第三章 发酵工业培养基设计.

Presentation on theme: "第三章 发酵工业培养基设计."— Presentation transcript:

1 第三章 发酵工业培养基设计

2 本章内容 常用培养基的基本要求 培养基的成分及来源 培养基的类型与区别 发酵培养基的设计原理与优化方法

3 培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖
所需的一组营养物质和原料。 发酵培养基的作用： 满足菌体的生长 促进产物的形成

4 培养基的共性 ① 单位培养基能够产生最大量的目的产物； ② 能够使目的产物的合成速率最大； ③ 能够使副产物合成的量最少；
④ 所采用的培养基应该质量稳定、价格低廉、长期易于获得； ⑤ 所采用的培养基尽量不影响工业好氧发酵中的通气搅拌性能以及发酵产物的后处理等。

5 一、发酵工业培养基的基本要求 发酵工业培养基：是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的，按一定比例配制的多种营养物质的混合物。

6 一般设计适宜于工业大规模发酵的培养基应遵循以下原则：
（1）必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分； （2）有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质的转化率； （3）有利于提高产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力； （4）有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期； （5）尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化； （6）原料价格低廉，质量稳定，取材容易； （7）所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗；

7 二、培养基的成分及来源 组成：碳源、氮源、水、无机盐、生长因子、能源。

8 碳源 主要功能： 一是提供微生物菌体生长繁殖所需的能源以及合成菌体所需的碳骨架； 二是提供菌体合成目的产物的原料。
常用：糖类、油脂、有机酸和低碳醇等。

9 1糖类：发酵培养基中使用最广泛的碳源。 纯糖 天然原料 碳源物质的易利用顺序： (单)葡萄糖→ (双)蔗糖、麦芽糖、乳糖→ (多)糊精→淀粉
纯糖 天然原料 单糖：葡萄糖 双糖：蔗糖、麦芽糖、 乳糖 多糖：淀粉、糊精 及其水解液 木糖 糖 蜜 类：甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜 糖 类：麦芽汁 淀粉质类：山芋粉、马铃薯粉、 玉米粉、燕麦粉、 木薯粉 其 它：纤维素水解液、乳清 碳源物质的易利用顺序： (单)葡萄糖→ (双)蔗糖、麦芽糖、乳糖→ (多)糊精→淀粉

10 1.1葡萄糖常作为培养基的一种主要成份，并且作为加速微生物生长的一种速效碳源。 但要注意葡萄糖效应。

11 葡萄糖效应 “葡萄糖效应”是研究大肠杆菌利用各种不同混合碳源的时发现的碳分解产物的阻抑作用。当大肠杆菌培养于含有葡萄糖和乳糖的培养基中，菌体出现两次生长旺盛期。

12 1.2糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。糖蜜常用在酵母发酵和抗生素生产过程中作为碳源。在酒精生产工业中若用糖蜜代替甘薯粉，则可省去蒸煮、糖化等过程，简化了酒精生产工艺。

13 糖蜜使用的注意点： 除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。 例：谷氨酸发酵 有害物质：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶） 生物素（发酵控制） 预处理：澄清→脱钙→脱除生物素 例：柠檬酸发酵 有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）

14 1.3淀粉等多糖也是常用的碳源，它们一般都要经过菌体产生的胞外酶水解成单糖后再被吸收利用，但通常也有将其经过液化和糖化后再作为培养基的碳源使用。

15 使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类。
缺点：难利用、发酵液比较稠、成分比较复杂， 有直链淀粉和支链淀粉等等。 优点：来源广泛、价格低、可以解除葡萄糖效应。

16 2油和脂肪 脂肪酶作用 水解成甘油和脂肪酸 进一步氧化成CO2和H2O，并释放出比糖类碳源代谢多得多的能量。 缺点：比糖类代谢需要更多的氧。

17 3有机酸 有机酸的利用常会使发酵体系pH上升。 CH3COONa + 2O2  2CO2 + H2O + NaOH 4烃和醇类 近年来随着石油工业的发展，烷烃(一般是从石油裂解中得到的14～18碳的直链烷烃混合物，以及甲烷、乙烷、丁烷等)用于有机酸、氨基酸、维生素、抗生素和酶制剂的工业发酵中。

18

19 氮源的种类 无机氮源 有机氮源 工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料或副产品。 氨基氮： NH4OH (NH4)2SO4 NH4NO3
无机氮源 有机氮源 氨基氮： NH4OH (NH4)2SO4 NH4NO3 NH4 Cl 硝态氮： NaNO3 KNO3 合成产物：尿素 天然原料： 植物蛋白：黄豆饼粉、花生饼粉、 棉籽饼粉、菜籽饼粉、 麦麸、 玉米浆、玉米麸质粉 动物蛋白：蛋白胨、鱼粉、 蚕蛹粉、牛肉膏 微生物蛋白：酵母粉/浸膏、 废菌丝粉 其它：酒糟等

20 氮源 氮源主要用于构成菌体细胞物质和合成含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。 1 有机氮源
由于有机氮源营养丰富，因而微生物在含有机氮源的培养基中常表现出生长旺盛、菌丝浓度增长迅速等特点。

21 1.1玉米浆 是玉米淀粉生产中的副产物，是一种很容易被微生物利用的良好氮源。pH在4.0左右。 1.2尿素 成分单一，主要用于青霉素和谷氨酸生产。

22 有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响

23 2无机氮源 常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水等。微生物对它们的吸收利用一般较快尤其是铵盐氨水等比有机氮源的吸收要快得多，所以也称之为速效氮源。

24 无机盐及微量元素 1、作用：各种不一样。 2、来源：C、N源，以盐的形式补充。 3、用量：根据具体的产品，以实验决定。 4、使用注意点 A. 对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和 微量元素在发酵过程中必须加以考虑。

25 例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml 发酵罐必须进行表面处理。 B、使用时注意盐的形式（pH的变化） 例：黑曲酶NRRL-330,生产α-淀粉酶，pH对酶活的影响 pH 酶活 不加 分钟 加 K2HPO 分钟 加 KH2PO 分钟

26 无机盐及微量元素 1磷 磷是核酸和蛋白质的必要成份，也是重要的“生命通货”——三磷酸腺苷（ATP）的组成成份。在代谢途径的调节方面，磷元素起着很重要的作用，磷元素有利于糖代谢的进行，因此它能促进微生物的生长。但磷若过量时，许多产物的合成常受抑制。

27 2镁 镁处于离子状态时，则是许多重要酶的激活剂，镁离子不但影响基质的氧化，还影响蛋白质的合成。 3硫 硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组成成份和某些辅酶的活性基。

28 4铁 铁是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的成份，因此铁是菌体有氧氧化必不可少的元素。 （为什么在培养基中一般见不到） 5氯 氯离子在一般微生物中不具有营养作用，但对一些嗜盐菌来讲是必需的。

29 6钠、钾、钙 钠离子与维持细胞渗透压有关，故在培养基中常加入少量钠。 钾离子也与细胞渗透压和透性有关，并且还是许多酶的激活剂，它能促进糖代谢。 钙离子主要控制细胞透性。

30 水 对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。 水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。 对于酿造行业，水的重要性不言而喻 对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。

31 生长调节物质 发酵培养基中某些成份的加入有助于调节产物的形成，这些添加的物质一般被称为生长辅助物质，包括生长因子、前体、产物抑制剂和促进剂。

32 生长因子 从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。 有机氮源是生长因子的重要来源。

33 前体 前体指加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因其加入而有较大提高的一类化合物。

34 用法：前体使用时普遍采用流加的方法 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07% 前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化； 流加也有利于提高前提的转化率

35 产物合成促进剂 所谓产物合成促进剂，是指那些细胞生长非必需的，但加入后却能显著提高发酵产量的一些物质，常以添加剂的形式加入发酵培养基中。

36 促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。
有些促进剂本身是酶的诱导物； 有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产， 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用； 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。

37 三、培养基的类型与区别 1斜面培养基 要求：能使菌体生长快，产生孢子数量大、质量好，且不会引起菌种变异。 特点
C、N源不宜多，否则只长菌丝，少长或不长孢子； 无机盐浓度要适当控制，否则会影响孢子的颜色和孢子量。

38 2种子培养基 要求 营养丰富、完全，氮和维生素的含量高些； 培养基中加入一些易于吸收利用的快C、N源，便于孢子发芽生长； pH要稳定；
最后一级尽可能接近发酵培养基，常加入少量发酵合成期才大量需要的物质。

39 3发酵培养基 目的：使接种菌丝生长并能高效表达，获得高的发酵产量，同时组分尽可能单一，以保证高的得率。 要求 营养丰富完全，有利于产物合成； 不能大量加入快C、快N源，应和慢C、N源相结合； 在产物分泌期间，pH 稳定； 加入适量合成所需的物质，如前体等，进行定向发酵； 采用中间补料，以提高发酵单位； 原料的考虑——成本问题

40 第四节 培养基的设计与筛选 问题来了！ 交给你一个菌株，让你拿出一个对该菌株最好的培养基配方，你如何做？

41 培养基设计贯穿于发酵工艺研究的各个阶段?无论是在微生物发酵的实验室研究阶段、中试放大阶段还是在发酵生产阶段，都要对发酵培养基的组成进行设计。
一、培养基的设计 培养基设计贯穿于发酵工艺研究的各个阶段?无论是在微生物发酵的实验室研究阶段、中试放大阶段还是在发酵生产阶段，都要对发酵培养基的组成进行设计。 从理论上讲，微生物的营养需求和细胞生长及产物合成之间存存着化学平衡，即： 碳源+氮源+其他营养需求→细胞+产物+CO2+H2O+热量 设计发酵培养基的组成，就是使其营养成分 满足生成一定数量菌体细胞的需求； 满足生产一定量代谢产物的需求； 满足维持菌体生命活动提供能量的需求。

42 根据以上方程式，可以推算满足菌体细胞生长繁殖和合成代谢产物的元素需求量吗？
不能！ 由于不同产生菌生理特性的差异、代谢产物合成途径(特别是次级代谢产物合成途径)的复杂性、天然原材料营养成分和杂质的不稳定性、灭菌对营养成分的破坏等原因，目前还不能完全从生化反应来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方。

43 设计一个合适的培养基需要大量而细致的工作。 一般来说，需要根据
生物化学、 细胞生物学、 微生物学等学科的基本理论， 在参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方的基础上， 选用价格低廉的培养基原料，最大程度满足菌体生长繁殖和合成代谢产物的需要。 设计培养基主要包括下列几个步骤。

44 (一)确定培养基的基本组成 根据微生物的特性和培养目的，考虑碳源和氮源的种类，注意速效碳(氮)源和迟效碳(氮)源的相互配合。要避免某些培养基成分对代谢产物合成可能存在的阻遏或抑制作用。 要注意生理酸性物质和生理碱性物质，以及pH缓冲剂的加入和搭配。 对于不能合成自身生长所需要的生长因子的菌种，要选用含有生长因子的复合培养基或在培养基中添加生长因子。还要考虑菌种在代谢产物合成中对特殊成分如前体、促进剂等的需要。 要考虑原材料对泡沫形成的影响、原材料来源的稳定性和长期供应情况，以及原材料彼此之间不能发生化学反应。

45 应该指出的是：碳氮比也随碳源和氮源的种类以及通气搅拌等条件而异，因此很难确定一个统一的比值。
(二)确定培养基成分的基本配比和浓度 1．碳源和氮源的浓度和比例 对于孢子培养基来说，营养不能太丰富(特别是有机氮源)，否则不利产孢子； 对于发酵培养基来说既要利于菌体的生长，又能充分发挥菌种合成代谢产物的能力。 碳源与氮源的比例是一个影响发酵水平的重要的因素。因为碳源既作为碳架参与菌体和产物合成又作为生命活动的能源，所以一般情况下，碳源用量要比氮源用量高。 应该指出的是：碳氮比也随碳源和氮源的种类以及通气搅拌等条件而异，因此很难确定一个统一的比值。

46 碳氮比偏小，菌体生长旺盛，但易造成菌体提前衰老自溶，影响产物的积累；
碳氮比过大，菌体繁殖数量少，不利于产物的积累。 碳氮比合适，但碳源和氮源浓度偏高，会导致菌体的大量繁殖，发酵液黏度增大，影响溶解氧浓度，容易引起菌体的代谢异常，影响产物合成。 碳氮比合适，但碳源和氮源浓度过低，会影响菌体的繁殖，同样不利于产物的积累。

47 除此以外，对于一些快速利用的碳源和氮源，要避免浓度过高导致的分解产物阻遏作用。

48 生理酸性物质和生理碱性物质的用量也要适当，否则会引起发酵过程中发酵液的pH大幅度波动，影响菌体生长和产物的合成。
第三节 培养基的设计与优化 2．生理酸性物质和生理碱性物质的比例 生理酸性物质和生理碱性物质的用量也要适当，否则会引起发酵过程中发酵液的pH大幅度波动，影响菌体生长和产物的合成。 因此，要根据菌种 在现有工艺和设备条件， 生长和合成产物时pH的变化情况 最适pH的控制范围(一般霉菌和酵母菌比较适于微酸性环境，放线菌和细菌适于中性或微碱性环境) 综合考虑生理酸碱物质及其用量，从而保证在整个发酵过程中pH都能维持在最佳状态。

49 3．无机盐浓度 孢子培养基中无机盐浓度会影响孢子数量和孢子颜色。 发酵培养基中高浓度磷酸盐抑制次级代谢产物的生物合成。 4．其他培养基成分的浓度 对于培养基中每一个成分，都应考虑其浓度对菌体生长和产物合成的影响。

50 二、培养基的筛选 设计后的培养基要通过实验进行筛选验证。大量的培养基筛选，一般采用摇瓶发酵的方法，这种方法筛选效率高，可在短时间内从大量的不同组成的培养基中筛选到较好的培养基组成。 但摇瓶的发酵条件与罐上的发酵条件还有较大的不同，故由摇瓶筛选出的培养基，还要通过实验发酵罐的验证，并经过逐级放大实验和培养基成分的调整才能成为生产用的培养基。

51 培养基筛选可以采用单因子试验法。单因子试验是逐个改变发酵培养基中某一营养成分的种类或浓度，分析比较产生菌的菌体生长情况、碳氮代谢规律、pH变化、产物合成速率等数据，从中确定应采用的原材料品种和浓度。
单因了试验法工作量大，筛选效率低，需要时间长，故一般在考察少量因素时使用。 例如考察某个发酵培养基中4个组分、3个浓度的试验，采用单因子试验法，需做4×4×4=64次试验，如每次试验需要7d，需要一年半时间才能获得试验结果。

52 培养基筛选还可采用正交试验等方法。采用正交试验和均匀设计等方法可以大大加速实验进程。采用正交试验表L9(34)，只需9次实验就选出最佳的发酵培养基配方。
因素 实验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9

53 正交试验方法的优点不仅表现在试验的设计上，更表现在对试验结果的处理上。它能分析推断优化培养基的组分和浓度，还可以考察各因子之间的交互作用。
正交实验步骤： 1) 确定试验因素及水平数; 2) 选用合适的正交表; 3) 列出试验方案及试验结果; 4) 对正交试验设计结果进行分析，包括极差 分析和方差分析; 5) 确定最优或较优因素水平组合。

54 类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化

55 初步确定可能的培养基成分(以碳源为例)

56 通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例)
考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源 进一步：乙酸钠的浓度2%比较好

57 结果： 碳源：乙酸钠 % 氮源：氯化铵 0.2% 酵母膏0.03% 无机盐: 复合无机盐0.05%

58 正交设计确定优化的配方

59

60 改进后培养基 原培养基 改进后培养基的发酵结果