Application of Molecular Biology Technique in the Pathology

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1 Application of Molecular Biology Technique in the Pathology

2 DNA Analysis Southern Blot: telomere length; amplification; deletion PCR: mutation; virus In situ hybridization: gene location; translocation DNA Chip: SNP Bioinformatics

3 Northern Blot : expressed genes RT-PCR: expressed genes
RNA Analysis Northern Blot : expressed genes RT-PCR: expressed genes In situ hybridization: gene location cDNA microarray : differentially expressed genes Bioinformatics

4 Protein Analysis Western Blot: protein concentration
Immunohistochemical Technique: protein location 2-D Electrophoresis: differerentially expressed proteins Bioinformatics

5 双向电泳技术及其应用

6 双向电泳技术的原理 利用蛋白质等电点和分子量的不同来分离复杂蛋白质组分

7 双向电泳技术的发展历史 1975年O， Farrell首先提出了经典的双向电泳技术体系。他用管状载体两性电解质凝胶作为第一向进行等电聚焦，聚焦后的管状凝胶在含SDS的缓冲液中平衡后，以琼脂糖包埋置于垂直板SDS凝胶的浓缩胶上，然后用Laemmli的不连续SDS梯度凝胶电泳作为第二向。这种双向电泳技术被称之为ISO-DALT系统。ISO-DALT系统存在着许多问题，如易发生阴极漂移，载体两性电解质pH梯度不稳定以及重复性差等。

8 1985年Görg A等发展了IPG-DALT系统双向电泳技术。它利用固相pH介质来形成一定范围的pH梯度。固相pH介质是一类丙烯酰胺的化合物，它与聚丙烯酰胺共价结合后形成一定范围的pH梯度。它不受脱水、重新水化和电场等因素的影响，因而具有不产生阴极漂移，pH梯度稳定，上样量大，重复性好，分辨率高等优点。目前世界上越来越多的实验室选择IPG-DALT系统双向电泳技术。

9 样品的预处理 样品的预处理是双向电泳的重要环节之一。双向电泳样品预处理的目的之一就是使样品在样品缓冲液中充分溶解、变性和还原，完全打破蛋白之间的相互作用。通常的样品缓冲液包括8M尿素，4%(w/v)CHAPS，50-100mM DTT和40mM Tris。然而这种“标准”的样品缓冲液并非对所有蛋白质的预处理都是理想的，特别是膜蛋白、与膜相连的蛋白质以及具有高抗性组织的蛋白(如头发和皮肤等)。

10 最近有许多可改变这些蛋白质溶解度的报道。如Rabilloud等介绍了用硫脲(2M)和尿素(5-7M)来增加蛋白的溶解。Herbert等用不带电荷的三丁基膦 (tributyl phosphine，TBP)代替含巯基的还原剂DTT，它既可增加蛋白的溶解，同时又不会因DTT在碱性环境带电而造成蛋白的丢失，特别是对于那些易于以二硫键相互作用的蛋白质(如角蛋白)。另外，样品的预处理还应考虑去除非蛋白质组分(如核酸、盐离子)。在细胞蛋白质变性之前应通过透析（或层析）和微量的 DNase/RNase来去除盐离子和核酸，以减少条纹和不均一背景的出现。

11 胶条的选择和第一向等电聚焦 目前商品化的IPG胶条已逐渐为各实验室所采用。胶条的选择直接影响到实验结果的好坏。通常选胶的原则主要有以下几点：1.快速筛选或仅对最高丰度蛋白质感兴趣时可选择短胶条，而要获得最高分辨率和最大上样量时可选择长胶条。2..选择pH为3-10的胶条可观察细胞总蛋白的分布，并可分离尽可能多的蛋白质。而使用窄pH范围(如pH6-7)能更精确研究这一感兴趣pH范围的蛋白质。3.对于一个未知样品，可先使用较宽pH范围的胶条来找出所需蛋白质的位置，然后再用合适的窄pH范围的胶条更好地分辨这些蛋白点。

12 IPG胶条经再水化和加样后可进行第一向等电聚焦。通常的聚焦参数包括时间、温度和电压。合适的聚焦时间取决于样品量、胶长和pH范围等。聚焦的温度最好在20℃左右。因为温度过低(4℃以下)，尿素会结晶失去其原有的作用；而温度过高则会造成尿素结构的破坏，产生异硫氰酸盐而使蛋白发生氨基甲酰化，最终导致蛋白质等电点的改变。在等电聚焦过程中通常先设置低电压促使样品进入凝胶和去除过量的盐离子，然后再用高电压进行等电聚焦。若采用专门的双向电泳装置和附件进行等电聚焦，可先按说明书进行操作和设置各参数，再经过不断的摸索得出最佳的聚焦条件。

13 平衡 平衡的目的是使蛋白质分子与SDS充分的相互作用，使蛋白质根据分子量的大小而进行第二向迁移。一般的步骤是先在第一步平衡缓冲液（含DTT和SDS）中平衡10~15min，再在第二步平衡缓冲液（含碘乙酰胺和SDS）中平衡10~15min。平衡的时间不宜过长。因为第一向等电聚焦使用的是非限制性凝胶，孔径较大，平衡时间过长会导致蛋白分子的扩散，使结果出现横纹。Yan等发现通过改变平衡缓冲液pH值(pH8.0)，烷基化试剂的浓度（125mM碘乙酰胺）和平衡时间（15min）可将几乎所有的Cys烷基化，这个修改不但不改变双向电泳蛋白质组模式，而且更利于在基质辅助激光解析电离—飞行时间质谱(MALDI—TOF—MS)分析时进行蛋白消化。

14 IPG胶条的转移 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 染色 银染 考马斯亮蓝染色 荧光标记 放射自显影

15 凝胶图像分析及数据处理 SDS凝胶经染色后，可用图像扫描仪或数码照相系统等把复杂的蛋白质图谱用数字化格式捕获并为下一步分析提供依据。利用凝胶图像分析软件进行斑点检测、背景消除和匹配分析以找出差异表达的蛋白，通过质谱及N端测序等鉴定差异蛋白质点。常用的分析软件有PDQuest、ImageMaster 2-D、MelanieⅡ和Phoretix 2D等

16 基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱 （MALDI-TOF-MS）
肽质量指纹图 Auto MS-Fit软件进行搜索( 电喷雾电离串联质谱（ESI-MS/MS） 生物信息学分析

17 图1 SHEE细胞(左)与SHEEC细胞（右）可溶性总蛋白质双向凝胶电泳图谱差异表达分析
2 3 4 5 6 SDS-PAGE 10 图1 SHEE细胞(左)与SHEEC细胞（右）可溶性总蛋白质双向凝胶电泳图谱差异表达分析

18 图2 1号蛋白质点的肽质量指纹谱

19 ribosomal RNA gene upstream sequence binding transcription factor
Spot No. Accession No. Theoretic Mr theoretic Mr Intensity Matched (%) Length (AA) expression Protein name 1 55549 4.8 10% 494 ↑ RNPEP-like protein 2 75940 8.8 44% 654 ↓ ribosomal RNA gene upstream sequence binding transcription factor 3 35053 35493 8.2 27% 331 uracil DNA glycosylase 4 38618 7.6 47% 339 annexin A2 5 92928 9.2 832 p300/CBP-associated factor 6 new protein —

20 验证实验 protein RNA DNA

21 生物芯片技术及其应用

22 生物芯片的概念及其原理 概 念：主要指通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。生物芯片是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学革命。

23 原理： 碱基互补杂交 抗原抗体反应 配体和受体相互作用

24 生物芯片的分类 DNA芯片 膜芯片 模式生物芯片 蛋白质芯片 玻璃芯片 自行设计芯片 组织芯片

25 生物芯片技术的应用（与医学相关）： 研究疾病的发病机理 临床疾病的诊断 生物基因多态性分析 筛选药物 法医学鉴定

26 Analysis Identification
Tissue(Cell) Tissue (Cell) 2 Total RNA Total RNA PolyA+mRNA PolyA+mRNA Probe Probe 2 Microarray membrane Microarray membrane 2 Analysis Identification

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29 新基因克隆及其功能研究策略

30 图1 5'-RACE 和3'-RACE反应原理简图 Region to be amplified by 5'-RACE
NGAL2 PolyA+ mRNA 5' _ NNAAAAA _ 3' 3' _ NNTTTTT_ 5' Generalized first-strand cDNA NGAL1 图1 5'-RACE 和3'-RACE反应原理简图

31 表达调控 生物学行为 基因 相互作用 生物信息学

32 生物信息学： nlm. nih.gov

33 表达调控： 顺式作用元件 酵母单杂交技术

34 相互作用： 免疫共沉淀 酵母双杂交技术

35 生物学行为： 反义封闭 裸鼠实验 临床样本 基因敲除

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37 Y Isolate DNA Amplify DNA, Label, & Hybridize to arrays + formaldehyde
Cell lysis Sonicate ~ 1kb Target protein Y Add antibody * Add protein A beads Wash/Elute DNA-Protein complexes Reverse X-links

38 Gene Expression: Which genes? How much? Eukaryotic Cell
DNA RNA Genotyping: Is it A or B? Gene Expression: Which genes? How much? Eukaryotic Cell

39 Family based linkage studies Whole-genome disease association
One Genechip System DNA--Genotyping Family based linkage studies Whole-genome disease association Pharmacogenetics Chromosomal copy number Population genetics Linkage Disequilibrium Resequencing RNA--Expression Analysis Biomarker discovery Mechanism of Action Transcription factor binding Transcriptome Analysis DNA methylation Alternative splicing

40 Image of Hybridized GeneChip Array
Millions of copies of a specific oligonucleotide probe Image of Hybridized GeneChip Array >500,000 different complementary probes Single stranded, labeled ‘target’ Oligonucleotide ‘probe’ GeneChip® Array Hybridized Probe Cell 1.28cm