三峡大学医学院 盛德乔 shengdq@ctgu.edu.cn 分子杂交与印迹技术 三峡大学医学院 盛德乔 shengdq@ctgu.edu.cn.

Presentation on theme: "三峡大学医学院 盛德乔 shengdq@ctgu.edu.cn 分子杂交与印迹技术 三峡大学医学院 盛德乔 shengdq@ctgu.edu.cn."— Presentation transcript:

1 三峡大学医学院 盛德乔 shengdq@ctgu.edu.cn
分子杂交与印迹技术 三峡大学医学院 盛德乔

2 一种检测技术： 为何称印迹技术？ 核酸 蛋白质
将待测定核酸/蛋白质分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）。

3 核酸分子杂交（印迹）技术 蛋白质印迹（免疫印迹）技术 DNA印迹——Southern Bolt RNA印迹——Northern Bolt
Western Blotting

4 分子杂交技术的应用： 特异DNA、RNA或蛋白质的定性、定量检测 特点： 灵敏度高（10－4～10－18g） 特异性强

5 核酸分子杂交

6 核酸杂交 核酸分子杂交（Hybridization）－指具有一定同源序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成异质双链的过程。
DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA

7 待测的DNA或RNA（样品） 如何检测？ 探针标记？ Southern Blotting ——DNA
Northern Blotting ——RNA 如何检测？ 探针——已知的DNA或RNA 基因组DNA, cDNA RNA 探针标记？ Edwin Mellor Southern

8 核酸杂交的基本原理 DNA变性（Denaturation） DNA复性（Renaturation）－退火 核酸分子杂交
增色效应、熔解温度Tm DNA复性（Renaturation）－退火 核酸分子杂交 不同来源的核酸分子经变性后成为单链，当缓慢退火时，不同来源的核酸分子只要它们之间存在一定程度的互补序列，就可以重新结合成双链。

9 复性 RNA DNA 复性？ 杂交？

10

11 变性的方法 热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。
酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链 间的氢键断裂。 化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂。

12 变性后的理化性质变化 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加

13 第一节 核酸探针及其标记 探针（probe） ——能与特定的靶分子（DNA或RNA）发生特异结合的核酸分子称为探针
第一节 核酸探针及其标记 探针（probe） ——能与特定的靶分子（DNA或RNA）发生特异结合的核酸分子称为探针 标记（放射性同位素或非放射性物质） 基本的选择原则是核酸探针与要检测的目的核酸序列之间在核酸序列上具有高度的特异性

14 一、核酸探针的种类及应用 基因组DNA探针 cDNA探针 基因表达检测 RNA探针 人工合成的寡核苷酸探针（广泛应用）
序列及长度 18～50nt G+C含量 40～60％ 分子内不存在互补（同源性比对）

15 二、核酸标记物 标记的目的是便于发现（检测）！ 放射性同位素 非放射性标记 荧光素 32P ,3H, 35S ,125I
生物素（Biotin） 地高辛（Digoxigenin, Dig）DIG-11-dUTP 荧光素 FITC　(异硫氰酸荧光黄)是一种具有抗原性的荧光素分子，极易与免疫球蛋白形成稳定的结合物 罗丹明一类有机荧光染料

16 放射性同位素 灵敏度高 放射性污染！！ 32P：高能量b粒子 a位 g位 灵敏度高 自显影时间短 半衰期短（14.3天）
35S：低能量b粒子 半衰期长 3H：非常低能量b粒子 自显影时间长 半衰期长 放射性污染！！

17 放射性同位素发出的射线 粒子：外照射，一般能量的α粒子穿透能力较弱，射程短，危害性小，稍加防护即可（如手套）；内照射，电离密度大，危害大。
粒子：穿透能力比α粒子强，外照射危害比α粒子大，可引起皮肤的放射损伤。 射线：穿透能力很强，外照射时危害性很大，应采取切实有效的防护措施。

18 碘131 碘-131是元素碘的一种放射性同位素，为人工放射性核素（核裂变产物），符号为I-131，半衰期为8.3天。正常情况下自然界是不会存在。 碘131是β衰变核素，发射β射线（99%）和γ射线（1%）。碘131属高毒性核素，高度选择性摄取——甲状腺。

19 铯134、铯137 已经发现的铯的放射性同位素共有34个。除了天然存在的铯—133是一种稳定同位素，其他铯都属于放射性元素。释放γ射线。
铯-134是铯的一种同位素，放射性较强，人体摄入量小于0.25Gy属于安全范围；超过此值会导致造血系统、神经系统损伤，非正常生育乃至绝育；人体摄入量超过6Gy，能够致人死亡。Cs-134半衰期为2.1年 铯137，半衰期30年，铯可能透过食物或饮水进入人体，也可能以微粒的形式被人体吸入。

20 常用放射性同位素的物理性质 同位素 半衰期 100％纯度时的放射活性 Ci/mmol 射线粒子的最大能量 Emax(keV) 3H
12.1年 29 β 14C 5100年 62 β 32P 14.3天 9120 β 35S 87.1天 1490 β 125I 60天 2400 34.6 β 35.4γ

21 放射防护 距离防护：人体受到照射的剂量率随着离开电离辐射源的距离的增大而减少。剂量率与距离的平方成反比。
时间防护：在剂量率不变时，剂量与时间成正比，即操作时间越短，人员所受到的照射剂量越小。（ 要求放射性作业应操作熟练、操作步骤应尽量简单易行，尽量减少在辐射场所逗留的时间。）

22 屏蔽防护：利用射线通过物质时，与物质相互作用使其能量被物质吸收而逐渐减弱的原理，可以设置一定的屏障物来进行防护。常用的材料有水、砖、大理石、混凝土、重金属铅等。
32P 有机玻璃版 铅衣 利用衰变：可利用放射性物质存在自发衰变，其活性随之减少的原理进行外照射防护。如：半衰期小于15天的放射性废物，允许放置10个半衰期后作一般废物处理。

23 内照射的防护措施 3H 防止放射性物质经呼吸道吸入 防止放射性物质食入 防止放射性物质经体表进入

24 非放射性标记 无同位素污染，但灵敏度较低 半抗原：生物素（Biotin），地高辛（Dig） 配体：生物素是亲和素的配体
荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明 化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，如生物素酰化的碱性磷酸酶 可使发光底物发光 无同位素污染，但灵敏度较低

25 三、核酸探针的标记方法 酶促法－利用酶学的方法将标记核苷酸掺入到探针分子中，或是将核苷酸分子上的标记物转移到探针分子上。 化学法

26 核酸探针的酶促标记 切口平移法 随机引物法 DNA的末端标记 RNA探针的标记

27 切口平移法（nick translation)
原理 利用DNase I在DNA双链上造成单链切口 利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除 在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中

28 注意事项 DNase I的量 dNTP a-P 温度4-16℃ Pol I DNase I 两条链都可被标记

29 DNase I 切口平移 Pol I 两条链都可被标记

30 随机引物合成法 原理： 随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA 模板结合,在Klenow 酶的作用下,合成DNA 探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP 和酶的量。通常产物平均长度为 个核苷酸。 a-P

31 利用随机引物进行反应的优点是： Klenow 片段没有5‘→3’外切酶活性,反应稳定，可以获得大量的有效探针。
反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA 模板也可进行反应。 反应产物的比活性较高，可达4×109 cpm/μg 探针。 随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。 cpm－每分钟脉冲数

32 单链DNA 探针－用双链探针杂交检测另一个远缘DNA 时，探针序列与被检测序列间有很多错配。而两条探针互补链之间的配对却十分稳定，即形成自身的无效杂交，结果使检测效率下降。采用单链探针则可解决这一问题。

33 单链DNA 探针的合成方法主要有下列两种 以M13 载体衍生序列为模板,用Klenow 片段合成单链探针;
以RNA 为模板, 用反转录酶合成单链cDNA 探针。

34 末端标记法 末端标记DNA 探针 T4DNA聚合酶 T4多核苷酸激酶 Klenow 末端脱氧核苷酸转移酶 g-P

35 RNA 探针 许多载体如pBluescript, pGEM 等均带有来自噬菌体SP6 或E.coli 噬菌体T7 或T3 的启动子,它们能特异性地被各自噬菌体编码的依赖于DNA 的RNA 聚合酶所识别,合成特异性的RNA。

36 探针的纯化 乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质
凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（<80bp)等物质分离，常用凝胶基质是Sephadex G-50 微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针

37 探针的纯化 纯化柱（商品化，自制） 沉淀 乙酸氨 乙酸钠

38

39 Southern Blotting 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫Southern 印迹（DNA杂交）转移技术。

40 酶切DNA，凝胶电泳分离各酶切片段，然后使DNA原位变性。
预杂交滤膜，掩盖滤膜上非特异性位点。 让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针。 通过显影检查目的DNA所在的位置。

41 Southern Blotting 步骤

42 1 2 3 4 5 M 9 8 7 6 电泳图 印迹图 Jurkat 细胞cDNA探针

43 Northern blotting 1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与Southern DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做Northern RNA印迹技术（Northern blotting）。

44 Northern 杂交与Southern 杂交很相似。主要区别是被检测对象为RNA，其电泳在变性条件下进行,以去除RNA 中的二级结构，保证RNA 完全按分子大小分离。

45 电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern 转移相同的方法将RNA 转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。
变性电泳主要有3 种: 甲醛变性电泳 乙二醛变性电泳 羟甲基汞变性电泳 电泳后的琼脂糖凝胶用与Southern 转移相同的方法将RNA 转移到硝酸纤维素滤膜上,然后与探针杂交。

46 样品的固定 真空干燥：尼龙膜夹在两张滤纸中间，80℃干烤0.5-2 小时； 紫外线交联：254nm 波长的紫外线照射尼龙膜带RNA 的一面。

47 主要区别是被检测对象为RNA,其电泳在变性条件下进行,以去除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。
变性电泳主要有3种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。

48 RNase 具有活性高，不易灭活 抑制RNase活性
印迹转移 所有的试剂和器皿都必须进行去除RNase处理！！ 预杂交 杂交 洗膜 变性处理：甲醛、乙二醛 破坏RNA二级结构 放射自显影或化学显色

49 基本步骤 RNA经变性电泳完毕后，可立即将RNA转移至硝酸纤维素滤膜上。 将该杂交膜夹于两张滤纸中间，用真空烤箱于80℃干燥0.5-2小时。
预杂交，时间为1-2小时。 杂交 过夜 洗膜 用X光片进行放射自显影，附加增感屏于-70℃曝光24-48小时。

50 Northern印迹与Southern 印迹的不同点
变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性； 转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理，Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理； 靶核酸为RNA。

51 蛋白质印迹技术 Western blotting

52 蛋白质印迹技术 （ Western blotting ）
也称为免疫印迹 Immunoblotting 蛋白质－蛋白质(抗原－抗体) 分离蛋白质 PAGE 印迹 电泳转移 杂交 显色

53

54 WB检测系统

55 蛋白质样品获得：裂解细胞，离心取上清液作为样品。 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。 转移：（半干式转移）
膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。 转膜 免疫反应： 封闭 加入一抗（按合适比例稀释） 洗膜，5min×4次。 加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适比例稀释），平稳摇动，室温2hr。 弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。 加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。

56 显色系统 酶促反应比同位素安全且快速，已经成为Western Blot的主流检测方法。
辣根过氧化物酶HRP 反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 化学发光Chemiluminescent和底物显色Colormetirc/Chromogen。 GE Healthcare的ECL堪称是经典

57 Southern Blotting Northern Blotting Western Blotting 被检测对象 DNA RNA 蛋白质 检测 DNA或RNA探针 抗体(一抗，二抗) 电泳 琼脂糖凝胶 PAGE 转移方式 毛细管（虹吸印迹法），电转移 电泳转移 固相支持物 硝酸纤维素膜，尼龙膜 硝酸纤维素膜，PVDF膜 固定 真空烘烤/紫外照射 烘烤/紫外照射 杂交结果检测 放射自显影 化学显色

58 膜的种类 硝酸纤维素（NC） 尼龙膜 PVDF膜 用途 Southern / Northern 蛋白质 实现最大结合能力所需的核酸大小
＞400bp ＞50bp 固定 真空80℃烘烤/2小时 70℃/1小时，254nm紫外照射 抗张强度 差 好 特点 脆 不带电 带正电荷 机械强度高，较高蛋白结合能力

59

60 分子杂交技术的应用 基因诊断：用带有标记的已知缺陷基因的特异性片段做探针，通过和待测样品DNA中进行分子杂交，检测被测样品中是否含有缺陷基因。 疾病诊断：用带有放射性标记的病毒核酸的特异性片段做探针，检测待测者血液中是否含有该病毒。 基因芯片（高通量的检测和分析） 基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、杂交测序、疾病诊断，等。

61 杂交技术的发展 DNA，RNA与蛋白质间的相互作用 凝胶阻滞实验（Gel retardation assay）
DNaseⅠ足迹实验（footprinting assay） 原位杂交 in site hybridization 菌落，组织 斑点杂交 Dot Blotting 狭线杂交 Slot Blotting DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip)

62 基因芯片(Gene chip)技术——是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的技术。 DNA芯片

63 cDNA基因芯片分析的主要步骤

64 基因芯片的主要应用 基因表达分析 基因型、基因突变和多态性分析 疾病的诊断与治疗 分析基因表达时空特征 基因差异表达检测 发现新基因
大规模DNA测序 基因型、基因突变和多态性分析 疾病的诊断与治疗 遗传病相关基因的定位 肿瘤诊断 感染性疾病的诊断 耐药菌株和药敏检测

65 药物研究中的应用 新药开发 对药物进行毒性评价 其它应用 环境化学毒物的筛选