测序知识概述.

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1 测序知识概述

2 Content 普通测序及测序相关基础知识 普通测序生产流程介绍 困难模板测序相关知识 困难模板测序生产流程介绍 测序简单问题解答
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3 普通测序及测序相关基础知识——基本概念 什么是DNA以及DNA测序
又称脱氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。     DNA分子极为庞大(分子量一般至少在百万以上)，主要组成成分是腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸（简称A、T、C、G）。DNA存在于细胞核、线粒体、叶绿体中，也可以以游离状态存在于某些细胞的细胞质中。大多数已知噬菌体、部分动物病毒和少数植物病毒中也含有DNA。     除了RNA(核糖核酸)和噬菌体外，DNA是所有生物的遗传物质基础。生物体亲子之间的相似性和继承性即所谓遗传信息，都贮存在DNA分子中。    Invitrogen Proprietary & Confidential

4 普通测序及测序相关基础知识——基本概念 DNA的结构 DNA共有四级结构
一级结构：由多个4种脱氧核苷酸分子通过3’，5’—磷酸二酯键连接形成的直线型或环型多聚体。 二级结构：在碱基互补配对的基础上形成的DNA双螺旋结构。 三级结构：在二级结构上，DNA双螺旋结构通过折叠和扭曲所形成的特定构象。如超螺旋等。 四级结构：指DNA与蛋白质形成的复合物。如染色体（质）。 ——DNA测序就是测定DNA的一级结构 Invitrogen Proprietary & Confidential

5 普通测序及测序相关基础知识——基本概念 DNA结构示意图——单核苷酸及DNA的二级结构——4种脱氧核苷酸分子通过3’，5’—磷酸二酯键连接形成的直线型或环型多聚体。 Invitrogen Proprietary & Confidential

6 普通测序及测序相关基础知识——基本概念 。
DNA结构示意图——DNA的三级结构：双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形成其三级结构，超螺旋是DNA三级结构的主要形式。 Invitrogen Proprietary & Confidential

7 普通测序及测序相关基础知识——基本概念 DNA结构示意图——DNA的四级结构： DNA与蛋白质形成的复合物。如染色体（质）。
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8 普通测序及测序相关基础知识——基本概念 DNA测序原理
目前DNA测序的原理是Sanger双脱氧链末端终止法，简单来说，就是单引物扩增的PCR反应，但是将PCR反应体系中的dNTP换成了带有荧光标记的ddNTP和dNTP的混合物。 目前最普遍的DNA测序技术是采用四色荧光分别标记四种ddNTP. 一个样品的测序反应只需在同一反应体系中同时加入四种ddNTP. 产物无须分离即可在一个泳道中电泳. 序列的读取依靠检测器对不同荧光的区分.并需要通过软件系统的分析. 动画演示： 目前测序需要使用的仪器 A.PCR扩增仪 B.3730XL全自动荧光测序仪 Invitrogen Proprietary & Confidential

9 普通测序及测序相关基础知识——测序模板的要求
测序分析软件 A. Sequencing Analysis 5.2，用于将测序原始数据转换为峰图文件 B.DNAStar,用于将测序得到的结果进行拼接 C.Chromas，用于显示DNA测序峰图文件 测序模板的要求 PCR产物直接测序 PCR已纯化产物： 提供切胶回收纯化后的PCR产物20ul (浓度大于50 ng/μl), 并请提供浓度 (浓度须正确) 大于3.2 pmol/μl的测序引物10～20 μl（具体体积视客户反应数相应增加）。 未纯化PCR产物： 提供至少40ulPCR扩增原液，送样前取2ul经琼脂糖胶鉴定目的片断为明亮的一条带, 同时请提供浓度 (浓度须正确) 大于3.2 pmol/μl的测序引物10～20 μl （具体体积视客户反应数相应增加）。 Invitrogen Proprietary & Confidential

10 普通测序及测序相关基础知识——测序模板的要求
注意事项: PCR产物直接测序成功的关键是PCR产物的纯度，所以我们提倡用胶回收PCR产物。如果有几条PCR产物长度相近，用电泳胶也无法分开时，此时的PCR产物直接测序会出现双峰，这种情况建议把PCR产物克隆后测序。PCR已纯化产物请用水稀释不要用elution buffer。 PCR产物直接测序成功的另一要因是引物。不是能做PCR反应的引物便一定能测序。测序用引物要求较高,引物的3‘端必须与模板完全配对，含有Mix碱基的引物一般不能测序 (特别是3’端)。此外，测序引物长度一般为20个碱基左右，GC含量必须在50～60%左右，TM值在55-65度之间。尽量保证测序引物的纯度。并且引物需要用水而非TE溶解。 PCR未纯化产物最好不要添加染料。 Invitrogen Proprietary & Confidential

11 普通测序及测序相关基础知识——测序模板的要求
质粒DNA的测序 质粒样品： 请注明载体名称及是否含有特殊结构、插入片段的长度及插入片段的酶切位点情况、请提供至少15ul以上的提纯的质粒DNA ，浓度大于200 ng/μl（体积视客户反应个数适当增加）。 含有质粒的菌液/沉淀菌体/平板菌/穿刺菌样品： 请注明菌体的种类及抗生素抗性的情况、所含载体的名称及结构情况、插入片段的长度及插入片段的酶切位点情况、如果有特殊抗生素添加比例或培养条件特殊须注明。 含有噬菌体DNA的样品 公司均不提供此类抽提服务，请客户提供质粒形态的样品20ul ，浓度大于50 ng/μl。务必需要客户注明是含有噬菌体DNA的质粒。 Invitrogen Proprietary & Confidential

12 普通测序及测序相关基础知识——测序引物的要求
长度在18-25bp之间 GC含量在35%-60%之间 不含兼并碱基 TM值在55-65度之间 无引物二聚体、无发夹结构 随机引物和带有荧光标记的引物不能测序 如果设计引物，最好引物距离目的基因50bp左右 Invitrogen Proprietary & Confidential

13 普通测序生产流程介绍 客户样品送达公司后，需要3个阶段 A.模板制备阶段 B.测序反应阶段 C.报告分析阶段
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14 困难模板测序相关知识——困难样品的定义和鉴别
不满足常规测序样品质量要求的样品 用常规测序反应体系无法得到正常结果的样品 分类 现象 样品类型 样品鉴别 序列结构困难模板 中断/衰减 POLY G/C 质粒：≥10个连续单碱基重复 PCR产物：≥5个连续单碱基重复 POLY A/T 质粒：≥15个连续单碱基重复 PCR产物：≥10个连续单碱基重复 二级结构/发夹结构 用于RNAi干扰实验 GC RICH 局部75％GC碱基富集 AT RICH 局部80％AT碱基富集 样品片段大于10KB 测序序列有峰值，但背景信号极高，导致机器无法判读，用通用测序反应体系（5ul体系）无法得到结果 Invitrogen Proprietary & Confidential

15 困难模板测序相关知识——困难样品的定义和鉴别
优化模板质量 双峰 非单克隆（质粒） 外源插入片段中双峰 模板不纯/多条带 PCR样品中含1－100BP差异的多个片段，目前1.5％琼脂糖凝胶无法分离 无信号 引物模板不匹配 1、无结合位点 2、测序引物与模板Tm值相差太大，无法结合 模板浓度低 用通用测序反应体系（5ul）无法得到结果,，预试验中电泳鉴定模板条带亮度低于标准50ng/ul的marker 杂峰 引物特异性差 测序序列有峰值，但背景信号极高，导致机器无法判读，用通用测序反应体系（5ul体系）无法得到结果 预试验失败 菌不长 二次摇菌培养，菌液仍清淡不足以抽提质粒 抽不出质粒 两次抽提质粒电泳鉴定无质粒条带或条带亮度很弱，不足以进行反应 多条带 在琼脂糖胶上看到多条扩增产物带，目前1.5％琼脂糖凝胶无法分离 质粒含基因组DNA 在琼脂糖胶上，质粒主带后看到基因组DNA带 Invitrogen Proprietary & Confidential

16 困难模板测序相关知识——常规样品与困难样品的不同点
正常样品 困难样品 预实验部分 1、菌液样品颜色略微偏白 ，培养过夜后，摇荡新鲜培养液呈漂絮状 2、质粒2ul电泳鉴定无杂带，主条带亮度达100ng/ul（与标准质粒带对比） 3、PCR产物2ul电泳鉴定无杂带或无弥散状，主条带亮度达50ng/ul（与标准Marker对比） 1、菌液样品清澈，二次摇菌培养，菌液仍清淡如培养前，不足以抽提质粒 2、菌液颜色泛黄，呈泥水状，两次抽提质粒电泳鉴定无质粒条带或条带亮度很弱，不足以进行测序反应 3、PCR产物在琼脂糖胶上看到多条扩增产物带，目前1.5％琼脂糖凝胶无法分离 4、PCR产物电泳鉴定时，在琼脂糖胶上2ul的上样量看不到扩增产物带 5、质粒样品已降解：电泳鉴定在琼脂糖胶上看到火箭状拖尾 6、质粒样品含RNA带：在琼脂糖胶上，质粒主带前看到较宽的RNA带 7、质粒含基因组DNA：在琼脂糖胶上，质粒主带后靠近点样孔，看到基因组DNA带 Invitrogen Proprietary & Confidential

17 困难模板测序相关知识——常规样品与困难样品的不同点
正常样品 困难样品 测序反应后 1、菌液、质粒样品测序反应后，测序结果的彩图是清晰的，背景信号干扰少，峰型是尖的，尖峰与读取的碱基编码是一致的，中间波形紧凑均匀的，正常的测序反应能保证达到800Bases以上，见例图 2、PCR样品正常测序结果峰值判断与质粒样品大致相同，唯一区别是PCR产物测序结束的末端最后一个碱基为A（绿色峰），见例图 1、测序信号未能延伸到800BP之后，出现信号中止或衰竭 2、测序信号为单个峰上再叠一个峰，称为双峰 3、测序信号只有背景信号，无清晰峰值，称为无信号 4、测序图谱有样品峰存在，但背景信号掩盖了部分样品峰值信号，称为杂峰 Invitrogen Proprietary & Confidential

18 测序简单问题解答——术语讲解 摇菌 摇菌是指将客户提供的菌液、穿刺菌、平板菌接入液体培养基中，37℃过夜培养，从而得到足够用于抽提出一定浓度质粒的过程。 划平板 平板是将用于细菌培养的固体培养基，倒于平皿之上，待凝固后用于培养细菌。划平板是用接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到纯化分离微生物的一种方法。是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。用于目的微生物的分离、克隆的活化。（如图） 通知客户“划板失败”，是即使我们通过将客户的菌液通过划平板处理，但是平板上没有菌落生长，证明克隆可能已经没有活力，建议客户重新提供样品。 Invitrogen Proprietary & Confidential

19 测序简单问题解答——术语讲解 抽质粒 质粒是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子
鉴定 鉴定是指将抽提出的质粒、客户提供的质粒&PCR已纯化产物、PCR未纯化产物取2ul经EB染色，点于1.3%琼脂糖凝胶上，通过观察DNA样品条带亮度对样品浓度进行判定的过程。 Invitrogen Proprietary & Confidential

20 测序简单问题解答——术语讲解 条带 条带是DNA样品（质粒、PCR产物）经过EB染色，在琼脂糖胶上形成的明亮带，条带的存在证明客户的样品中存在一定量的DNA模板(如图)。通常，我们通知客户“无条带”的意思是：客户的样品我们经EB染色，在琼脂糖胶上没有亮带，证明客户提供的样品中，没有DNA模板，或模板含量极低，不能用于测序。条带弱的意思是与DNA Marker相比，条带亮度弱，无法从胶中回收产物。 Invitrogen Proprietary & Confidential

21 测序简单问题解答——术语讲解 PCR PCR是Polymerase Chain Reaction 的简称，即聚合酶链锁反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。 PCR反应原理演示 对于前面讲到的“条带弱”或“无条带”的样品，目前测序部会为客户进行PCR扩增服务（暂为免费服务），在客户提供上下游引物的前提下，测序部依照常规PCR反应条件为客户进行PCR实验，如果可以正常扩出条带（PCR成功）即可继续为客户安排测序反应，如果不能正常扩出条带，则备注为PCR失败，还需客户重新提供制备样品。质粒样品也可以进行PCR扩增，一般测序部是以载体上的通用引物为浓度低的质粒进行PCR扩增。 Invitrogen Proprietary & Confidential

22 测序简单问题解答——术语讲解 转化 转化是指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。 TA克隆
TA克隆即利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端，TA克隆载体提供一个线性含3`-T突出端用于直接高效地连接PCR产物。将连接产物通过转化进入感受态细胞的过程。我们采用TaKaRa公司（PMD18T克隆载体）和Invitrogen公司TA克隆系统（Topo TA克隆系统）。 Invitrogen Proprietary & Confidential

23 测序简单问题解答——常见问题解答 什么是walking测序？
对于插入片断较长的DNA样品，一个测序反应往往不能达到测通的目的，这个时候需要进行walking测序，即以已经测序得到的结果为基础，在测序得到的序列上设计引物继续向下（上）游测序的方法。一般来说，第一个正向walking反应测序部将命名为w1f，第一个反向walking反应测序部命名为w1r，对于未知客户序列方向的命名为w1p，对于向反向互补链进行测序的命名为w1pc。以此类推到第N个反应。 如下图所示 Invitrogen Proprietary & Confidential

24 测序简单问题解答——常见问题解答 如何查询载体与引物？
每个公司均会整理常用的载体与引物表，客户可向相关测序公司索要载体及对应引物表格，以及咨询公司能提供客户使用的通用引物。 测序结果中怎么找不到测序引物？（用自备引物测序，前面怎么缺了一段？） 由于测序引物不被荧光标记，所以不发射荧光信号，在测序结果中，是不显示的。不论自备引物还是通用引物，在测序结果中，都是看不到的。 由于受到反应体系中残留的BDT反应底物影响，测序结果前端受到该小分子物质的影响，所以不太准确，因而测序引物后大约20-30bp在测序结果中不显示。 测序结果文件名的意义 如A04.CS _8037.PQEK834#.W2R( ) A04：96孔PCR反应板对应样品孔号 CS ：订单号 PQEK834#：客户样品名称 W2R：测序引物 Invitrogen Proprietary & Confidential

25 测序简单问题解答——常见问题解答 困难模板需要客户注明哪些特殊情况？
菌：是否低拷贝、质粒大小、培养特殊条件（培养温度、抗性及抗生素浓度、培养基特殊要求）、载体情况、序列是否有发夹、GC高、AT高、重复序列等特殊情况。 质粒：质粒大小、载体情况、序列是否有发夹、GC高、AT高、重复序列等特殊情况。如需转化需要提供是否低拷贝、培养特殊条件（培养温度、抗性及抗生素浓度、培养基特殊要求）。 PCR产物：产物片断大小、扩增引物序列、扩增条件、序列是否有发夹、GC高、AT高、重复序列等特殊情况。如有已知序列，需要一并提供。 Invitrogen Proprietary & Confidential

26 测序简单问题解答——常见问题解答 困难模板需要客户准备的材料
菌：菌液、平板菌、穿刺菌、沉菌；如有特殊要求可提供自备引物。如有特殊抗性，需要客户提供抗生素。（我们能提供的抗生素：氨苄、羧苄、卡纳、四环素、氯霉素、柔性抗性（少量情况下免费，大量样品需客户提供或收费使用）、潮霉素、庆大霉素） 质粒：客户小提或大提的质粒样品，6K以下质粒浓度要求在100ng/ul以上，6-10K质粒浓度要求在200ng/ul以上， 10K以上质粒浓度在500ng/ul以上。如有特殊要求可提供自备引物。 PCR产物：纯化或未纯化PCR产物，包括不加溴酚蓝的原液和胶块，提供扩增引物，如需克隆还需提供电泳图谱。 Invitrogen Proprietary & Confidential