： ①反复冻融法：将待破碎的细胞冷至-15℃到-20℃，然后放于室温（或40℃）迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。 ②超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。 ③压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105 Pa～2000×105 Pa 的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。 ④冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。

12 (3) 化学与生物化学方法： ①自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的 pH 和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。 ②溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。 ③酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解。 ④有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基磺酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。

13 1.2.3 生物大分子的提取 　　“提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。 影响提取的因素主要有： 　　目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小； 　　由固相扩散到液相的难易； 　　溶剂的pH值和提取时间等。 通常： 　　极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂； 　　碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂； 　　温度升高，溶解度加大； 　　远离等电点的pH值，溶解度增加。 注意：提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和 保持其生物活性。

14 ⑴ 水溶液提取： 　　蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。用水溶液提取生物大分子应注意的几个主要影响因素是： 1) 盐浓度 (即离子强度)： 　　离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，有些物质，如DNA-蛋白复合物，在高离子强度下溶解度增加。 　　绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶”现象。盐溶现象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。 　　为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度(如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4)，可以增加溶液的极性。

15 2) pH值：蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值有关。过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=6～8范围内，提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。
3) 温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在0～5℃的低温操作。 4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：加入抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶及核酸的降解作用。 5) 搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物溶解，一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等物质的变性失活。因为一般蛋白质都含有相当数量的巯基，有些巯基常常是活性部位的必需基团，若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键，导致酶活性的丧失。在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止巯基氧化。

16 ⑵ 有机溶剂提取 一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。
　　一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。 　　常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性。 　　有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼有除去杂质提高纯化效果的作用，如胰岛素的提取即是如此。

17 1.3 生物大分子的分离纯化 　　由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。 　　为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。 　　常用的分离纯化方法和技术有：沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。

18 1.3.1 沉淀法 　　沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相而析出的过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅适用于实验室中，也可用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。 　　 沉淀法 的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。

19 在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：
⑴中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 ⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。 ⑶选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定 pH 值下易变性的杂蛋白。 ⑷等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。 ⑸有机聚合物沉淀：是发展较快的一种新方法， 主要使用聚乙二醇(Polyethyene glycol, PEG)作为沉淀剂。

20 中性盐沉淀（盐析法） 　　在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。 　　盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是： ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 ②操作简单、安全。 ③对许多生物活性物质具有稳定作用。

21 ⑴ 中性盐沉淀蛋白质的基本原理 　　蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的 -COOH、 -NH2 和 -OH 都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。盐析示意图如下页“图 ”所示。

22 盐析原理示意图

23 ⑵ 中性盐的选择 常用的中性盐中最重要的是(NH4)2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：
1)溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下(0～4℃)进行。由下表可以看到，硫铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类：   几种盐在不同温度下的溶解度 (g/100ml水) 0℃ ℃ ℃ ℃ (NH4)2SO Na2SO NaH2PO 2)分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了4倍。 3)不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用　有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的(NH4)2SO4保存可达数年之久。 4)价格便宜，废液不污染环境。

24 ⑶ 盐析的操作方法 　　最常用的是固体硫酸铵加入法。将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。 　　在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法。 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录中查出。

25 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。
⑷ 盐析曲线的制作 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。 蛋白质量(mg)或酶活力 硫铵饱和度

26 ⑸盐析的影响因素 1) 蛋白质的浓度：高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀，若蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉淀作用。低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降低。较适中的蛋白质浓度是2.5～3.0％，相当于25～30mg/mL。 2) pH值对盐析的影响：在等电点处溶解度小，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。 3) 温度的影响：对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。一般情况下，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在0～4℃下操作，以避免活力丧失。

27 有机溶剂沉淀法 基本原理： 　　有机溶剂对于许多蛋白质 (酶)、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其原理主要是： ①降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。 ②由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。

28 有机溶剂沉淀法的优缺点： 优点： ①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。
②沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛的应用。 缺点： ①对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。 ②有机溶剂的选择和浓度的计算 　　 用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。

29 有机溶剂沉淀的影响因素： ①温度：多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此必须预冷，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。 ②样品浓度：低浓度样品回收率低，要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀。高浓度样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大。通常使用5～20mg/mL的蛋白质初浓度为宜。

30 ③pH值：选择在样品稳定的pH值范围内，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。
④离子强度：盐浓度太大或太小都有不利影响，通常盐浓度以不超过5％为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的２倍体积为宜，少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。 　　沉淀所得的固体样品，如果不立即溶解进行下一步分离，则应尽可能抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性。

31 选择性变性沉淀法 　　这一方法是利用生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯。 ⑴热变性 　　利用生物大分子的热稳定性差异，加热升高温度 　使非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。 ⑵表面活性剂和有机溶剂变性 　　　使那些对表面活性剂和有机溶剂敏感性强的杂蛋 　白变性沉淀。通常在冰浴或冷室中进行。 ⑶选择性酸碱变性 　　利用对pH值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀。 　通常是在分离纯化流程中附带进行的分离纯化步骤。

32 等电点沉淀法 　　利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。 　　由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。 　　此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。

33 有机聚合物沉淀法 　　有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。其中应用最多的是“聚乙二醇”【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n＞4)】(Polyethylene Glycol，简写为PEG)，它的亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为6000～20000的 PEG。 本方法的优点是： ①操作条件温和，不易引起生物大分子变性。 ②沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子。 ③沉淀后有机聚合物容易去除。

34 1.3.2 透析 　　在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析技术。 　　透析只需要使用专用的半透膜即可完成。保留在透析袋内未透析出的样品液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。截留分子量 (MwCO) 通常为10KD左右。 　　用 1％ BaCl2 检查 (NH4)2SO4，用1％AgNO3 检查NaCl、KCl等。

35 1.3.3 超滤 　　超过滤即超滤，是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。 　　超滤可广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化。

36 受压的生物大分 子和小分子溶液 浓缩的生 物大分子 小分子溶液 超滤工作原理示意图

37 　　根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径，可将超滤分为微孔过滤、超滤和反渗透三种。
　　微孔过滤所用的操作压通常小于4×104Pa，膜的平均孔径为500埃～14微米（1微米＝104埃），用于分离较大的微粒、细菌和污染物等。 　　超滤所用操作压为4×104 ～7×105Pa，膜的平均孔径为10-100埃，用于分离大分子溶质。 　　反渗透所用的操作压力比超滤更大，常达到35×105～140×105Pa，膜的平均孔径最小，一般为10埃以下，用于分离小分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等。

38 　　超滤技术的优点是操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温和，与蒸发、冰冻干燥相比没有相的变化，而且不引起温度、pH的变化，因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。
　　在生物大分子的制备技术中，超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。 　　超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到10～50％的浓度。

39 超滤技术的关键是膜。 　　常用的膜是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成。近年来发展了非纤维型的各向异性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在pH1-14都是稳定的，且能在90℃下正常工作。超滤膜通常是比较稳定的，能连续用1～2年。 超滤膜的基本性能指标：水通量 (cm3/(cm2·h))；截留率(以百分率％表示)；化学物理稳定性(包括机械强度)等。 超滤装置由若干超滤组件构成。分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型。 　　由于超滤法处理的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易粘附和沉积于膜表面上，造成严重的浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键的问题，要克服浓差极化，通常可加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。

40 1.3.4 冰冻干燥 　　冰冻干燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一，因为大多数生物大分子分离纯化后的最终产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固体产品，最好的办法就是冰冻干燥，因为生物大分子容易失活，通常不能使用加热蒸发浓缩的方法。 　　冰冻干燥是先将生物大分子的水溶液冰冻，然后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉。冰冻干燥的原理可用溶剂的三相点相图来说明，见下图：

41 三相点相图

42 　　当温度在三相点O以下，将压力降至OC线以下，溶剂（通常是水）就可以由固相直接升华为汽相。
冰：-40℃ 上方蒸汽压为0.1mmHg， -60℃ 上方的蒸汽压为0.01mmHg。 　　1克0℃的冰变成0℃的蒸汽需吸热580千卡，容器外壁上会挂霜。 突出的优点： ① 样品不起泡，不暴沸。 ② 得到的干粉样品不粘壁，易取出。 ③ 冰干后的样品是疏松的粉末，易溶于水。

43 适于冰冻干燥的样品溶液： ① 样品要溶于水，不含有机溶剂，否则冰点降低，样品易融化，起大量泡沫，使样品变性，污染真空泵油。 ② 样品要予先脱盐，否则冰冻后易融化。 ③ 样品缓冲液在冰冻时pH可能会有较大变化，需加入pH稳定剂，如糖类和钙离子等。 ④ 样品溶液的浓度不要过稀，例如蛋白质的浓度不低于15 mg/mL 为宜。

44 装样品溶液的冰冻干燥容器： ⑴ 用各种尺寸的培养皿盛样品溶液，液层不要太厚，可以使用安瓿瓶和青霉素小瓶。用烧杯时液层厚度不要超过2 cm。 ⑵ 冻干稀溶液时会得到很轻的绒毛状固体样品，容易飞散而损失和造成污染，因而要用刺了孔的薄膜或吸水纸包住杯口，刺的孔不要过小过少，否则会影响冻干速度。 ⑶ 溶液冰冻： 　　可用干冰-乙醇低温浴速冻，边冻边旋转形 成很薄的冰冻层，可以大大加快冻干的速度。

45 ⑷ 冻干： ① 样品全部冻干前，不要轻易摇动，以防水蒸汽冲散冻干的样品粉末。 ② 若外霜消失，则说明样品已冻干，或是仅剩样品中心的小冰块，再稍加延长冻干时间即可。 ③ 冻干后要及时取出样品，以免样品在室温下停留时间过长而失活。 ④ 停真空泵时要先放气，以免泵油倒灌。放气时要缓慢，以免气流冲散样品干粉。 ⑤ 样品冻干后要及时密封冷藏，以防受潮。 ⑥ 真空泵要经常检查油面和油色，油面过低和油色发黑，则需换油。

46 1.3.5 分离纯化方法的选择 制备生物大分子的方法可以粗略地分类如下：
① 以分子大小和形态差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。 ② 以溶解度差异为依据的方法：盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。 ③ 以电荷差异为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。 ④ 以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等。

47 1.3.5.1 样品的早期分离纯化 (1) 特点： ①粗提取液中物质成份十分复杂。 ②欲制备的生物大分子浓度很稀。
③物理化学性质相近的物质很多。 ④希望能除去大部分与目的产物物理化学性质差异大的杂质。 (2) 对所选方法的要求： ①要快速、粗放。 ②能较大地缩小体积。 ③分辨力不必太高。 ④负荷能力要大。

48 (3) 可选用的方法： 吸附； 萃取； 沉淀法 (热变性、盐析、有机溶剂沉淀等)； 离子交换（批量吸附、胖柱交换）； 亲和层析等。

49 1.3.5.2 样品的晚期分离纯化 (1) 可选用的方法： (2) 要注意的一些问题：
　　吸附层析、盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、等电聚焦制备电泳、制备HPLC等。 (2) 要注意的一些问题： ①盐析后要及时脱盐。 ②用凝胶过滤时如何缩小上样体积，因为凝胶层析柱的上样体积只能是柱床体积的1/10～1/6，也可以使用串联柱以加大柱床体积。 ③必要时也可以重复使用同一种分离纯化方法，例如：分级有机溶剂沉淀、分级盐析、连续两次凝胶过滤、离子交换层析等。

50 ④分离纯化步骤前后要有科学的安排和衔接，尽可能减少工序，提高效率。例如：吸附不可以放在盐析之后，以免大量盐离子影响吸附效率；离子交换要放在凝胶过滤之前，因为离子交换层析的上样量可以不受限制，只要不超过柱交换容量即可。 ⑤分离纯化后期，目的产物的纯度和浓度都大大提高，此时对于很多敏感的酶极易变性失活，因此操作步骤要连续、紧凑，尽可能在低温下(如在冷室中) 进行。 ⑥得到最终产品后，必要时要立即冰冻干燥，分装并写明标签，-20℃或-70℃保存。

51 1.4 样品的保存 　　生物大分子制成品的正确保存极为重要，一旦保存不当，辛辛苦苦制成的样品失活、变性、变质，使前面的全部制备工作化为乌有，损失惨重，全功尽弃。 影响生物大分子样品保存的主要因素有： ⑴ 空气：空气空气的影响主要是潮解、微生物污染和自动氧化。 ⑵ 温度：每种生物大分子都有其稳定的温度范围，温度升高10℃，氧化反应约加快数倍，酶促反应增加1～3倍。

52 ⑶ 水份：样品本身所带的水份和由空气中吸收的水份。水可以参加水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、离解和霉变。
⑷ 光线：某些生物大分子可以吸收一定波长的光，使分子活化不利于样品保存，尤其日光中的紫外线能量大，影响最大，样品受光催化的反应有变色、氧化和分解等，通称光化作用。因此样品通常都要避光保存。 ⑸ 样品的pH：保存液态样品时注意其稳定的pH范围，正确选择保存液态样品的缓冲剂的种类和浓度十分重要。 ⑹ 时间：生化和分子生物学样品不可能永久存活，不同的样品有其不同的有效期，因此，保存的样品必须写明日期，定期检查和处理。

53 现以保存蛋白质和酶为例： ⑴低温下保存：通常要保存于-5～-20℃，-70℃保存最理想。极少数酶可以耐热：如核糖核酸酶可以短时煮沸；胰蛋白酶在稀HCl中可以耐受90℃；蔗糖酶在50～60℃可以保持15～30 min不失活。还有少数酶对低温敏感，如鸟肝丙酮酸羧化酶。 ⑵制成干粉或结晶保存：蛋白质和酶固态比在溶液中要稳定的多。固态干粉制剂放在干燥剂中可长期保存。

54 ⑶在保护剂下保存： ①惰性的生化或有机物质：如糖类、脂肪酸、牛清白蛋白、氨基酸、多元醇等，以保持稳定的疏水环境。 ②中性盐：有一些蛋白质要求在高离子强度(1～4mol/L或饱和的盐溶液)的极性环境中才能保持活性。常用MgSO4、NaCl、(NH4)2SO4等。使用时要脱盐。 ③巯基试剂：一些蛋白质和酶的表面或内部含有半胱氨酸巯基，易被空气中的氧缓馒氧化为磺酸或二硫化物而变性，保存时可加入半胱氨酸或巯基乙醇。

55 2 蛋白质（酶）的分离纯化 2.1 酶活性测定 2.2 酶溶液制备 2.3 酶分离纯化的基本过程 2.4 根据分子大小轻重建立的分离纯化方法
2 蛋白质（酶）的分离纯化 2.1 酶活性测定 2.2 酶溶液制备 2.3 酶分离纯化的基本过程 2.4 根据分子大小轻重建立的分离纯化方法 2.5 调节溶解度的分离方法 2.6 按电荷的正负性设计的分离方法 2.7 根据亲和作用建立的纯化方法 2.8 根据稳定性的差异建立的分离纯化方法 2.9 蛋白质（酶）的高效液相色谱分离分析法

56 酶的分离提纯包括三个基本环节： 抽提：即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液； 纯化：即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；
制剂：即将酶制成各种剂型。 根据酶本身的特性，在分离纯化工作中必须注意下列问题: (1) 要注意防止酶的变性失活. (2) 酶的分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能的除去，因此，在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈”的手段。此外，由于酶和它的底物、抑制剂等具有亲和性，当这些物质存在时．酶的理化性质和稳定性发生了一定变化，从而提供了更多条件和方法可供采用。 (3) 酶具有催化活性。检测酶活性，跟踪酶的来龙去脉，为选择适当方法和条件提供 直接依据。在工作过程中，从原料开始每步都必须检测酶活性．一个好的方法和措施会使酶的纯度提高倍数大，活力回收高，同时重复性好。

57 2.1 酶活性测定 　　酶活力 (Enzyme Activity) 也称酶活性，指酶催化一定化学反应的能力。酶活性是研究酶的特性、分离纯化以及酶制剂生产和应用时的一项不可缺少的指标。酶活力是用在一定条件下，它所催化某一反应的反应初速度来表示。酶反应速度（指初速度）可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示，其单位为mol/s。 2.1.1 酶的活力单位 2.1.2 摩尔催化活性/分子活性和转化率（催化中心活力）

58 摩尔催化活性 (Molar Catalytic Activity) 表示在单位时间内，酶分子中每个活性中心转换的分子数目。根据米氏方程：
Vmax=K0[E] K0=Vmax/[E] K0即为转换率 (也用Kcat表示)，如果每一个酶分子只有一个催化中心，那么催化中心活性等于摩尔催化活性，如果一个酶分子有几个催化中心，那么催化中心活性等于摩尔催化活性除以n。 每种酶的转换率不同，下表列出了几种酶的转换率： 酶 转换率 (1/s) 碳酸酐酶 600,000 凝乳蛋白酶 100 乙酰胆碱脂酶 25,000 DNA聚合酶Ⅰ 5 青霉素酶 2,000 Trp合成酶 2 乳酸脱氢酶 1,000 溶菌酶 0.5

59 2.1.3 比活力 比活力 (性) (Specific Activity)是酶纯度的量度，指单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用 IU/mg 蛋白质来表示。一 般来说，酶的比活力越高，酶越纯。 2.1.4 酶活力的测定方法 　　酶活力与底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂、抑制剂的浓度以及缓冲液的种类和浓度都密切相关。酶活性测定可用终止反应法或连续反应法。 终止反应法 (Stopped Method) 　　　终止反应法是将酶反应按时间即刻完全停止，取出反应物或产物，予以分离，再确定反应物的消耗量，或产物的形成量，算出酶活性。 　　　使酶停止作用常用强酸、强碱、三氯乙酸或过氯酸，也可用 SDS 使酶失活或加热使酶变性等。 　　　产物的测定方法可用酶法、化学法或放射化学法。

60 ⑴ 酶法 酶法是用其他纯酶将产物直接或间接转变成一个可用分光光谱仪或荧光光谱仪测定的化合物。通常采用偶联法，例如葡萄糖氧化酶催化的下列反应：
　　酶法是用其他纯酶将产物直接或间接转变成一个可用分光光谱仪或荧光光谱仪测定的化合物。通常采用偶联法，例如葡萄糖氧化酶催化的下列反应： 葡萄糖 + O2 → 葡萄糖内脂 + H2O2 欲测定葡萄糖内脂和H2O2均较困难，可在该反应中加入过氧化物酶和木酚，使发生下列反应:

61 　　由于4-甲氧联酚在 435nm 波长处有光吸收峰，因此、只要测定 A435，就可知 4-甲氧联酚的量，可得H2O2的量，从而可推知酶活力。在这种方法中，偶联酶 (过氧化物酶) 必须过量，否则，将出现下图的情况。一般偶联酶量最少也应在 5 倍以上。 偶联法中偶联酶对反应速度的影响

62 再如：测定己糖激酶（或葡萄糖激酶）： 　　　葡萄糖 ＋ ATP → 葡萄糖-6-P 其偶联-指示剂为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 葡萄糖-6-P + NADP+ → 6-P-葡萄糖酸 + NADPH + H+ 这时即可测定 340nm 处光吸收的增加得到己糖激酶（或葡萄糖激酶）的活性。 酶偶联测定法可用分开的也可用连续的反应系统进行。

63 (2) 化学法 　　化学法是利用化学反应使产物转变成一个可用某种物理方法测出NH3和CO2，然后用比色法、滴定法、气体体积量度法等方法测出酶活性。 　　化学分析法的优点是：不需要特殊仪器，一般有恒温水浴、滴定管、离心机及比色计或分光光度计即可进行工作。对于绝大多数的酶，都可根据底物及产物的化学性质，设计具体的测定方法，应用范围较广。 　　缺点是：由于测定结果是根据间隔一定时间取样所得，取样过多，则总的工作量较大，取样过少，则不能得到酶反应过程的全貌，并且在实际操作过程中，取样及停止时间不容易准确控制，因此对于反应较快的酶反应，结果不够准确。 　　目前，市场上已有酶反应仪商品，可将不同时间取样、停止反应、加入反应试剂、保温、比色或其他测定方法编排成程序，自动的依次完成，并将其结果打印输出。所以现在对化学分析法必须作出新的评价。

64 ⑶ 放射性化学法 是由具有放射性的产物上测出全放射量，再算出产物量，从而计算出酶的活性。
　　是由具有放射性的产物上测出全放射量，再算出产物量，从而计算出酶的活性。 　　优点是：灵敏，可直接应用于酶活力测定，也可用于体内酶活性测定，特别适用于低浓度的酶和底物的测定。 　　缺点是：操作烦琐，样品需要分离，反应过程无法连续跟踪，并且同位素对人体有损伤作用。此外，辐射淬灭会引起测定误差，如 3H 发射的射线很弱，甚至会被纸吸收。

65 2.1.4.2 连续反应法 (Continuous Method)
　　连续反应法无需终止反应而是基于酶反应过程中的光谱吸收、气体体积、酸碱度、温度、黏度等的变化用仪器跟踪检测反应进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动力学研究，但很多酶还不能用该法测定。 ⑴ 一般的连续法：包括光谱吸收、电化学、量气、量热、旋光法等，其中以光谱吸收较为准确。光谱吸收主要指分光光度和荧光法。该法适用于一些反应速度较快的酶，自动记录仪的普遍使用使该法更容易被人们所接受。

66 几种连续法的例子 酶 反应 观测方法 乳酸脱氢酶 乳酸+NAD+ → 丙酮酸+NADH+H+ 丙酮酸+NADH → 乳酸+NAD+
340nm波长处有NADH形成 340nm波长处有NADH减少 糖苷酶(Glycosidase) Methylumbelvifery + glucoside → 糖 + Methylumbeviferone 甲基伞型酮 (Methylumbelviferone) 发出荧光 内纤维素酶 纤维素 → 低聚葡萄糖 黏度下降 己糖激酶 葡萄糖 + mgATP → 6-P-葡萄糖 + ADP + H+ pH降低，用pH计 非专一性磷脂酶 405nm波长有硝基苯酚生成

67 ⑵ 偶联的连续法 　　是将指示酶直接加到待测酶反应系统中，将其产物直接或间接转变成可用光谱吸收仪检测的化合物。连续的偶联反应必须在酶反应相同条件 (pH、温度等) 下进行，且加入的指示酶以及其他各种物质不能干扰原来的酶活力。 　　如醛缩酶 (Aldolase) 催化1,6-二磷酸果糖生成3-P-甘油醛和磷酸二羟丙酮的反应，这些产物都无法直接测出，用磷酸丙糖异构酶 (Triose Phosphate Isomerase) 作偶联酶 (Coupling Enzyme)、甘油-1-P-脱氢酶 (Glycerol-1-Phosphate Dehydrogenase) 作指示酶，依据 NADH 变成 NAD+ 的光谱变化来算出醛缩酶活性。 　　如下图：

68 醛缩酶以1-P-甘油脱氢酶为指示酶的偶联测定酶活性法

69 酶活力测定中应注意的几个问题 　　酶反应和一般化学反应一样，都是在一定条件下进行的，但酶反应要比一般化学反应复杂得多，除了反应物以外，还有酶这样一个决定性因素。因此，酶活性测定除了必须遵照所用分析化学方法的操作要求外，又有它的—些特点。 首先，测定的酶反应速度必须是初速度，只有初速度才与底物浓度成正比。初速度的确定一般指：底物消耗量在 5％以内，或产物形成量占总产物量的15％以下时的速度。 　　其次，底物浓度、辅因子的浓度必须大于酶浓度 (即过饱和)，否则，底物浓度本身是一个限制因子，此时的反应速度是两个因素的复变函数。 　　第三，反应必须在酶的最适条件（如最适温度、pH 和离子强度等）下进行。此外，测定酶活性所用试剂中不应含有酶的激活剂、抑制剂；同时底物本身不要有裂解。用反应速度 (v) 对酶浓度(E) 作图，应得一条通过原点的直线，即 v 为 (E) 的线性函数。

70 　　初速度的确定是在底物浓度[S]足够的条件下，通过[E]的变化来确定，如下图。由图可见，当分别采用不同的酶浓度时，测得反应量对时间的变化。
　　求得几个适当时间的反应速度（反应量/反应时间）。再用反应速度对酶量作图 。由图可见，其中，5min时测得的数据可用于求出初速度，若以10min以上数据时，测得的酶活性偏低。

71

72 2.1.4.4 酶活性测定实例 (1) 超氧化物歧化酶 (SOD) 活力测定 这是一类专门清除体内超氧阴离子的酶，催化反应为:
　　这是一类专门清除体内超氧阴离子的酶，催化反应为: O2·﹣+ O2·﹣+2H+ → H2O2 + O2 由于 O2 ·﹣在溶液中极不稳定，给酶活性测定带来许多不便。目前已有根据 O2·﹣的物理性质测定 O2·﹣的歧化量，从而直接测定 SOD 活力的方法。如电子顺磁共振波谱法 (ESR)、核磁共振法 (NMR)、紫外分光光度法等。这里只介绍以邻苯三酚法测定酶活力为例的化学法。 　　邻苯三酚在一定条件下发生自氧化反应，产生的超氧阴离子自由基可通过自氧化速率来表示。加入SOD，可抑制自氧化速率，由此计算出酶活力。SOD单位定义为：一定的实验条件下（见操作），抑制率达到50%时的SOD的浓度为 1 个酶单位。

73 用这种方法测酶活力时，应注意由于连苯三酚和被测样液的加入量只有10μl ，在整个反应系统中可忽略不计，故反应液总体积按4.5计算。
操作：在试管中加入pH8.2的50mmol/L Tris-HCl缓冲液4.5ml，于25℃保温20min，然后加入预热的45mmol/L连苯三酚溶液（对照管用10mol/L HCl代替）10μl，迅速摇匀倒入1cm比色杯，每隔 30s 在 325nm 处测一次光吸收值，即可测定出连苯三酚的自氧化速率，一般要求自氧化速率控制在 OD/min。 　　测酶或粗酶液活力时，方法同测自氧化速率相同，所不同的仅是在加入缓冲液后再加入 10μl 待测样品即可。酶活力计算方法： 单位体积活力(u/ml) = {([( 样品速率)/0.07]×100%)/50%} ×反应液总体积×(反应液稀释倍数/样液体积) 总活力 = 单位体积活力(u/ml)×原液总体积 用这种方法测酶活力时，应注意由于连苯三酚和被测样液的加入量只有10μl ，在整个反应系统中可忽略不计，故反应液总体积按4.5计算。

74 (2)糖苷酶的活力测定 　　糖苷酶的活力测定多用人工底物，如对硝基苯基糖苷在糖苷水解酶的作用下，糖苷键断裂，产生等当量的糖和对硝基苯酚，对硝基苯酚在碱性条件下于400nm处有特异吸收，从对硝基苯酚对光吸收的标准曲线即可计算出糖苷水解酶的活性。 操作：试管中加入 5mmol/L 对硝基苯基糖苷200ul，pH4.6的0.2mol/L 磷酸氢二钠和 0.1mol/L 柠檬酸配制的缓冲液200ul，37℃预保温10min，再加入χμl待测样品并用水补足到100ul，37 ℃反应15min，用0.5mol/L Na2CO3 1ml终止反应 (注意空白管用水代替对硝基苯基糖苷和待测样品)，在 400nm 处测定 A 值，酶单位定义为在上述测定条件下每分钟释放1μmol对硝基苯酚的量为1 个单位的酶，对照标准曲线，即可计算出酶活力。

75 2.2 酶溶液制备 酶溶液制备包括三个过程的工作，材料预处理和破碎细胞、抽提、抽提液的浓缩。 2.2.1 材料预处理及破碎细胞
　　酶溶液制备包括三个过程的工作，材料预处理和破碎细胞、抽提、抽提液的浓缩。 2.2.1 材料预处理及破碎细胞 酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况：一是释放到细胞外的酶，叫胞外酶；二是游离在细胞内的酶．叫溶酶；三是牢固与膜或细胞颗粒结合在—起的，叫结酶，后二者合称胞内酶。由于酶蛋白分布不同，提取方法有所差异。微生物胞外酶，用盐析，或单宁沉淀。有机溶剂沉淀等从发酵液中沉淀酶，制成酶泥。胞内酶需收集菌体，经破细胞后提取，其中结酶还有个打断酶蛋白和细胞颗粒结合的问题。动植物细胞，也有打破细胞的问题，对动物材料，应剔除结缔组织、脂肪组织等；对植物材料如种子应去壳，以免单宁等物质着色污染。 　　进行预处理后，就是破碎细胞。细胞破碎有物理和化学方法两大类：

76 物理粉碎法 (1)研磨 手磨法是实验室内常用的方法。用石英砂或氧化铝作助磨剂来制备无细胞抽提液。此法简单但效率低，制备量少。球磨法，将干菌体放人球磨机，经数小时研磨，用水或缓冲液抽提。石磨法是选择坚硬的石磨，装上动力研磨。细菌磨也是在实验室中使用较好的方法。 (2)机械捣碎 匀浆器和高速组织捣碎器等对细胞作机械破碎。 (3)高压法 在结实的圆柱体容器内装上菌体与助磨剂，在2-15℃下，于活塞上加压冲击，以破碎细胞。 (4)爆破性减压法 将菌体悬浮在N2/CO2高压下平衡，37℃振荡数分钟，然后突然减压，使细胞壁、膜破碎。 (5)专用波振荡 专用波振动通过液体时形成局部减压，叫空化作用，旋涡生成与消失时，产生很大压力，从而使细胞破碎。 (6 )快速冰冻融化法 由于突然冰冻，使胞内水形成结晶及胞内外浓度突然改变，可使某些细胞破碎。

77 化学法 (1)渗透作用 将指数生长期的菌体用缓冲液洗净，并悬于含蔗糖、EDTA的稀的Tris缓冲液中，待平衡后离心，加入MgCl2剧烈搅拌，可使某些水解酶从细胞内释放出来。 (2)干燥处理 干燥方法可用空气干燥、真空干燥、冷冻以及脱水干燥。如空气干燥，一般在25-30 ℃或高到35-40℃的气流中吹干，然后将干菌体悬浮于3-5倍的水中或缓冲液中，室温搅拌2-3h抽提。 (3)自溶 向菌体中加醋酸乙酯、甲苯、乙醚及氯仿，使细胞渗透性改变，保温一定时间后，可以使菌体自溶。 (4)溶菌酶处理 用溶菌酶专一性地分解菌体细胞壁上多糖分子的β-1,4-糖苷键，从而破坏细胞壁。 (5)酶处理 作用于细胞壁的酶有白细胞酶、溶菌酶等，用以处理细胞，使酶释放出来。 ⑹表面活性剂处理 膜结合酶在细胞破碎后很难溶解下来，常借助表面活性剂来解决。在适当pH及离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。 ⑺其他 如当细菌感染噬菌体后，噬菌体附着于菌体细胞壁，导致菌体自溶等。

78 2.2.2 抽提 由于大多数酶蛋白属于球蛋白，因此，一般可用稀盐、稀酸或稀碱的水溶液抽提酶。
　　由于大多数酶蛋白属于球蛋白，因此，一般可用稀盐、稀酸或稀碱的水溶液抽提酶。 　　抽提液的具体组成和抽提条件的选择，取决于酶的溶解性、稳定性以及有利于切断酶与其他物质的连结。 pH 　　选用pH，首先考虑酶的稳定性。选用pH不应超过酶的pH稳定范围。 　　其次，从抽提效果出发，最好远离待抽提酶的等电点。也就是说，酸性蛋白宜用碱性溶液抽提；碱性蛋白宜用酸性溶液抽提。 　　第三，在某些情况下，抽提还兼有切断酶与细胞内其它成分间可能有的联系，从这点出发，选用 pH 4-6为佳。

79 2. 2. 2. 2 盐 大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度。所以，抽提液一般采用等渗溶液。最普通的为0. 020-0
盐 　　大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度。所以，抽提液一般采用等渗溶液。最普通的为 mol/L的磷酸缓冲液、0.15mol/L NaCl等；常用到的还有焦磷酸钠和柠檬酸钠的缓冲液，有助于切断酶和其他物质的联系；据报道，少数情况下用水抽提亦佳，这可能与低渗破坏细胞结构有关。 温度 　　温度通常控制在0-4℃左右。如果酶比较稳定，可以例外，如胃蛋白酶可在37℃保温抽提。 抽提液用量 　　抽提液用量常采用原料量的1-5倍。有时，为了抽提效果好些需要反复抽提时，抽提溶液比例可能大些。 其他 　　在细胞破碎以后，某些亚细胞结构也受到损伤，常给抽提系统带来不稳定的因素，因此有时还要加入一些物质。例如：加入蛋白酶抑制剂,以防止蛋白酶破坏目的酶；为防止氧化，加入Lys或维生素C、惰性蛋白及底物等。

80 总之，打破细胞后，溶酶一般不难抽提。至于结合酶，其中有些和颗粒结合不太紧，在颗粒结构受损伤时，抽提也不难。例如：α- 酮戊二酸脱氢酶、延胡索酸酶，可用缓冲液抽提出来；Cyt C可用0.145mol/L的TCA溶液抽提出来。那些和颗粒结合紧密的酶，常以脂蛋白络合物形式存在，其中有的在作成丙酮粉以后，就可以抽提出，有的却要使用强烈的手段，如正丁醇等处理。正丁醇兼有高度的亲脂性和亲水性（特别是磷酸盐），能破坏蛋白间的结合使酶进入溶液，如琥珀酸脱氢酶。近年来，广泛采用表面活性剂，如胆脂酸盐、 Triton、Tween、Teepol、SDS等，抽提呼吸链酶系。链霉菌葡萄糖异构酶的抽提，向菌体悬浮液中加入0.1％十二烷基吡啶氯化铵，酶的抽出率提高到 8 倍等（表）。此外，有时使用促溶剂如高氯酸；有时还用酶处理，如脂肪酶、核酸酶、蛋白酶等。

81 抽提后的细胞残渣或固体成分可用离心或过滤除去，离心时，加 入Al(OH)3凝胶或Ca3(PO4)2等物质，有助于除去悬浮的胶体物质。
表面活性剂对葡萄糖异构酶抽提效果的影晌 表面活性剂 类型 释出酶活力 总酶活力 释出 (%) 无 — 1.2 10.6 11.3 十二烷基苯磺酸钠 阴离子 2.4 10.1 23.8 十二烷基醇磺酸钠 3.8 11.2 33.9 十六烷基吡啶氯化铵 8.4 11.9 70.6 十二烷基吡啶氯化铵 阳离子 10.4 11.6 89.7 十六烷基甲基溴化铵 9.9 85.9 聚氯乙烯 非离子型 2.9 10.9 26.6 抽提后的细胞残渣或固体成分可用离心或过滤除去，离心时，加 入Al(OH)3凝胶或Ca3(PO4)2等物质，有助于除去悬浮的胶体物质。

82 2.2.3 酶溶液的净化与脱色 　　在酶的抽提液或发酵液中常含有细胞、细胞碎片等固形物质和蛋白质、粘多糖、脂类和核酸等大分子物质，通常应通过离心或过滤而净化。由于发酵液浓度较大，细胞颗粒微小（细菌细胞只有1-l0μm），相对密度只有1.03，有些细菌细胞表面带负电荷与发酵胶液流动电位电荷相互排斥；由于细胞壁外层的多糖、蛋白质等生物大分子与水结合成水化层而形成疏水强的稳定颗粒，这些在生产上为酶溶液的离心或过滤净化处理带来困难，通常需要使用絮凝剂后才能净化。 　　一些絮凝处理如下页表：

83 材料 絮凝处理 絮凝结果 碱性蛋白酶 发酵液200ml，pH 6.4 碱性蛋白酶发酵液 对照
添加0.26%阳离子聚丙烯酰胺 (PAM) 分子量为 万, 终浓度为 μl/L, 先加25%Al2(SO4)3, 终浓度为 %助凝, 再加同上PAM 先加Al2(SO4)3助凝剂 (同上), 再加分子量为 万, % PAM, 终浓度为105 μl/L 先加明矾 %或AlCl3·6H2O 1%助凝, 再加PAM 60μl/L絮凝, 加Na2HPO4 1.5%, CaCl2 2.5%, pH 8.0 滤速0.8ml/5min 滤速4.5ml/5min 滤速29ml/5min 滤速24ml/5min 比硝酸盐凝胶滤速高5倍, 滤速500L/h 细菌α-淀粉酶 1000ml，pH 6.9 1000ml 黑曲霉8471糖化酶发酵 液100ml，pH4.0 先加 Al2(SO4)3 25ml, 终浓度为0.47%助滤,再加分子量为200万阳离子 PAM (0.13%) 300ml, 终浓度为294μl/L絮凝, 先加碱式氯化铝 1.7%, PAM 0.35% (350μl/L)絮凝 先加30%碱式氯化铝 4ml, 再加分子量为700万PAM 0.2% (终浓度74μl/L) 收集滤液20ml絮凝需23min 20ml需35min 滤速比磷酸盐絮凝高1倍, 为81.5ml/min 滤速为对照的1.7倍,酶活损失<10% 赖氨酸发酵液 含固形物2.78%，100ml pH5-6 高温α-淀粉酶 pH 6.5-7 加阳离子PAM (分子量为400万) 1.6ml (终浓度为32μl/L) 先加30%碱式氯化铝 2ml, (终浓度为 %), 再加分子量为1,140万阳离子PAM 2.5ml (终浓度为20μl/L) 上述絮凝液再加1%硅藻土 先加Al2(SO4)3 1%助滤, 再加壳聚糖絮凝剂 滤速100ml 需220min 收集滤液100ml, 需60min 滤速提高20倍

84 　　絮凝剂种类分为无机的、有机的和天然高分子多种。无机絮凝剂：有些无机絮凝剂如铅盐、铁盐等水解后生成氢氧化物的凝胶微粒具有吸附作用和电荷作用，产生絮凝下降，有些无机絮凝剂如醋酸钙、磷酸钙等钙盐及锌盐也具有包围吸附沉淀作用；有机絮凝剂：是一些聚合物，多为水溶性直链状的大分子，按其链上所带基团不同而分为阳离子型、阴离子型和非离子型三种，其中以聚丙烯酰胺使用最广泛，也有用阴离子型和非离子型的絮凝剂；天然高分子絮凝剂：主要有壳聚糖，壳聚糖与钙盐或铝盐可增进分离效果。

85 　　有些工业上用酶还需要脱色。但需考虑：在酶的提取分离过程中的什么阶段进行脱色处理，使脱色工作量最少，又不由于脱色操作而引入杂质。工业上常用的脱色剂是活性炭。活性炭吸附色素而脱色。活性炭的用量、处理时间、温度等对脱色效果和酶的回收有影响。另外，不同方法制得活性炭吸附能力也不同。吸附能力强的活性炭，对酶的吸附能力也强。用氯化锌法制得的活性炭，吸附能力强，而水蒸气法制备的活性炭的吸附能力弱，但同时可以除臭。活性炭的用量一般为 ％，根据色素的多少而增减。一般由于活性炭颗粒较小，采用静态吸附法进行脱色。

86 　　另外，离子交换树脂也用于脱色。其中，大孔径的树脂效果较好，但在吸附色素的同时，会引起脱色液pH和离子强度的变化，必须对树脂进行缓冲化，使之与酶溶液的pH和离子强度一致。采用无离子交换作用的专用于脱色的树脂如 Duolite S30、通用1号等进行脱色，对某些酶液的效果较好，通用1号脱色树脂在pH5.5以下吸附色素，而在5％碱液中脱出色素，脱出色素后用水冲至中性，再用两倍树脂体积的5％盐酸溶液处理，最后用水洗至pH5.5以下，可再生利用。 　　在不同材料来源的酶溶液中加入不同的脱色剂，可以减少色素。例如：从植物材料提取酶时，常加入0.5-1％的吡咯烷酮，在枯草杆菌淀粉酶和蛋白酶盐析时，加入亚硫酸盐 (Na2SO3、NaHSO3等)，都可以除去部分色素。

87 2.2.4 浓缩 　　提取液或发酵液的酶蛋白浓度一般很低，如发酵液中酶蛋白浓度一般为0.1-1％，因此，在分离纯化过程中，酶溶液往往需要浓缩。浓缩的方法很多，如盐析或溶剂沉淀法、超过滤法、离子交换树脂法等，这些方法既是浓缩的方法，又是分离纯化的手段；还有真空浓缩及冷冻浓缩法、蒸发法、凝胶吸水法、聚乙二醇吸水法等。

88 冷冻干燥法 　　将酶溶液冻成固体后抽真空，使水分子直接从表面升华，最后酶呈干粉状。采用这种方法能使多种酶活性长期保存。 　　但操作需注意几个问题：首先被冻的最好是酶的水溶液，如果混有有机溶剂，会降低水的冰点，在干燥时，样品融化而起泡导致酶变性，同时，会使真空泵失效。其次，如果混有磷酸盐，在冷冻干燥时会引起pH的变化，例如pH 7的磷酸盐在冷冻时由于NaH2PO4会结晶析出，在溶液完全冷冻以前，pH便变成3.5左右。因此，在冷冻前，需将酶溶液脱盐。 　　依据溶液相对纯水熔点升高，冰点下降原理，对少量样品，一是将溶液冻成冰，然后缓慢溶解，这样冰块（不含酶）就浮于表面，酶溶解并集中于下层溶液（约为原体积的1/4）；二是让酶溶液慢慢冻结后移去水结成的冰。这种方法也会发生离子强度和pH的变化。

89 蒸发法 　　通常采用的减压蒸发法和实验室常用的超蒸发法，都因效率低、费时等在工业上很少应用。目前，工业上应用较多的是薄膜蒸发法。薄膜蒸发法，即将待浓缩的酶溶液在高度真空下转变成极薄的液膜，液膜通过加热而急速汽化，经旋风汽液分离器，将蒸汽分离、冷凝而达到浓缩目的。薄膜蒸发器有：升膜式、降膜式、刮膜式、离心式等多种，根据物料不同而加以选择。 超过滤 　　超过滤是在加压的条件下，将酶溶液通过一层只允许小分子物质选择透过微孔半透膜，而酶等大分子物质被截留，从而达到浓缩的目的。如果采用不同孔径的膜，同时又具有分级分离的作用。这种方法具有下列优点：不需加热，更适用于热敏物浓缩；无相变化、设备简单、操作方便；能在广泛的pH条件下操作等。因此，近年来发展很快。

90 将膜平铺在多孔支持板上，加压下（可带有搅拌）酶溶液从膜面流过，水及小分子溶质透过膜孔而排比，大分子溶质（如酶）被截留。
超滤膜主要有以下几种类型： (1) 平面膜 将膜平铺在多孔支持板上，加压下（可带有搅拌）酶溶液从膜面流过，水及小分子溶质透过膜孔而排比，大分子溶质（如酶）被截留。 (2) 管式膜 将管式膜置于多孔硬管的外侧或内侧，酶溶液在管内或管外流动，水和小分子溶质透过滤膜，而大分子物质被截留而浓缩。 (3) 中空纤维 　　将聚砜作成中空膜，成束中空纤维膜装在圆筒真空超滤器中。 ２ 胶过滤 　　利用Sephadex G-250或G-50等吸叹水膨胀，酶被排阻在胶外面的原理而进行浓缩。 其他 　　如利用聚乙二醇等浓缩，只适用于小量样品。

91 2.3 酶分离纯化的基本过程 2.3.1 酶分离纯化方法的选择
　　在上述浓缩液或发酵液中，除含有我们需要的酶以外，还不可避免地存在着其他大分子物质和小分子物质，其中小分子物质在以后的纯化步骤中会自然而然的除去。大分子物质中包括核酸、粘多糖及其他蛋白质。核酸及其相关蛋白可以用硫酸鱼 精蛋白、硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、三甲基氨十六烷基溴及MnCl2预先沉淀，离心除去、必要时，可用核酸酶。根据不同材料选择不同的试剂。比如从植物组织中提取乙醇酸氧化酶。可在提取液中 ％硫酸鱼精蛋白、使之与核酸及相关蛋白形成复合物而沉淀，然后在4℃采用10,500r/min离心而除去.至于粘多糖，常用醋酸铅、乙醇、单宁酸及离子型表面活性刑等处理除去，有时也用酶除去。余下酶和杂蛋白，因此，酶的分离纯化工作主要是，将酶从杂蛋白中分离出来或者将杂蛋白从酶溶液中除去。现有酶的分离纯化方法都是依据酶和杂蛋白在性质上的差异而建立的。

92 　　酶和杂蛋白的性质差异大体上可有以下几个方面，根据这些差异，其分离方法可有：
(1)根据分子大小、轻重设计的方法，如离心分离法、筛膜分离法、凝胶过滤法等。 (2)根据溶解度大小分离的方法，如盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法等。 (3)按分子所带正负电荷多少分离的方法，如离子交换分离法、电泳分离法、聚焦层析法等。 (4)按稳定性差异建立的分离方法，如选择性热变性法表面变性法等。 (5)按亲和作用的差异建立的分离方法，如亲和层析法等。

93 　　在工作实践中选择方法时：首先应对被纯化的酶的理化性质（如溶解度、分子量大小、稳定性和解离时电学性质等）有一个比较全面的了解，这样，就可以知道在分离纯化时可以选用哪些方法和条件，避免使用哪些方法和条件，从而得到好的纯化效果；其次，判断采用的方法和条件是否得当（判断的标准是酶活性的高低），一个好的方法和条件是比活力提高的多，总活力回收的多，而重复性好，在纯化工作中，往往不宜重复采用相同的步骤和条件，因为这样不能使纯度进一步提高，而只能使酶的总活力下降；再者要严格控制操作条件，随着酶的逐步纯净，杂蛋白含量亦逐步降低，蛋白质之间的相互作用力随之下降，酶更不稳定，因此，更要防止酶变性。

94 引自《生物化学与生物物理学报》，1993, 25(1):27。
2.3.2 酶分离纯化过程中一些数据的处理 　　在酶的分离纯化过程中，每步都须做三件事：第一，测定酶活力(IU/ml)；第二，测定蛋白质含量(mg/ml)；第三，测量体积(ml)；然后将测得数据加以整理。 　　例如分离纯化番麻 (Agave americana) 蛋白酶的主要步骤 为：叶片经30％乙醇水溶液压榨提取，用冷丙酮制成干粉， 经Sephadex G-50柱层析和SP-Sephadex C-50纯化，获得结晶， 纯化结果如表下表: 步骤 总体积(ml) 总蛋白(mg) 总活力(IU) 比活力(IU/mg) 纯化倍数(X) 产率(%) 1. 抽提 110 365 177.30 - 2. 粗酶 10 145.5 324.40 1.83 3. Sephadex G-50 65 23.3 9.40 4. SP C-50 40 11.4 18.10 5. 结晶 6.28 24.50 引自《生物化学与生物物理学报》，1993, 25(1):27。

95 2.3.3 结晶 　　结晶是指分子通过氢键、离子键或分子间力按规则并且周期性排列的一种固体形式，由于各种分子间形成结晶的条件不同，也由于变性蛋白质和酶不能形成结晶，因此，结晶既是一种酶是否纯净的标志，又是一种酶和杂蛋白分离的方法。 结晶的基本原理 　　结晶形成的过程是自由能降至最小的过程。当自由能降至最小并逐渐达到平衡状态时，溶质分子开始结晶作用，平衡状态的热力学和动力学参数决定于溶剂和溶质的理化特性。当溶液处于过饱和状态时，分子间的分散或排斥作用小于分子间的相互吸引作用，便开始形成沉淀或结晶，由于溶液的过饱和，维持水合物的水分子相对减少而且不足，溶质分子相互接触机会增加而聚集，但是，当溶液过饱和的速度过快时，溶质分子聚集太快，便会产生无定形的沉淀。如果控制溶液缓慢地达到过饱和点，溶质分子就可能排列到晶格中，形成结晶。所以，在操作上必须注意：第一，耍调整溶液，使之缓慢地趋向于过饱和点；第二，调整溶液的性质和环境条件，使尽可能多的溶质分子相互接触，形成结晶。

96 结晶条件 　　酶蛋白分子形状和理化性质较复杂，使之在溶液中的特性也变得复杂，影响其最小溶解度的因素也很多，如电解质的浓度、酶蛋白的浓度、pH、温度等因素；而且，由于常常出现几个最小溶解度，会产生结晶的多形性，从而使结晶条件也十分复杂；这样，每种酶蛋白的结晶条件也往往不同。

97 　　为了获得某种酶蛋白的结晶，往往需要进行一些适当的预备实验摸索。
(1)酶的纯度 一般来说，酶越纯越容易获得结晶，长成单晶的可能性也越大。除个别情况外，一般酶纯度应达到50％以上。 (2)酶蛋白的浓度 对大多数酶来说，蛋白质浓度在3-50mg/ml较好。一般来说，酶蛋白浓度越高，有利于分子间相互碰撞而聚合，但是酶蛋白浓度过高，往往形成沉淀；酶蛋白浓度过低，不易形成晶核。 (3)晶种 有些不易结晶的酶，需加入微量的晶种才能形成结晶，在加入晶种前，要将溶液调整到适于结晶条件下，加入的晶种开始溶解，还要追加沉淀剂，直到晶种不溶解为止，当达到晶种不溶解又没有无定形物形成时，静置，使晶体生长。 (4)温度 结晶温度， 一方面要有利于结晶的生成；另一方面要不超过酶的热稳定性。有些酶对温度很敏感，因此要防止酶失活，从现有资料来看，一般控制在0-4℃范围内，通常在4 ℃ 下。低温条件对酶不仅溶解度降低，而且酶不易变性。 (5)pH pH是酶结晶的一个重要条件．有时只相差0.2pH单位时，只能得到沉淀，而得不到结晶，所选择pH应在酶的稳定范围内，—般选择在被结晶酶的pI值附近。

98 (6)金属离子 许多金属能引起或有助于酶的结品。不同酶选用不同金属离子，在酶结晶过程中常用Ca2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Cd2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+等金属离子。在许多情况下，这些离子是酶表现活力所必滞的，它们能保持酶分子结构上的一些特点。 (7)其他 除上述因素外，还有一些因素会影响结晶的形成。比如：需防霉，在结晶过程中不得有微生物生长，一般在高盐浓度或有乙醇时，可以防止微生物生长，在低离子强度的蛋白质溶液中，易生长细菌和霉菌。为此，所有溶液需用超滤膜或细菌漏斗过滤，加入少量的甲苯、氯仿或吡啶，可以有效地防止微生物的生长。又如，在结晶过程中，一般要防止蛋白酶的水解作用。蛋白酶水解作用常引起结晶的微观不均一性，影响结晶的生成和生长。

99 结晶的方法 (1)盐析法 采用一些中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化铵、乙酸钠、乙酸铵、硫酸镁、氯化钙、硝酸铵、甲酸钠等，在适当条件下．保持酶的稳定性，慢慢改变盐浓度进行结晶。其中，最常用的是硫酸铵、硫酸钠。一般是将盐加入到比较浓的酶溶液中至溶液呈浑浊为止，然后放置，并缓慢增加盐浓度。 (2)有机溶剂法 酶溶液中滴加某些有机溶剂，如乙醇、丙酮、丁醇、甲醇、乙睛、二氧杂环己环、异丙醇、二甲基亚砜等，也能使酶形成结晶。一般在含有少量无机盐和适宜的pH条件下，于冰浴中缓慢滴入有机溶剂，并不断搅拌，当酶溶液微浑浊时，在冰箱中放置几小时后，便有可能获得结晶。

100 (3)微量蒸发扩散法 将纯酶溶液装入透析袋，用聚乙二醇吸水浓缩至蛋白质含量为1mg/ml左右，然后加入饱和硫酸铵溶液到10％饱和度左右，再将其分装于比色瓷板的小孔内，连同饱和硫酸铵溶液放入密封的干燥器内，再在4℃下静候结晶。 (4)透析平衡法 透析平衡法是将酶溶液装入透析袋中，对一定的盐溶液或有机溶剂进行透析平衡，酶溶液可缓慢达到饱和而析出结晶。 (5)等电点法 酶蛋白在其等电点时溶解度最小，通过改变酶溶液的pH可以缓慢地达到过饱和而析出酶蛋白结晶。 (6)其他方法 还有气相扩散法、复合结晶法、温度诱导法等。

101 2.3.4 酶的制剂 酶制剂通常有下列四种剂型： (1) 液体配制剂 包括稀酶液和浓缩酶液。一般除去固体杂质后，不再纯化而直接制成，或加以浓缩而成。这种酶制剂不稳定，且成分复杂，只用于某些工业。 (2) 固体配制剂 发酵液经杀菌后直接浓缩或喷雾干燥制成。有的加入淀粉等填充料，用于工业生产。有的经初步纯化后制成，如用于洗涤剂、药物生产。用于加工或生产某种产品时，务须除去起干扰作用的杂酶，才不会影响质量。固体酶制剂适于运输和短期保存，成本也不高。 (3) 纯配制剂 包括结晶酶，通常用作分析试剂和医疗药物。要求较高的纯度和一定的活力单位数。医疗注射酶，还必须除去热源。热源属于糖蛋白，分子量在10万以上，是染菌后细菌分泌出来的类毒素。带有这类物质的制剂注射到体内后引起体温升高。热原耐热耐酸但不耐碱，对氧化剂敏感。它可用吸附、亲和层析、改变分离纯化等方法除去。 (4) 固定化酶制剂 具体内容详见酶固定化。

102 2.3.5 酶的制剂的保存 酶制剂保存的主要问题是提高酶的稳定性，延长保存期。 (1) 影响酶稳定性的因素
① 温度 在低温条件下(0-4℃)使用、处理和保存。有的需更低温度，加入甘油或多元醇有保护作用。 ② pH与缓冲液 pH应在酶的pH稳定范围内，采用缓冲液保存。 ③ 酶蛋白浓度 一般酶浓度高较稳定，低浓度时易于解离、吸附或发生表面变性失效。 ④ 氧 有些酶易于氧化而失活。

103 (2) 为提高酶稳定性，常加入下列稳定剂 ① 底物、抑制剂和辅酶　其作用可能是通过降低局部的能级水平，使酶蛋白处于不稳定状态的扭曲部分转入稳定状态。 ② 对巯基酶可加入SH-保护剂，如α-巯基乙醇、GSH（谷胱甘肽）、DTT（二硫苏糖醇）等。 ③ 其他如Ca2+能保护α-淀粉酶，Mn2+能稳定溶菌酶，Cl-能稳定透明质酸酶，其作用机制可能是防止酶蛋白肽链延展；其次是表面活性剂，如许多酶配置于1％的苯烷水溶液中，即使在室温下催化活力也能维持相当长时间；再次是高分子化合物，如血清蛋白、多元醇等，特别是甘油和蔗糖是近年来低温保存添加剂。此外，在某些情况下，丙醇、乙醇等有机溶剂也显示一定的稳定作用。为了防止微生物污染酶制剂，加入一定浓度的甲苯、苯甲酸和百里醇等。

104 2.4 根据分子大小轻重建立的分离纯化方法 2.4.1 透析与超过滤
　　透析(Dialysis)是利用蛋白质不能通过半透膜，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开，将待提纯的溶液装入半透膜的透析袋中，放入蒸馏水或缓冲液中，小分子物质借扩散进入透析袋外的蒸馏水或缓冲液中。这样通过更换透析袋外液，使透析袋内的小分子物质降至最低，如右图。

105 超滤装置示意图 　　超过滤 (Ultrafiltration) 是利用压力或离心力强行使溶质按分子量、形状、大小的差异，所需溶质分子阻留在膜的一则，而小分子溶质则随溶剂透过膜压到另一侧，这样使大小溶质分子得到分开。所以它的持点是利用有选择透过的多微孔膜，在液压作用下，分离出大分子溶质（右图）。

106 实验室内常用的超滤装置有以下几种： (1) 中空纤维超滤器　　中空纤维超滤装置是将成束的中空纤维装入一筒内，两端封闭。当轴流通过管腔时，造成高剪切力，在截留溶质分子的同时，将浓度降至最低限度。每根中空纤维内腔直径为0.2mm,中空纤维由惰性的非离子聚合物制成．具有各向异性、抗堵塞性，运用成束纤维表面积大，超滤流量大、阻留溶质的浓度范围为4-20％左右。如下图所示。 a 超滤过程；b 浓缩透析仪

107 ⑵ 封闭式超滤装置　　封闭式超滤装置有搅拌和不带搅拌的两种。搅拌型超滤器带有磁力搅拌或机械振动，借助搅拌或振动造成高液流从而控制浓度极性，溶质浓度一般为5%（图a)；无搅拌型超滤器也有多种形式，如用惰性气体推动柱塞迫使溶液过滤的叶柱塞推进式加压超滤器（图b)，由于它无搅拌，没有控制浓度极化，而只能处理小体积的溶液，溶质浓度<1%。

108 ⑶ 循环型超滤器　　这种超滤装置浓缩大溶质的浓度可达40％，同时，可用于大溶质的分离。这是一种带有浅道的超滤装置。它使液体在浅道中奔流，从而使其具高剪切力稳定的层流，将浓度极化下降到最低。

109 2.4.2 离心分离 　　在高速离心 (20,000r/min) 或超高速离心(80,000r/min) 的力场下，酶及其他大分子发生沉降。由于各种大分子的形状大小和质量轻重不同，其沉降速度亦不同。颗粒沉降的速度决定于应用的离心加速度(ac)。ac 决定于转子的速度 (W, 弧度1/S) 与半径(r, cm)： 　　　　 ac ＝ W2r 转子转了一圈等于2π弧度，角速度应为： W＝2 π n/60 n为每分钟转子的转数，代入上式 得： ac＝4π2n2 r/3600 　　若用相对离心力R.C.F × g表示　(g为重力加速度，980cm/s2) 　　R.C.F＝ 4 π2n2 r/3600 ×980 　　 R.C.F＝11.18 × 10-6n2r 离心机轴半径示意图 　　若已知半径及转速，可 求得相对离心力（右图）。

110 颗粒的沉降速度不仅取决于应用的离心力的大小，而且，还取决于颗粒的密度(ρ)、半径(r)和溶液的密度(ρ0)与黏度(g/cm
　　颗粒的沉降速度不仅取决于应用的离心力的大小，而且，还取决于颗粒的密度(ρ)、半径(r)和溶液的密度(ρ0)与黏度(g/cm.s)。这样颗粒下降至管底的时间(t)为： Xt为液面的轴半径距离(cm), Xb为器底的轴半径距离(cm) 　　依上述，不同大小球状颗粒下降至器底时间不同，有先有后，一般重量大大小、轻重可将酶分离出来。离心分离只能把各种下的沉降速度亦大，体积大的沉降速度小，这样按照分子降物或不溶物与溶液分开，无法把分子量、性质、结构相近的大分子细分，但内于其容量大、需时短，在分离酶时常用到。

111 2.4.3 凝胶过滤 　　凝胶过滤 (Gelfitration) 即凝胶过滤层析 (Gelfitration Chromatography)，也称分子排阻层析 (Molecular-Exclusion)、分子筛层析(Moleculai-Sieve Chromatography)，是根据分子大小分离纯化酶最有效的方法之一 (下图)。 　　在层析柱中填充分子筛（凝胶）介质，加入待纯化样品，然后用适当的缓冲液淋洗，使样品自上而下扩展。大于凝胶孔径的分子不能进入胶粒内部而从胶粒间间隙扩展，下移速度较快；反之，小于凝胶孔径的分子，能自由出入胶粒内外，按照分于热运动规律，其运动轨迹“迂回曲折”。因此，下移速度慢。所以，样品通过一定距离的层析柱后，不同大小的分子就将按先后顺序依次流出，彼此分开。

112

113 为使胶过滤达到理想效果，需考虑如下因素： 2.4.3.1 凝胶选择 最常用的凝胶有以下几种：
凝胶选择 最常用的凝胶有以下几种： (1)葡聚糖凝胶 是分子量几万到几十万的葡聚糖凝胶通过环氧氯丙烷交联而成的网状结构物质，可分离分子量从 的分子。其商品名是Sephadex G，有各种型号 (下表)，G后的数字表示每g干胶吸水量 (即吸水值) 的10倍，其特性如下表所示。另外还有一种为Sephacyl-S，通过N,N-甲叉双丙烯酰胺交联的烯丙基葡聚糖，可适用于水、有机溶剂及高浓度解离试剂存在的系统。另一类Sephadex-LH，适用于脂类化合物的分离。 类型 颗粒直径(μm) 工作范围 吸水值(mg/g 干胶) 床体积(mg/g 干胶) 膨胀时间(h) 球状(Mw) 线状(Mw) 20℃ 100℃ G-10 40-120 <200 <700 1±0.2 2-3 3 1 G-15 <150 <1500 1.5 ±0.2 G-25 300-10 2.5 ±0.2 4-6 6 2 G-50 5.0 ±0.3 9-11 G-75 120-10 7.5 ±0.5 12-15 24 G-100 10 ±1 15-30 48 5 G-150 15 ±1.5 20-30 72 G-200 20 ±2 30-40

114 (2)聚丙烯酰胺凝胶 是以丙烯酰胺为单体，通过N,N-甲叉双丙烯酰胺为交联剂共聚而成的凝胶物质，商品名是Bio-Gel P，有各种型号、P-后的数字乘以1000表示其分离的最大分子量 (即排阻分子量)。其特性如下表 所示。 型号 颗粒数目 颗粒直径 (μm) 工作范围(Mw) 吸水值(mg/g 干胶) 床体积(mg/g 干胶) 溶胶时间(h) 20℃ 沸水浴 P-2 50-400 150-40 1.5 3 2-4 2 P-4 2.4 4.8 P- 3.7 7.4 P-10 4.5 9.4 P-30 5.7 11.4 10-12 P-60 7.2 14.4 P-100 7.5 15.4 24 5 P-150 9.7 18.4 P-200 14.7 29.4 43 P-300 18.0 36.0 48

115 (3)琼脂糖凝胶 琼脂糖是琼脂抽去琼脂胶等之后所得D-半乳糖和3,6-脱水半乳糖，自动缔合而成的网眼结构物质，孔径大小由胶的浓度决定．以商品Sepharose为例，有2B、4B和6B等规格，B前面数字表示胶百分浓度。这类凝胶孔径都比较大，适于分离较大的物质．如病毒、细胞颗粒和DNA等。其持性如下表。另一类为Sepharose CL，适用于有机溶剂和氢键解离试剂存在的情况。还有一种称Dio-Gel A是琼脂糖和丙烯酰胺的交联胶，而且有较一致孔径，可用于酶分离。 类型 颗粒直径 (μm) 工作范围 琼脂浓度 (%) 6B 40-210 1×104— 4×106 6 4B 40-190 104—2×107 4 2B 50-250 2 A0.5m <104—0.5×106 10 A1.5m 50-100 <104—1.5×107 8 A5m 104—5.5×106 A10m 104—10×106 A50.0m 105—5×106 A150.0m 106—150×106 1

116 柱层析包括：层析介质平衡、装柱、加样、洗涤和洗脱以及流出液成分检测和部分收集。
以上凝胶具有以下特点： ①具有强的亲水性，在水中能膨润。 ②膨润后有—定机械强度和弹性。 ③具有较高的化学稳定性，可适用pH4-9，但在pH2以下长期处理有可能破坏.在盐碱溶液中稳定。 ④对氧化剂敏感。 ⑤没有解离基团，非专—性吸附小。 柱层析的基本过程与要求 柱层析包括：层析介质平衡、装柱、加样、洗涤和洗脱以及流出液成分检测和部分收集。 层析结果常以洗脱曲线表示，以洗脱液中的蛋白质（如A280）或酶活性相对洗脱体积【Ve作图（下页图）】来表示。衡量分离效果的标准是：分辨率高，回收率高、稀释倍数小、流速快，其中分辨率可用Rs权衡：

117 凝胶过滤洗脱曲线示意图

118 Rs＝两峰间距离/峰宽。当Rs＝1.2时，基本达到要求。这些标准与层析柱大小和长度有关，一般柱长取决于要达到的分辨率：Rs∝ ( 为柱长)。柱长和柱的大小取决于样品量，柱太长时，流速不好。
f＝pr2/L, f为流速，P为压强，r为半径，柱内径与柱长比例为1/4-1/20，或1/100-1/50，为了减少稀释和分离组分的重混，支持板下的“死体积”应在柱体积的0.1%以下。

119 胶用量 在实际操作时，根据柱大小和膨润指数，先算出装入凝胶的体积(Vt)，再量出空柱的体积(Vo，即柱中颗粒内外溶剂的体积）。加样量不超过Vt的3％，少至1％更好。洗脱体积 (Ve)以(Vt-Vo)的80％为恰当，但由于Vo大约为Vt的30％-35％，所以用总体积的55％的洗脱液效果较好。 加入样品溶液体积为总洗脱体积的约8％-10％，样品的各成分应有90％左右在其洗脱峰中，其他约为10％扩散至相邻成分中。

120 胶的再生与保存 在每个分离过程约结束后，由于胶本身没有变化，一般无需特殊的再生处理，经蒸馏水、稀盐或缓冲液洗涤后又可继续使用；如有尘粒污染可用反向上行法漂洗；如有少量非专一性的交换或吸附．可先用0.1mol/HCl或0.1mol/LNaOH洗涤后再用水洗至中性。为防止微生物污染可加人0．02％NaN3流洗。洗涤的胶可于膨胀状态置于冰箱长时间保存。

121 2.5 调节溶解度的分离方法 　　调整溶解度的分离方法是根据酶和杂蛋白质在溶解度性质上不同而建立的一些方法.常用的有：盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法等方法。 2.5.1 盐析 　　球蛋白在低浓度盐溶液中，其溶解度随盐离子强度(Ionic Stength)升高而加大，表现出盐溶现象。这主要是由于蛋白质分子吸附某种盐离子后，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而与水之间相互作用加强，因而溶解度提高。但当盐浓度继续升高达到某一上限值时，其溶解度又会以不同速度下降。分别沉淀析出，这种现象称为盐析(Salting Out)。盐析作用的理论基础尚不明了，大致是由于高盐离子使水的相对浓度降低，蛋白质失去水化作用，引起分子之间疏水部分吸引力增加，以致沉淀析出。 　　常用的中性盐有钾、钠及氨的硫酸、磷酸盐及柠檬酸盐、盐酸盐。实验证明．对阳离子来说， 一价比二价盐好，对阴离子是二价比—价好。最常用的是硫酸铵。其优点是:

122 廉价，在水中溶解度大，溶解的温度系数小（如O℃时为697g/L，25℃时767g/L)，即使在低温条件下几乎能使所有的蛋白质都能盐析出来，而且对大多数酶无害。各种酶所需硫酸铵的沉淀浓度是不同的，所以可用分级沉淀法将各种酶分级沉淀.硫酸铵盐析时溶液的盐浓度以饱和度表尔，饱和盐溶液的饱和度为100％（在0 ℃约为4mol)，调整盐浓度有两种方法：当蛋白质溶液体积不大，要达到的盐浓度不高，可加入饱和硫酸铵溶液，100m1硫酸铵溶液，由饱和度S1变为S2，应向其中加入的饱和硫酸铵溶液的ml数(V)为： V＝Vo(S2-S1)/(1-S2) 另外，当蛋白质原有体积较大，要达到的盐浓度又较高，此时加入固体硫酸铵为宜。在0℃、25℃下，硫酸铵浓度由饱和度Sl增至S2，应向1L溶液中添加的固体硫酸铵的克数，可以直接查表:

123 * 在0℃下，硫酸铵溶液由初浓度调到终浓度时，每升溶液加硫酸铵的克数
硫酸铵终浓度（%饱和度） 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 硫酸铵初浓度(%饱和度 ) 每1L溶液加硫酸铵的克数 * 106 134 164 194 226 258 291 326 361 398 436 476 516 559 603 650 697 5 79 108 137 166 197 229 262 296 331 368 405 444 484 526 570 615 662 10 53 81 109 139 169 200 233 266 301 337 374 412 452 493 536 581 627 15 26 54 82 111 141 172 204 237 271 306 343 381 420 460 503 547 592 27 83 113 143 175 207 241 276 312 349 387 427 469 512 557 56 84 115 146 179 211 245 280 317 355 395 478 522 28 86 117 148 181 214 249 285 323 362 402 445 488 57 87 118 151 184 218 254 329 369 410 453 29 58 89 120 153 187 222 335 376 418 59 123 156 190 263 302 342 383 92 125 159 230 268 308 348 61 93 127 161 235 273 313 31 62 129 201 231 279 63 97 132 168 205 244 32 99 171 209 66 101 174 33 67 103 34 68 105 * 在0℃下，硫酸铵溶液由初浓度调到终浓度时，每升溶液加硫酸铵的克数

124 * 在25℃下，硫酸铵溶液由初浓度调到终浓度时，每升溶液加硫酸铵的克数
硫酸铵终浓度（%饱和度） 10 20 25 30 33 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 90 100 硫酸铵初浓度(%饱和度 ) 每1L溶液加硫酸铵的克数 * 56 114 144 176 196 209 243 277 313 351 390 430 472 516 561 662 767 57 86 118 137 150 183 216 251 288 326 365 406 449 494 592 694 29 59 78 91 123 155 189 225 262 300 340 380 424 520 619 49 61 93 125 158 193 230 267 307 348 485 583 19 62 94 127 162 198 235 273 314 356 546 12 43 74 107 142 177 214 252 292 333 426 522 31 63 129 164 200 238 278 319 411 506 97 132 168 205 245 285 375 469 32 99 134 171 210 250 339 431 66 101 302 392 67 103 141 179 264 353 34 69 105 143 227 190 275 72 153 237 36 115 77 157 79 * 在25℃下，硫酸铵溶液由初浓度调到终浓度时，每升溶液加硫酸铵的克数

125 经盐折后，沉淀通过离心或压滤与母液分开，收集后的沉淀再溶于一定的缓冲液心除去不溶物，酶溶液又得到一次纯化。
此外，pH、温度、蛋白质浓度都会影响分离的效果。在大多数情况下，盐析法适宜的pH是接近分离酶的PI值。有时有些酶与杂蛋白形成某种结合而干扰分离，此时应控制pH＜5或pH＞6，使它们带相同电荷而减少结合，但应注意酶的稳定性和盐的溶解度。从酶的稳定性和溶解度来看，盐析温度应控制在0℃左右为宜。为了获得较好的盐析效果，还应调节蛋白质的含量，一般来说，蛋白质浓度应在1mg/ml以上，蛋白质浓度太低，如100ug/ml以下，不能形成沉淀。在(200ug-1mg)/m1范围内沉淀时间较长，回收率往往不高。 经盐折后，沉淀通过离心或压滤与母液分开，收集后的沉淀再溶于一定的缓冲液心除去不溶物，酶溶液又得到一次纯化。 盐析层析法是盐析与层析技术相结合的一种分离方法.以某种非极性物质（如琼脂糖）为柱层析的支持物，在高的盐浓度条件下可以使待纯化的酶盐析吸附，然后再梯度降低盐浓度，从而使酶洗脱出来,这样可增加或提高分辨率。 盐析法安全、简便、重复性好，但比活力提高不多。

126 2.5.2 降低介电常数方法 在酶溶液中加入与水互溶的有机溶剂．可降低溶液的介电常数(Dielectric Constant)使酶分子间的静电引力增强而发生沉淀.另外，有机溶剂也可能使酶蛋白脱水而发生沉淀。当不同的酶蛋白溶液中加入不同量的有机溶剂时，便会分别从溶液中沉淀出来。 影响有机溶剂沉淀法分离的因素较多。 温度 因为大多数球蛋白在有机溶剂中不稳定，特别是在温度较高时，更易变性失活。因此，所有操作必须在0℃以下进行，有机溶剂必须冷却至-15～-20℃ ，然后搅拌下缓慢加入，沉淀析出后赶快离心分离，并用预冷缓冲液溶解所得沉淀，以降低有机溶剂浓度。

127 有机溶剂 世界酶学史上第 一个随蛋白结晶便是Sumner在刀豆脲酶抽提液中加入32％丙酮得到的脲酶结品。其他常用的有机溶剂有乙醇、甲醇、异丙醇及二氧六环等.有机溶剂的浓度以百分体积(m1)比表尔。加入量依下式计算 V=Vo(S2-S1)/(S-S2) 式中．V为应加入的有机溶剂体积；Vo为原有的体积；S、S1、S2分别为待加的、原溶液中含有的及所达到的有机溶剂百分比浓度。

128 离子强度 大多数中性盐能增加酶蛋白的溶解并能减少变性，常常在进行有机溶剂沉淀时，于溶液中加入适当的中性盐，如5％-10％硫酸铵往往有助于提高分辨率。但其浓度不得越过0.05mol，否则，沉淀不完全甚至无沉淀。还可以利用多价阳离子效应，如Zn2+、Ba2+等，在高于待纯化酶的等电点的pH条件下，常能和蛋白质形成络合物，降低其溶解度，提高分辨率。当加入有机溶剂后，再加入 mol的Zn2+或其他阳离子，能明显提高分辨率. 溶液pH也有一定影响，一般在进行有机溶剂法时，溶液pH尽可能靠近待纯化酶的PI值。 此法分辨率较高、溶剂易除去，但易引起酶的变性失活。

129 等电点沉淀法 蛋白质是两性电解质，所带电荷则因pH变化而变化。当蛋白质处于等电点(Isolectric Point，pI)pH时，蛋白质的静电荷为零，相同蛋白质分子间没有了静电排斥作用而趋于聚结沉淀，溶解度达到最低点。在等电点以上或以下的pH时，由于蛋白质分子间带有相同的电荷而相互排斥，阻止了蛋白质结聚成沉淀物，溶解度大.不同蛋白质具有不同的pI值，利用蛋白质在PI时溶解度最低的原理，可以把不同的蛋白质分开。当蛋白质溶液的pH调至被纯化酶的等电点pH时，该酶蛋白绝大部分即被沉淀出来，那些等电点高高于或低于此PH的蛋白质仍保留在溶液中。经离心分离出沉淀后再用一定的缓冲液溶解，被纯化的酶蛋白仍保持其天然构象。由于蛋白质在其PI时仍有一定的溶解度．沉淀不完全，因此常需要与其他方法配合使用。当样品中杂蛋白种类较多时，可将样品pH调到某一值后，不仅会使等电点状态蛋出质沉淀，也可使该种蛋白质两侧带相反电荷的杂蛋白形成复合物而沉淀，从而除去。

130 共沉淀法 1964年后，经Polson等人发展一类大分子量的非离子型聚合物，如聚乙二醇(PFG)、聚乙烯亚胺(PEI)、单宁酸、硫酸链霉素以及离子型表面活性剂(SDS等)，用来沉淀蛋内质的方法，它们在一定条件下能与蛋白质直接或间接形成络合物，使蛋白质析出，离心后收集沉淀，再用适当的方法使酶溶解出来。如PEG常用到的分子量力6,000和4,000的20％(W/V)的浓度能将许多蛋白质沉淀出来，同时，在适当pH、温度和蛋白质浓度下调整PEG浓度，还可分离酶，并用于培养结晶，核酸限制内切酶EcoRⅠ可用PEI分离，PEI在0.2mol KCl存在下，能和DNA及相关蛋白凝聚析出后，将KCl浓度升至0.6mol时，EcoRⅠ又重新溶解出来，这样该酶得到了初步纯化。

131 选择性沉淀法 这种方法是利用一些多聚电解质如聚丙烯酸(PAA)、硫酸糊精及磷、砷、硅、钨、钼、钒等的杂多酸，能在极低浓度下选择性地和某种酶结合而沉淀。其机理尚不清楚。如PAA用于某些蛋白酶、磷酸酯酶和溶菌酶等的分离过程： PAA + 酶 → PAA-酶↓ PAA-酶 + Ca2+ → PAA-Ca2+↓+ 酶 PAA-Ca2+ + SO42- → CaSO4↓+ PAA PAA回收利用。

132 2.6 按电荷的正负性设计的分离方法 按分子所带电荷的差异建立的分离方法有吸附交换分离法、电泳分离法、聚焦层析法等，分子荷正电多的物质，与荷负电性的物质反应强烈，受负电场的影响较大；荷负电性多的物质正相反。 2.6.1 吸附交换分离法 根据吸附机制不同，这类方法大体上可分为三种：物理吸附法、羟基磷灰石法和离子交换吸附法。都是利用样品中不同分子和吸附剂间的吸附与解吸性质不同而达到分离目的的。进行的方式可以采用静态方式，也可以采用柱层析的方式。操作过程包括：吸附剂平衡与活化、加样吸附、洗涤和洗脱。

133 物理吸附法 物理吸附法的原理目前还不十分清楚。有关固体表面的吸附理论以郎格茂的吸附理论较为著名。他认为，在固体内部各个原子（或原子团）的吸引力可以平均地分配到周围原子或原子团上去，从而使吸引力场成为饱和平衡的状态。但在表面的各个原子或原子团的吸引力不能得到饱和，还有一面伸向空间，能够吸附住空间中与它邻近的其他分子，这种化合价力的剩余力量就是吸附剂吸附力的本质。常用来吸附酶的吸附剂有白土、活性氧化铝、磷酸钙胶、淀粉等。 吸附剂一般要经过预先洗涤与活化，然后在低盐、弱酸性或接近中性条件下加样吸附，吸附后如被吸附的酶不能用水或吸附介子质洗脱下来，可直接用它们洗除杂质。再在弱碱条件下进行洗脱.如果酶仍洗脱不下来，可以提高离子强度，在上述洗脱剂中加入5％-10％的硫酸铵。

134 洗脱液体积不应超过吸附剂的体积。洗脱方式一般采用静态法，先加入少量的吸附剂，以吸附除去部分杂蛋白，此时允许有5％-10％左右的酶损失，除去这部分吸附剂后，再加入新鲜吸附剂，亦允许溶液有10％左右的酶残留，以免把大量杂蛋白吸附下来.若以柱层析法进行，由于吸附颗粒较小，流速慢，往住于1份吸附剂中加入3-5份纤维素混匀后装柱，加样平衡后以阶梯或线性梯度洗涤和洗脱。 比如：用高岭土吸附菠萝蛋白酶。将八成熟的菠萝去皮，压榨，过滤（或离心）取上清液（此时pH约为4-6)，加入5％的高岭土，搅拌吸附一定时间后，分离，收集吸附土，用NaCO3调pH ，然后加NaCl或硫酸铵进行沉脱，当洗脱液的体积达到原菠萝汁体积的1/5时，其洗脱率为70％-85％。

135 羟基磷灰石吸附法 羟基磷灰石是一种微晶型磷酸钙，其吸附原理，一般认为是，吸附剂表面的Ca2+与蛋白质带负电荷的基团，以及吸附剂表面的磷酸根离子与蛋白质带正电荷的基团之间相互作用的结果。它的吸附容量较大，一般可达50g/L床体积。也是低离子强度、中性或弱酸条件下吸附。多以柱层析的方式进行、洗脱时应提高离子强度；如以静态方式，则需平衡吸附0.5h。如有不可逆吸附，需用1mol/L EDTA透析或0.1mol/L NaOH或1mol/LHCl洗涤。

136 离子交换色谱法 离子交换色谱吸附 (Ion-Exchange Chromatography) 法是利用离子交换剂为载体，这些裁体在某一定pH条件下带有一定的电荷，当带有相反电荷的酶分子通过载体时，由于静电引力就会为载体吸附。由于各种蛋白质和离子文换刘在不同的条件下具有相应的不同的解离性状。因此，通过选择离子交换剂、控制交换和铣脱条件，就可以将酶和杂蛋白分离开来。 (1) 离子交换剂 一般由一高分子支持物和一功能基团（又叫离子交换基）两部分组成。离子交换剂据支持介质的不同有离子交换树脂、离子交换纤维素、离于交换凝胶等。

137 ① 离于交换树脂：以聚苯乙烯及其衍生物为骨架导人相应的离子交换基组成。如商品树脂：Dowex（美国）、#704、#724、#732（上海树脂厂）、101（华南制药厂）等都属于此类。这类离子交换剂由于网眼较小，生物大分子只能吸附在其表面．因此吸附容量较小；其离子交换基排列紧密．对生物大分子吸附太牢，必须用强烈条件洗脱，往往引起生物大分子变性；更主要是由于带有疏水骨干，易引起变性等原因．主要用于无机化学、水的纯化、抗生素及氨基酸分离提取等方面。其中，属于弱酸或弱碱型的树脂也可用于酶的分离，例如：用101（弱阴性）分离葡萄糖氧化酶；AmberliteCC-50（弱阳性）分离纤维素酶。

138 ②离子交换纤维素: 是目前酶分离纯化工作用得极为广泛的一种离子交换剂。它以长链开放性的纤维素为骨干导入相应的交换基组成，具有较大的表面积，吸附容量较大，对酶吸附不牢，用温和条件可洗脱下来而不致引起酶变性，同时应用时其层析柱在广泛的pH和盐浓度范围不会发生体积变化，有利于层折分离。 ③离子交换凝胶: 以交联葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶等为骨干，导入相应的交换基组成.其交换容量较纤维素更大 ( mmol/g干胶），同时具有分子筛作用，广泛用于酶的分离工作。但易随所用缓冲液pH和离子强度的不同，其交换容量、床体积及流速都可能发生变化。

139 离了交换剂的功能基团是离子交换基。它是离于交换剂表现功能的基础，其性质决定着离子文换剂的类型和强弱。带阳电荷离子交换基的文换剂在离子交换过程中吸附阴离子，故称阴离子交换刑；带阴电荷交换基的交换剂可吸附阳离子，叫阳离子交换剂。另外．交换基有强弱之分：强酸型（硝酸基）、强碱型（季胺盐）、中等强弱型（磷酸基、仲胺基、叔胺基）、弱酸型（羧基）、弱碱型（伯胺基）。 所谓强弱型是根据交换基在不同pH条件下的解离状况而定：强型的在广泛pH范围内完全解离；而弱型的解离程度以及相关的交换容量都因pH的改变而显著不同。常用的离子交换剂的种类和性质如下表 ：

140 类型 形状 解离基团 pK值 交换当量(mmol/g) 特点
阴离子交换剂 氨乙基纤维素 纤维状 氨乙基 弱碱性 DEAE-纤维素 微粒状 二乙氨基 TEAE-纤维素 三乙氨基 10 碱性稍强 GE-纤维素 胍乙基 强碱性用于极高pH ECTEOLA 三乙醇胺+环氧氯丙烷 DEAE-Sephacel 球状 二乙氨乙基 1.4±0.1 DEAE-Sephadex A-25 3.5±0.5 A-50 QAE-Sephadex A-25 二乙氨乙基-2-羧丙基 3.0±0.4 DEAE-Sepharose 0.13±0.02 阳离子交换剂 CM-纤维素 羧甲基 3.6 P-纤维素 磷酸基 1-2 酸性较强用于低pH SE-纤维素 磺乙基 酸性强用于极低pH CM-Sephadex G-25 — 2.2 4.5±0.5 弱酸性 G-50 SP-Sephadex G-25 磺丙基 2.3±0.3 强酸性 CM-Sepharose CL-6B 0.12±0.02

141 (2)离子交换剂类型的选择 应考虑下列因素:
① 可参考电泳结果　　在中性或偏碱性条件下进行　电泳，向阳极移动饺快的物质，在同样条件下，可被阴离子交换剂吸附，向阴极移动快或向阳极参动较慢可被阳离子交换剂吸附，但也有例外。 ② 被分离酶的稳定性　　待分离酶在低于其pI的pH条件下稳定，可选用阳离子交换剂；在高于其pI的pH条件下稳定，可选用阴离子交换刘；在高于或低于其pI的pH条件都稳定的酶‘则可选用阳或阴离子交换剂。 ③ 如果待分离酶的pI＜6或＞9　　一般选用强型交换剂。因为弱型的阳离子交换剂在pH6以下、弱型的阴离子交换别在pH9以上不带电荷，失去交换能力，而强型的在广泛的pH范围内，都保持解离状态。如果待分离的酶可用强型，又可用弱型，但酶不稳定时，应优先选用弱型的。

142 (3) 离子交换剂的总交换容量 离子交换剂的总交换容量是指：每克干的离子交换剂带有有总的交换基的数目（含潜在的交换基）。但在工作中往往考虑实效交换容量；实效交换容数是指在实验条件下，实际可用于交换的交换基数目。它与介质pH、离子强度、温度、待分离酶分子的大小有关。缓冲液的pH取决于被分离酶的pI值、稳定性和溶解度，应使待分离酶与交换基带相反电荷，其起始pH在待分离酶pI值上下约1个pH单位为宜；缓冲液的离子强度影响交换容量；离于交换剂的颗粒大小主要影响分辨率和流速；其孔径大小也影响到酶蛋白的结合量。

143 (4) 离子交换层析的操作过程： 为了除去杂质和使交换剂充分溶胀，首先要将离子交换剂在水中充分浸泡，然后用碱酸反复处理。
包括离子交换剂的预处理及平衡、装柱及加样吸附、洗脱、洗脱液收集与相应检测、离子交换剂的再生。 　　为了除去杂质和使交换剂充分溶胀，首先要将离子交换剂在水中充分浸泡，然后用碱酸反复处理。 　　结合酸碱处理还可以用倾注法除去一些过细的颗粒和杂质。纤维素和凝胶对酸碱敏感，因而酸碱浓度一般不能超过0.5mol /L，时间应少于0.5h，葡聚糖在强酸中会发生水解，因此所用酸浓度一般不要超过0.2mol/L，处理时间亦应短些；聚丙烯酰胺凝胶在碱中不稳定，故应避免碱处理步骤。经过处理的离子交换剂在使用前要用起始缓冲液充分平衡到所要求的pH和离子强度。

144 离子交换剂 可供选择的缓冲物质、pH 平衡pH
　　装柱一般采用重力沉降法。在洗静的一定大小的层析柱中打开发夹，加入少量的起始缓冲液，以赶除泡，再沿玻棒加入交换剂，玻棒一端始终保持在液面以下，以免气泡产生。加毕，让其自然沉降。将柱灌满缓冲液并延至缓冲液贮备器上。加样时对样品的离子组成、pH、离子强度等都应和平衡缓冲液系统一致，加样量取决于层析柱的有效容量，一般控制在总交换量的1/4～1/3水平，其体积应控制在床体积1～5％，然后，用适宜的缓冲液扩展、洗涤和沉脱。洗脱的方式有三种：一是平衡等温洗脱，即用平衡缓冲液直接扩展洗脱；二是阶梯（或间歇）洗脱，即分段地改变缓冲液pH或/和离子强度进行扩展洗脱；三是梯度洗脱，即连续地改变缓冲液pH或/和离子强度进行扩展洗脱。离子交换层析可用的缓冲物质、pH如下表 ： 离子交换剂 可供选择的缓冲物质、pH 平衡pH 阴离子交换剂 阳离子：烷基胺、氨基乙醇、铵盐、乙二胺、咪唑基、Tris等 比pI高1 pH单位 阳离子交换剂 阴离子：乙胺、巴比妥、Gly、磷酸等 比pI低1 pH单位

145 梯度洗脱方向的选择如下表： 离子交换剂 pH 梯度改变方向 离子强度改变方向 阴离子交换剂 向pI方向降低 升高 阳离子交换剂 向pI方向升高 　　—般采用自动部分收集器收集洗脱液，用蠕动泵控制流速。收集的洗脱液用适当的方法测定蛋出质含量和酶活性，划出洗脱曲线.离子交换剂需再生，当收集完毕后，用蒸馏水冲洗至中性，再按预处理方法进行处理，收集于容器中，加入防腐剂，于冰箱内保存。

146 2.6.2电泳法 电泳的定义 　　带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳 (electrophoresis，简称EP)。 　　电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的一类实验技术。带电颗粒在电场中移动是物质的一种运动现象。移动的速度与颗粒带电的强弱、分离介质的阻力、电极液的粘度和电场强度等因素有关。生物大分子在电场中移动的速度除上述因素外还与分子形状、相对分子质量大小、分子的带电性质及数目等因素有关。

147 电泳发展 　　电泳现象早在1808年就已经被发现，但电泳作为一种分离技术却是在1937年由瑞典科学家Tiselius A首先提出来的，并设计出世界上第一台自由电泳仪，建立了“移界电泳”分离模式。他用光学方法观察到在电泳迁移过程中血清蛋白质界面的移动，首先证明了血清是由白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白组成的，为表彰他对电泳技术所做出的突出贡献，1948年他被授予诺贝尔奖。

148 20世纪50年代，以支持介质为主的电泳模式不断涌现，如滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉薄膜等。
60年代以后发展了以凝胶为主的支持物的电泳方法，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶电泳等。 1967年 Shapiro A L等在凝胶电泳的基础上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。 70年代以后根据不同需要推出了多种电泳模式，如圆盘电泳、垂直板电泳、双向电泳、脉冲电泳、等电聚焦电泳、印迹转移电泳等技术。 90年代又推出了分辨率极高的高效毛细管电泳。多年来科学家们对电泳结果的分析做了大量的工作，建立了各种实验方法，电泳后对分离物质可以用染色、扫描、紫外吸收、放射自显影、生物活性测定等方法进行分析，得到所需数据。

149 电泳的基本原理 (1)带电颗粒 溶液中任何物质由于其本身的解离或表面吸附其它带电质点而带电，在电场中就会发生迁移，移动方向取决于它们的带电符号。 NaCl → Na+ + Cl – 生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于溶液终的H+浓度

150 (2)电泳迁移率(mobility) 　　如果把生物大分子的胶体溶液放在没有干扰的电场中，使带电颗粒具有恒定迁移率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Q和电位梯度E，即： F = QE (1) 带电颗粒在迁移中同时受到来自于介质的摩擦力F’，对于球形颗粒来说，在自由溶液中此阻力服从Stock定律： F’ = 6π r η v (2) 这里v是在介质粘度为η的溶液中，半径为r的带电颗粒的移动速度。但在凝胶中，这种阻力并不完全符合Stocks定律。F’还取决于介质中的其它因素如凝胶厚度、颗粒大小和介质的内渗等。

151 当带电颗粒达到稳态运动时，F=F’，由(1)、(2)式推导出：
（3） 不同的带电颗粒在同一电场中运动速度不同，其泳动速度用迁移率（或称泳动度）m来表示，定义为在电位梯度E (V/cm) 的影响下，颗粒在时间t(s)中迁移距离d(cm)，即在单位电场强度 (1 V/cm) 时的泳动速度： （4）

152 将(3)代入(4)，得到 Q m = ———— (5) 6πr 由上式可看出电泳迁移率与球形分子、介质粘度、颗粒所带电荷有关。在确定的条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的物化特性常数。从(4)式可以导出迁移率的单位是cm2·s-1·V-1。

153 (3)带电颗粒的移动速度v与电位梯度E、电流密度J和导电性K的关系
　　如果在同样实验条件下对某蛋白溶液做两个电泳试验，一个试验用两倍的时间一倍的电压，另一个试验用一倍的时间两倍的电压，从理论上讲，这两个试验中蛋白质的迁移距离应该是相等的。但是实际上只能是大致相等，原因是在电泳过程中还有其他因素的干扰，如在增加电压的同时也增加了热效应。移动的速度决定于其分子的形状、相对分子质量的大小、分子带电性质及数目，还与分离介质的阻力、溶液粘度及电场强度等因素有关。

154 我们把带电颗粒的移动速度用以下公式表示 v = m·E= m·J/K (6) 由此可以看出，带电颗粒的移动速度v等于电位梯度E和迁移率m的乘积，与电流密度J和迁移率m的乘积成正比，与溶液的导电性K成反比。也就是说，电场强度越高电泳速度越快；溶液的导电性越强，电泳速度越慢。因此电泳速度随着电位梯度或溶液的导电性的变化而改变。

155 电泳的分类 按分离原理分类 (1)区带电泳 (zone electrophoresis, ZEP)：是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后在介质上加电场，带电颗粒在支持介质上或支持介质内迁移，在电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带 (图3-2a)，这是当前应用最广泛的电泳技术。 (2)移界电泳 (moving boundary electrophoresis, MBEP)：是把电场加在生物大分子溶液和缓冲溶液之间的界面上，带电颗粒的移动速度通过光学方法观察界面的移动来测定(图3-2b)。 (3)稳态电泳 (steady state electrophoresis)：带电颗粒在电场作用下电迁移一定时间后达到一个稳定状态，此后，电泳条带的宽度不随时间的变化而变化，如等速电泳 (isotachophoresis, ITP)、等电聚焦电泳 (isoelectric focusing, IEF) (图2c、2d)。

156 a 区带电泳 b 移界电泳 c 等速电泳 d 等电聚焦
各种电泳分离原理示意图 a 区带电泳 b 移界电泳 c 等速电泳 d 等电聚焦

157 2.6.3 聚焦层析 　　聚焦层析 (Chromatofocusing) 兼有等电聚焦电泳和枝层析两种方法的优点，它是在层析柱中填满多缓冲交换剂 (如pH7-9)，加样后以特定的多缓冲剂滴定或淋洗时，随着缓冲液的扩展，便在层析柱中形成一个自上而下的pH梯度，而样品中各种蛋白质按各自的等电点聚焦于相应的PH区段，并随pH梯度的扩展不断下移，最后便分别从层析柱中洗出。例如多元缓冲交换剂其pH可在6-9之间，使用时将其pH调到9 (起始pH)。将多元缓冲液 (pH6-9)的pH调至7 (极限pH)来淋洗层折柱，此时在层析柱内便形成了自上而下的pH7-9的梯度，样品中蛋白质等电点在7-9的便按照自己的等电点在pH7-9的相应的pH区段聚焦，由于多缓冲液在不断淋洗，这个pH7-9的梯度便不断下移，样品中各组成最后按照其等电点的pH分别被淋洗出来。因此，聚焦层析可以分为以下步骤进行操作：

158 (1)按照样品等电点选择适宜的多缓冲液或多缓冲剂。
(2)调整多缓冲液pH至梯度上限，以该多缓冲液平衡多缓冲剂，然历装柱。 (3)调整多缓冲液的pH至下限，以此PH缓冲液5-10ml流洗层析柱。 (4)加样，以下限pH多缓冲液洗脱，分部收集并检测。 (5)多缓冲剂再生。 一些聚焦层析的多缓冲液与胶如下表。

159 pH范围 胶 起始缓冲液 洗脱液 稀释系数 近似体积 梯度起始前 梯度 总体积
10.5-9 PBE118 pH 11 — 10.5-8 0.025mol/L 二乙胺-HCl pH8.0 Pharmalytic pH HCl 1:45 1.5 11.5 13.0 10.5-7 三乙胺-HCl pH7.0 Pharmalytic 2.0 13.5 9-8 PBE 94 pH9.4 0.025mol/L 乙醇胺-HCl 10.5 12.0 9-7 乙醇胺-HCl pH7.0 Polybuffer 96-HCl 1:10 14.0 9-6 0.025mol/L 乙醇胺-CH3COOH pH6.0 Polybuffer 96- CH3COOH 8-7 pH8.3 0.025mol/L Tris-HCl 1:13 9.0 8-6 0.025mol/L Tris- CH3COOH 3.0 9,0 8-5 Tris- CH3COOH pH5.0 Polybuffer 96(30%)+Polybuffer 74(70%) - CH3COOH 8.5 7-6 pH7.4 0.025mol/L 咪唑 CH3COOH 1: 7.0 10.0 7-5 0.025mol/L 咪唑 HCl Polybuffer 74- HCl 1:8 2.5 7-4 pH4.0 6-5 pH6.2 0.025mol/L 组氨酸 HCl 8.0 6-4 5-4 0.025mol/L 哌嗪HCl

160 2.7 根据亲和作用建立的纯化方法 由于酶对底物、竞争性抑制剂、辅酶等配体具有较高的亲和力，而其他杂蛋白对它们没有或有很弱的亲和作用，因此，可以根据酶、杂蛋白对配体亲和力的差异，很容易地将酶分离出来。已建立的方法有亲和层析、亲和电泳法等。 2.7.1 亲和层析法 　　亲和层析的核心是亲和吸附剂。亲和吸附剂一般是由固相载体和能与目的酶专一可逆结合的配体共价结合而成的。将亲和吸附剂填充层析柱，让酶溶液流过层析柱，则目的酶能迅速而又选择性地吸附在亲和吸附剂上，用适当的溶液进行洗脱，除去一些非专一性的杂质后，再用浓度高的或亲和力强的配体溶液进行亲和洗脱，酶便脱离层析柱上的配体而流出柱外。亲和层析法的过程如下图：

161

162 2.7.1.1载体 固相载体可采用纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶或交联琼脂糖凝胶(Sepharose CL-4B、6B)等，但一般认为．琼脂糖凝胶和交联琼脂搪凝胶较好。
作为载体应符合以下要求： (1) 具备和配体进行偶联反应的大量功能基团。 (2) 必须是亲水性的，具有一定的机械强度、结构疏松， 以便能使酶与配基自由地接触. (3) 惰性，没有或很少非专一性吸附. (4) 化学性质稳定，能适应偶联、吸附、洗脱等操作过程中各种pH、温度、离子强度,甚至变性剂如脲、盐酸胍等反复处理，并有良好的流体力学性质。

163 配体和臂 配体要性质适当，要使配体连在载体上往往需耍经过几步反应。直接将配体偶联于载体上得到的亲和层析剂，常因配体和载体间相距太近，而酶的活性中心一般又处在酶分子的内部，往往影响到酶与配体间的亲和作用。如果在配体和载体间加上一连接臂，便可提高亲和作用。 (1) 配基的选择 利用亲和层析纯化酶，配基的选择具有较重要的作用。配基一般要求符合以下的要求： ① 配基-酶的解离常数的选择范围应大于10-8 mol、小于10-4 mol，如果解离常数太小、配基与酶的结合太强，亲和洗脱困难；解离常数太大，酶与配基的结合太松散，不能达到专一性亲和吸附的目的。

164 ② 配基上必须具有供偶联反应的活泼基团，而且当它们与载体（或臂）结合后，不能影响酶的亲和力。
③ 配基的偶联量太高也会造成过强的亲和吸附而洗脱困难，同时带来空间位阻和非专一性吸附，偶联量太低时，造成分离效率低，一般配基偶联量应控制在1-20umol/ml膨润胶左右。 (2) 对长臂要求 如果载体与配基间的距离太近，往往需要加臂，以改善吸附效果。臂的长短必须适合，太长，易断裂并往往产生非专一性吸附；太短起不到应有效果。一般对臂有如下要求： ① 具有与载体和配体进行偶联反应的功能基团。 ② 要能经得起偶联、洗脱等操作过程的化学处理和条件的变化。 ③ 亲水，但又不能带电荷。在实践中常采用的配体有：碳氢链类，如αω-二胺化合物、、Αω-氨基羧酸；聚氨基酸嘞，如聚DL-丙氨酸，聚DL-赖氨酸等；某些天然蛋白质如白蛋白等。

165 亲和尼析不但用于酶的分离纯化，而且还可应用其他生物分子的分离纯化，如下表列举了—些互为配基的物质。
　　亲和尼析不但用于酶的分离纯化，而且还可应用其他生物分子的分离纯化，如下表列举了—些互为配基的物质。 酶 底物类似物、抑制剂、辅因子 凝集素 多糖、糖蛋白、细胞表面受体、细胞 抗体 抗原、病毒、细胞 核酸 互补碱基顺序、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白 激素、维生素 受体、载体蛋白 细胞 细胞表面专一蛋白、凝集素

166 亲和层析的操作过程 　　亲和层析和其他层析的操作过程基本相似，在制备了亲和吸附剂后，进行预处理与平衡、装柱、加样、洗涤和洗脱、以及脱盐与再生等基本过程。亲和吸附与pH、离子强度、温度等吸附条件有关。因此，首先要确定一个吸附的最适条件。吸附剂与样品间的比例有一定的关系，样品体积一般控制在床体积的1-5％。蛋白质浓度不要超过20-30mg/m1。层析柱的长度和大小、流速与分离效果也有一定的关系，应视吸附剂亲和力大小而定，流速一般约为10m1/cm2·h。 　　洗涤与洗脱。洗涤是为了除去杂质，一般用平衡时所用的缓冲液进行洗涤。洗脱的条件是在不引起酶变性失活的情况下，尽量削减酶与配基间的相互作用力而使酶从吸附剂转移至洗脱液中来，一般分为非专一性洗脱和专一性洗脱。 　　非专一性洗脱，根据洗脱条件可采用多种方法：

167 (1)改变温度的洗脱．有些酶如吸附于Amp-Sepharose上的激酶和脱氢酶，只要用线性温度梯度洗脱，就能达到洗脱的目的。解吸过程一般是吸热过程，因此提高温度可解吸。
(2)改变pH、离子强度及溶剂系统组成进行洗脱。亲和作用力中静电引力、范德华力、疏水作用都是一些重要的相互作用力。改变pH和离子强度来降低和削弱静电作用，甚至使酶和配基间的引力转变为排斥力；另外加入与水混溶的溶剂如乙二醇、二甲基砜等能降低溶剂表面的张力，或加入促溶离子可以破坏水的结构并削弱疏水作用也可以达到较好的洗脱效果。 专一性洗脱，首先是亲和洗脱，即使用浓度更高的配基溶液或亲和力高的底物溶液进行洗脱，如用马铃薯淀粉吸附淀粉酶、鱼肌磷酸化酶，可以糖原溶液洗脱。其次是电泳洗脱，被吸附在吸附剂上的各种物质，当置于电场中时，便会按照其荷电性质向相反的方向移动，这样也可以达到洗脱目的（如下表）。

168 配基 专一性 应用 洗脱 Con A- α-D-葡萄糖苷 或 α-D-甘露糖苷残基 糖蛋白、膜蛋白、糖脂质、多糖等
游离糖(甲基-α-D-葡萄糖苷)：脉冲或梯度洗脱(0-0.5mol/L); 或降低pH至3以下; 或用硼酸缓冲液(0.1mol/L, pH6.5) 小扁豆凝集素 类似于Con A, 但较弱 膜蛋白、糖蛋白 游离糖(甲基-α-D-葡萄糖苷)：脉冲或梯度洗脱(0-0.1mol/L) 麦胚芽凝集素 N-乙酰-β-D-葡萄糖胺残基 糖蛋白、多糖细胞 (如T-淋巴细胞) 游离糖(N-乙酰-β-D-葡萄糖胺)：脉冲或梯度洗脱 蜗牛凝集素 N-乙酰-α-D-半乳糖胺残基 细胞 (如T-淋巴细胞)、糖蛋白 同上 Poly (u)- Poly A, 寡聚 A- mRNA、植物核酸、干扰素 甲酰胺(90%)，提高温度 Poly (A)- Poly u, 寡聚 u- hnRNA、病毒核酸、mRNA结合蛋白、RNA聚合酶、抗核酸的抗体 甲酰胺(90%)洗脱RNA，升高离子强度洗脱蛋白 Lysine 酸性蛋白 血纤维蛋白溶酶原或血纤维蛋白溶酶原激活剂、rRNA 专一试剂(0.2mol/L氨基己酸) 升高离子强度( mol/L NaCl) Cibacron 蓝 (Blue Dextran) 广泛 广泛范围(>50种)需要核苷酸的酶、清蛋白、α2-巨球蛋白、干扰素 游离辅助因子如NAD+(0-0.2mol/L); 升高离子强度(0-1mol/L NaCl); 降低或升高pH 5’-AMP 或 2’,5’-ADP NAD+ 类似物 NADP+ 需NAD(P)+的脱氢酶、需ATP的激酶 游离辅助因子如NAD+, NAD+(0-0.2mol/L); 升高离子强度(达1mol/L); 降低或升高pH

169 （1）亲和吸附剂制备 一般多糖类载体如琼脂糖、葡聚糖、纤维素等的活化常用溴化氰。如琼脂糖的活化：
　　另外，使用一些蛋白质可逆变性剂，如脲、盐酸胍等，在低pH条件下使酶构型发生可逆变化从而解离下来，并很快从酶溶液中除去这些物质。有时采用酶促降解配基或载体，或者其他化学方法来断裂配基-酶间化学键而达洗脱目的。 　　吸附剂再生，一般采用合0.5mol/L NaCl的pH8.5、0.1mol/L Tris-HCl缓冲液洗至pH8.5，再用含有0.5mol/L的0.1mol/L pH4.5的醋酸缓冲液洗至pH4.5，然后用水洗至中性，用时再用起始缓冲液平衡。 亲和层析举例 （1）亲和吸附剂制备 一般多糖类载体如琼脂糖、葡聚糖、纤维素等的活化常用溴化氰。如琼脂糖的活化：

170 先将载体用大量的0.1mol/L NaOH和水充分洗涤后悬浮水中，使总体积为凝胶总体积的1倍，在搅拌下依次加人溴化氰（一般每毫升压紧的琼脂糖加入 mg，也用到 mg)，用NaOH调pH，使pH保持在pHll左右，并保温（30℃左右）10-20min，至BrCN完全溶解．此时pH变化越来越慢，再转入砂蕊漏斗，抽滤，并迅速用5-10倍体积的冷水洗涤，使得到亚氨碳酸盐。此中间化合物非常活泼，成键能力很高，它再与氨基化合物偶联：

171 此反应在弱碱性条件下进行。将上述抽干并洗涤的中间化合物转移到含有偶联物（如R-NH2）的缓冲液中，搅拌均匀 (2-3min内完成），放至4℃缓慢搅拌至少12h，后再用水充分洗涤。再将凝胶悬浮于4倍体积的1mol/L 甘氨酸溶液中，在室温下反应4h，或在4℃下反应12h，以除去载体上可能残留的活性基团。

172 为了简便，现有一改良的方法，它是在磷酸盐中进行。先将洗过的凝胶悬浮在等体积的2mol/L的Na2CO3溶液中，在冰浴下缓慢搅拌至5℃，边搅拌边加入溴化氰溶液（每毫升乙腈中溶有2g BrCN），反应2min后，抽滤，其余操作同上述。 聚丙烯酰胺的活化：

173 　　其操作是，先将凝胶悬浮在1.3倍容积的水中，加人3-6mol/L的水合肼，置于密闭容器中，在45-50℃振荡。反应至少8h。再转入漏斗中，用0.1mol/LNaOH洗涤至水合肼除去，再将此凝胶50m1悬浮于100ml0.3mol/L HCl中，冷却后加入10m1 1mol/LNaNO2，搅拌2-5min，迅速用0.3mol/L HCl洗涤，复用0.1mol/L氨基磺酸洗，再用冷水洗。然后转移至含氨基化合物的碱性缓冲液中、4℃反应1-2h。用蒸馏水洗涤后悬浮在2mol/L NH4Cl lmol/L NH4OH溶液中(pH8.8)，反应4h，使没有作用的酰肼及叠氮仍回复到原来的酰胺基。

174 用硅烷可活化多孔玻璃，硅烷的脂可与玻璃表面的羟基缩合，在有水时
式中的X可以是氨基、卤素、巯基或其他活性基团。

175 A.下面以琼脂糖为例，说明活性载体与臂、配基的连接的方式：
将臂胺烷基化合物NH2(CH2)nNH2先连接在载体上，制得ω-氨烷基琼脂糖，以此为中心，通过各种化学反应加长臂或与配基连接。这里有多种方法，最常用的是从ω-氨烷基制得N-羟基琥珀酰亚胺衍生物。制备方法如下： ①琼脂糖经BrCN活化后先接上二胺化合物：-NH-(CH2)n-NH2 ②上述氨烷基琼脂糖100ml悬浮于100m1水中，加入琉珀酸酐(100mol/L)，用5mol/LNaOH 调pH6，30℃保温至pH木再发生变化后在4℃反应5h以上，再用2ml水在室温下洗涤，再加0.1mol/L NaOH于24℃放置30-40min：

176 ③上述物用2L水、用1L二氧六环洗后，将凝胶悬浮在300ml二氧六环中，再用300-400ml甲醇洗去沉淀的二环乙基尿素。最后用300ml二氧六环洗涤即得N-羟基琥珀酰亚胺衍生物：

177 若用偶联含-NH2配基时，可将凝胶中二氧六环迅速抽干，边搅拌边加入溶于缓冲液的配基（加入量为凝胶体积的二倍），在4℃下反应10min到6h。配基缓冲液可用柠檬酸、磷酸、乙酸或碳酸氢盐，pH5-8.5。然后再用1mmolGly在pH9保温2h，最后洗净：

178 B. 通过一系列有机化学反应使臂先加长接上配基，然后再连接溴化氰活化的载体上。如以琼脂糖凝胶为载体，氨基己酸为臂，对氨苯基三甲基溴化铵为配基制备亲和层析剂的过程如下：

179 2．用亲和层析纯化酶制剂实例 (1) 溶菌酶的亲和层析　溶菌酶的亲和层析可用细菌细胞壁作配基，溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)经超声波处理破碎细胞，悬浮在缓冲液中加入溶菌酶保温一段时间后，停止反应，离心除去不溶物，上清液冻干后即为溶壁微球菌细胞壁的水解产物。Separose 4BD经BrCN活化后，加上上述水解产物，在pH10反应一定时间。停止反应后，洗净，每克凝胶可偶联68mg配基。此亲和吸附剂可使白血病患者血液中溶菌酶纯化 倍，活力回收达80％。 (2) 淀粉酶的亲和层析　六圆或七圆环状糊精是淀粉酶的抑制剂，可作为配基，纯化淀粉酶。琼脂糖凝胶用环氧化物活化作为载体，在碱性条件下与七圆状糊精偶联制成亲和吸附剂： 吸附后，用七圆环状糊精洗脱，可纯化酶180倍，活力回收达90％。

180 (3) 醇脱氢酶的亲和层析 一些需要NAD+、NADP+的脱氢酶及一些需ATP的激酶因其具有特殊的结合部位，可以与蓝淀粉形成复合物，如乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油激酶和AMP激酶等可与蓝淀粉结合。因此将载体偶联于配体上，可以用来纯化这些酶。如琼脂搪经BrCN活化后，在碱性条件下可与蓝淀粉直接偶联。

181 有人从棉籽中纯化醇脱氢酶。棉籽匀浆，做成丙酮粉，用冷水抽提，抽提液上上述吸附剂层析柱，用NAD+洗脱液洗脱，酶被纯化40倍，活力回收50％，而且这种吸附剂可反复使用几十次。这类方法又称染料配体层析。
2.7.2 亲和电泳 　　用亲和配基共价偶联于电泳凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶）上，由于亲和作用，待分离酶与配基结合后，在电泳中不会移动，而其他杂蛋白不与配基结合，将按照其电泳淌度分离开来。以聚丙烯酰胺凝胶亲和电泳为例，需制备三种胶： (1) 浓缩胶。其作用是将样品浓缩成薄层。由厚度约5mm的大孔径胶组成。 (2) 亲和胶。也是厚度约5mm的大孔径胶组成，凝胶上共价偶联了亲和配基。 (3) 分离胶。长约5-6cm，由不带配基的小孔径胶组成。 其操作与圆盘电冰相似。该方法分离量小。

182 2.7.3 其他 免疫吸附层析 　　根据抗原与抗体具有高度专一性亲和作用的原理，将某种酶的抗体连接到不溶性的载休上，再用这个带抗体的层析柱来分离相应的酶。操作过程如下： ①以传统的方法制备纯酶并免疫动物（家兔）。 ②然后用免疫沉淀法或其他免疫化学方法检测免血中的酶抗体。 ③从免血中分离纯化出酶抗体． ④将抗体连接到经BrCN活化的琼脂糖凝胶上，凝胶装柱，平衡。 ⑤将粗制的抗原（酶）样品上柱、洗涤、铣脱。

183 2.8 根据稳定性的差异建立的分离纯化方法 2.7.3.2 疏水作用层析法 2.7.3.3 共价层析法 2.7.3.4 金属螯合层析法
　　根据酶和杂蛋白在稳定性上的差异而建文的纯化方法常有：热变性法、酸碱变化法和表面变性法等。 2.8.1 热变性法 　　如果待分离酶是耐热的而杂蛋白不耐热，此时，可用热变性法。在待分离酶的热稳定性范围内，将酶溶液加热列一定的温度并维持一定时间后立即冷却，此时酶不会变性，而杂蛋白却因受热变性而凝固，然后用离心、过滤等方法将它们除去，酶得到纯化。例如，从植物材料中提取α-淀粉酶，将酶溶液维持在70℃左右10-15min，β-淀粉酶及其他杂蛋白受热而凝固。 而α-淀粉酶在70℃稳定，对其活力影响不大，从而可纯化α-淀粉酶。有时为了提高目的酶的稳定性，增加目的酶和杂蛋白之间稳定性的差别，在热处理前，加入该酶的底物或辅酶、竞争性抑制剂，对巯基酶来说，加入巯基保护剂等，以提高目的酶的稳定性。采用这种方法时，应严格控制保温时间和pH条件。

184 2.8.2 酸碱变性法 　　酸碱变性法与上述方法基本相似。在待分离酶的酸碱稳定范围内，将酶溶液调至一定的pH，并维持一定时间，某些杂蛋白质，因超越其酸碱稳定范围而变性凝固，但待分离酶不变性而仍留在溶液中，然后采用一定的措施将凝固的杂蛋白质除去。例如．从麦芽中提取β-淀粉酶时，将酶溶液调pH至3时，α-淀粉酶和某些不耐酸的杂蛋白变性凝固，而β-淀粉酶由于耐酸而不会变性。 　　在酶的纯化过程中，往往将热变性法和酸碱变性法结合起来运用，能除去大量的杂蛋白，使酶的比活力得到提高。但与热变性法相比，酸碱变性法用得较少些。

185 2.8.3 表面变性法 　　表面变性法可将酶溶液与惰性液体混合，振荡，造成表面变性。如过氧化物酶、α-淀粉酶及醇脱氢酶的分离，于酶溶液中加入氯仿，振荡后，通常分为三层：上层为未变性的蛋白、中间层为乳浊状变性蛋白、下层为氯仿。也可以利用泡沫的形成达到表面变性。如通氮气于磷酸核糖变位酶溶液和核糖磷酸化酶溶液中，变位酶发生表面变性而分离磷酸化酶。有人设汁的泡沫分离器可从发酵液提取链激酶。前一种方法需严格控制时间、后者主要是控制泡沫大小及泡沫形成时间，同时与pH的关系亦甚大。

186 2.9 蛋白质（酶）的高效液相色谱分离分析法 　　色谱法是一种重要的分离分析方法，它是利用不同的物质在两相中只有不同的分配系数（或吸附系数、渗透性），当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行多次反复分配而实现分离。在色谱技术中，流动相为气体的称为气相色谱，流动相为液体的称为液相色谱。固定相可以装在柱内，也可以做成薄膜，前者称为柱色谱，后者你为薄膜色谱。根据色谱法制成的仪器便称为色谱仪。目前主要有气相色谱仪和液相色谱仪。

187 　　色谱法是1905年俄国植物学家茨维特发明的，他将植物色素的石油醚提取液倒入一根装有碳酸钙的玻璃管顶端、用石油醚淋洗玻璃管，使色素出现分离，在管内显示出不同的色带。色谱一词由此得名，并沿用至今。1952年詹姆斯和马丁以气体作为流动相分析了脂肪酸同系物，并提出了塔板理论。1956年范第姆特总结了前人的经验，提出了反应载气流速和柱效关系的范第姆特方程，建立了初步的色谱理论。同年高莱(Golav)发明了毛细管及以后相继发明了各种检测器，色谱技术更加完善。气-质联用仪是50年代末期涌现的，它克服了气相色谱不适于定性的缺点。到了60年代，由于检测技术的发展和高压泵的问世,高效液相色谱迅速发展，使色谱法的应用范围大大拓展。目前，由于高效能的色谱柱、高灵敏的检测器及微机的使用，色谱法巳成为应用广泛的分析仪器。本节重点介绍液相色谱法在分离分析蛋白质（酶）等物质的应用。

188 　　气相色谱法只能分析在操作温度下能汽化而又不分解的物质，据统计,在已知化合物中这类物质只占15％。而液相色谱法大都是在室温下操作，而且，所用的流动相可以具有一定pH、含盐的缓冲水溶液【这与蛋白质（酶）的生理液相和条件相似】。有时，也能使用与水混溶的有机溶剂。同时，所用填料（支持物）的表面经过了各种相应的化学修饰和覆盖，为生物大分子的分离分析提供了温和的条件和“软接触”的表面，有利于保持（护）它们原有的构象和生理活性。因此，液相色谱法作为蛋白质（酶）以及其他生物大分子的分离分析技术，有着广阔的前景。

189 2.9.1 高效液相色谱法简介 HPLC的组成 高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatagraphy, HPLC)的原理与经典液相色谱相同，但是，出于它采用了高效色谱柱、高压泵和高灵敏检测器，因此，它的分离效率、分析速度和灵敏度大大提高了。 高效液相色谱仪由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统组成（下图）。

190 (1)输液系统 包括： ① 流动相贮存器，由不锈钢或玻璃制成，可以贮存不同的流动相（图中A, B)。 ②高压泵，需要达到下列条件：能提供 kg/cm2的压强，流速稳定，流量可以调节，耐腐蚀。高压泵的分类，按排液性能可分为恒压泵和恒流泵。按机械结构，又可分为液压隔膜泵、气动放大泵、螺旋注射泵和往复柱塞泵四种，前两种为恒压泵，后两种为恒流泵。 ③梯度淋洗装置，它可以将两种或两种以的不同极性的溶剂，按一定程序连续改变组成 。可分为外梯度装置和内梯度装置，前者为流动相在常压下混合，靠高压泵压至色谱柱；后者是先将溶剂分别增压后，再由泵按程序压入混合室，再注入色谱柱。 HPLC多采用六通阀进样。先由注射器将样品在常压下注入样品杯，然后切换阀门到进样位置，由高压泵输送的流动相将样品送入色谱柱。样品的容积是固定的，进样重复性好。

191 ⑵分离系统 包括色谱柱、连接管、恒温器等：
①色谱柱长10-30cm，内径为 mm的内部抛光的不锈钢管制成，柱内装有固定相，液相色谱的固定相是将固定液涂在担体上而成。担体有表面多孔型担体和全多孔型担体两类。目前采用粒度为5-10um，由纳米级硅胶微粒堆积的叫堆积硅珠的全多孔担体体。 ②当要用两根以上色谱柱时，柱与柱间常使用厚壁聚四氟乙烯毛细管连接。 ③为改善传质、提高柱效和缩短分析时间，分析常用带有室温到60℃间可调节的恒温加热系统的金属夹套来保持色谱柱的温度。检测系统常根据需要，采用紫外检测器、示差析光检测器和荧光检测器等。HPLC的数据系统包括进行数据采集、贮存、显示、打印和数据处理工作。

192 HPLC的选择与类型 　　蛋白质（酶）的种类繁多，理化性质各异，要从复杂的生物物质中分离出某种蛋白质（酶）面临着的问题也就不同了。这就要求我们采用不同类型的色谱柱以满足不同的要求。如在实舱室小规模分离分析时，—般使用分析型 HPLC，但随着分离分析规模扩大时，则必须使用制备用液相色谱仪。制备用的液相色谱仪，其共同特点是柱长和柱径都比较大（最大为2.3m×0.1m)。柱长和柱径的选择依制备的目的和产量而定。对于大口径柱子，泵系统的输流能力可达100ml/min。大多数制备用色谱仪配有微电脑控制的自动收集系统，可对目的的样品中成分进行选样性收集，但对含量较大顺不复杂的样品，自动收集没有手工收集方便。手工收集还可循环进行纯化操作。 　　HPLC其分离机理的不同，可以分为体积排阻色谱、离子交换色谱、反相色谱及高效疏水作用色谱。

193 2.9.2体积排阻色谱 体积排阻包谱(Size Exclu Chromatogyaphy, SKEC是一种纯粹按照溶质子在流动相中的体积大小而分离的色谱法。其填料具有一定大小的孔径，大分子不能进入填料内部而从颗粒间最先流出色谱柱；小分子能进人填料颗粒内部，其路径较遥远而后流山：此时，若选用水系统作为流功相的话．义称为凝胶过滤色谱(GFC)。有两种类型商品载体用于蛋出质的高效排阻色谱，即表面改性硅胶和亲水文联有机聚合物。表而改性的硅胶又有许多蛋白质疑胶过滤填料所应有的性质,能很好地保持溶质的生物活件，回收率可达80％以上。改性硅胶的粒径一般为10-15um，孔极为5-400nm。从理论上讲，它完全符合球蛋白分子量5000到数百万的范围。但事实上，大孔径填料的柱效低，而小孔径填料对低分产量的多肽有吸附作用，使用25-30nm孔径的填料最为合适，这样的填料兼顾了分级范围、分辨率和回收率，可分离5,000-5,000,000分子量范围的蛋白质。

194 排阻色谱的流动相比较简单，流动相的pH一般选用pH6. 5-8
　　排阻色谱的流动相比较简单，流动相的pH一般选用pH 范围内。有时为了控制蛋白质与固定相间可能发生的相互作用，通常在流动相中加入中性些中性盐或有机改性剂。流动相的流量一般为1ml/min。 　　高效排阻色谱法应用于蛋白质（酶）的分离纯化，活力回收多。现己达到或超过凝胶过滤水平，在分离时间上缩短了100倍。 右图是排阻色谱法分离蛋白质的标准柱。 1.谷氨酸脱氢酶 2.乳酸脱氢酶 3.烯醇酶 4.腺苷酸激酶 细胞色素C

195 2.9.3 离子交换色谱 离子交换色谱(Ion Exchange Chromatogmphy, IEC)法是多年来人们常用的蛋白质分离纯化方法之一，至今仍是很受欢迎的。这是由于IEC的介质材料以及含盐的缓冲流动相系统都十分类似蛋白质的生理环境，有利于增加活性回收。 IEC是利用离子交换原理和液相色谱技术相结合的—种方法。它利用不同的蛋白质解离时电学性质不同，从而对IEC中固定相亲和力的不同来实现分离的。IEC的固定相是以苯乙烯-二乙烯基苯共聚物为树脂核，树脂核外是一层可解离的无机基团，由于可解离基团解离时电学性质下同，而分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。当流动相将样品带入分离柱时，由于样品中不同离子对离子交换树脂的相对亲和力不同而得到分离。蛋白质是两性电解质，在不同条件下有不同的解离性状。因此，选择不同的离子交换剂，控制不同的交换和洗脱条件，可以分离出不同的蛋白质。

196 在选择离子交换柱类型时，首先要根据蛋白质样品的解离状况、稳定性等不同性质，采用不同离子交换剂，其次要考虑到交换剂的强弱
　　在选择离子交换柱类型时，首先要根据蛋白质样品的解离状况、稳定性等不同性质，采用不同离子交换剂，其次要考虑到交换剂的强弱.离子交换剂的解离状况、解离性状受流动相pH变化的影响较小，而蛋白质停留时间随pH变化主要取决于蛋白质本身表面电荷的分布。离子交换分离的流动相一般是pH 5-8的缓冲液，pH 5.5、1mol/L KH2PO4溶液和pH 8, 0.5mol/L NaAc都可分别作为阳离子和阴离子交换剂的流动相。在此条件下，大多数蛋白质结构活性仍可保持不变。一般来说，当pH＞pI时，蛋白质带负电荷，可保留在阴离了交换剂上；当pH＜pI时，蛋白质带正电荷，可保留在阳离子文换剂上。因此，在用阳离子交换剂分离时，pI值大的蛋白质有较大保留，且保留值随流动相pH和离子强度的增加而减小。不过，蛋白质的保留不一定是依pI值大小决定的，在一些情况下，pH对保留的影响只能由实验得到。

197 流动相的选样多用尝试法决定.通过调整流动相pH、盐的种类、温度等，可以控制蛋白质的保留和提高选择性。和排阻包谱比较，离子交换色谱的分辨率高，对大多数的蛋白质来说，活力回收可达80％以上，是分离蛋白质的较理想的方法。 虽然离了交换也用于肽的分离，但尚未得到太多的重视，也由于是反相色谱的许多优点，使肤类分离的主要方法是反相色谱法。

198 2.9.4 反相色谱法 　　反相色谱法(Reversed Phase Chromatography, PRC)是基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应而建立的一种色谱模式。PRC分离蛋白质时，许多蛋白质在接触到酸、有机溶剂等或吸附于疏水固定相时容易引起变性，而失去生物活性。因此，当样品为纯蛋白时，应考虑其质量和活力的回收率。这就要求控制和选择好一定的分离条件。比如，色谱条件适宜、以中等极性反相柱为固定相、含磷酸盐的异丙醇-水体系为流动相，在pH 3-7时。许多蛋白质可以用反相HPLC分离，并保持其生物活性。因此，关键在于它们分离时的固定相和流动相。

199 固定相 分离蛋白质和肽的固定相一般有C18、C8、CN基和苯基键合相，其中以C18填料为最主要。至今在C18柱上已成功分离了许多蛋白质和肽。在一些流动相中．极性肽在C2、C18、苯基柱上的色谱行为显示很大的差别。一些在C18柱上不能分离的试样，能在中等极性柱上获得满意的分离效果。CN基键合相是分离非极性肽的有用的固定相。对于分子量大于10,000的肽，一般选用填料粒径为5-10nm；分子量大于20,000的肽和蛋白质选用20-50nn的大孔径植料。

200 分离蛋白质和肽的流动相主要考虑的是：有机溶剂的种类、酸度和离子强度以及离子对试剂等。
流动相 分离蛋白质和肽的流动相主要考虑的是：有机溶剂的种类、酸度和离子强度以及离子对试剂等。 在纯水中，大多数肽和蛋白质能牢固地保留在反相载体上，因此流动相必须含有有机溶剂．使溶质以合理的保留时间被洗脱。最常用有机溶剂是甲醇、乙腈、丙醇、异丙醇、四氢呋喃等。它们和水组成的洗脱体系能得到高的质量回收率而被广泛采用。洗脱强度随着有机溶剂的增加而增加，其秩序为：乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃。在选择有机溶剂的同时，还要考虑到反相柱的类型和生物大分子的特性。

201 流动相中离子对试剂分为无机酸和有机酸两种，无机酸有磷酸、盐酸和高氯酸，其作用是抑制固定相表而硅醇基离子化，增加蛋白质的亲水性，伴随蛋白质极性增加，降低了其在色谱柱上的保留时间。 有机酸丰要以三氟乙酸(TFA)和七氟丁酸(HFBA)应用较多，虽然其作用也是阻止固定相表面硅烷基的离子化，但它增加了蛋白质的疏水性，使蛋白质在色谱柱上的保留时间增加，从而提高了分离度。 2.9.5 高效疏水作用色谱 由于蛋白质的空间排列极易从固有的有序结构转变成较无序的三维结构而发生变性作用而失去生物活性，利用高效疏水作用色谱(Hydropholic Interraction Chromatography, HIC)可以得到满意的分离效果。它是利用适度疏水性填料，以含盐的水溶液作为流动相，借助于疏水作用分离活性蛋白质的一种液相色谱。它和其他色谱一样，也是利用样品分子在填料上的疏水作用力的差异，在用流动相洗脱时，样品中各组分在填料上移动速度不同而达到分离的目的。

202 虽然RPC和HIC的柱上保留都是基于疏水作用，但HIC柱的疏水性比PRC柱小得多，所以HIC中能以盐溶液代替有机溶剂作为流动相。
HIC的固定相是键合具有低密度的烷基或芳香基的葡聚糖，流动相为无机盐溶液，以递减盐浓度的方式进行梯度洗脱。洗脱和分离条件较温和，大大减少了蛋白质在此过程中失活的可能。这也是HIC分离的最大优点。近年来，人们制备了一系列以硅胶作为基体的弱的疏水性固定相，使HIC用于生物大分子的分离更加广泛。 虽然RPC和HIC的柱上保留都是基于疏水作用，但HIC柱的疏水性比PRC柱小得多，所以HIC中能以盐溶液代替有机溶剂作为流动相。 　　HIC的流动相一般是含硫酸铵的缓冲溶液，其pH在6-7之间。采用梯度洗脱时，硫酸铵浓度逐渐降低。有时在流动相中加入一定的有机溶剂以提高分离度。流动相的种类、pH、有机溶剂等都影响生物大分子的保留和回收。

203 Thank you ！