基因工程技術 高肇鴻 弘光科技大學 生物科技系 03/25/2009.

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1 基因工程技術 高肇鴻 弘光科技大學 生物科技系 03/25/2009

2 基因工程技術發展 1953 年 Watson 與 Crick 提出 DNA 雙股螺旋結構 模型 (double helix)
1970 年首先由大腸桿菌 (E. coli) 中分離出第二型限 制酶 (type II restriction endonuclease) EcoRI 1972 年 Berg 在試管中完成第一個重組 DNA 1973 年 Boyer 與 Cohen 建立利用質體選殖 DNA 的技術 1976 年 Sanger 與 Gilbert 建立 DNA 定序技術

3 1973 年 Boyer 與 Cohen 建立 DNA 重組技術
Kanamycin resistant gene Tetracyclin resistant gene R6-5 Containing Kanamycin and Tetracyclin resistant genes Kanamycin and Tetracyclin resistant E. coli

4 基因工程技術發展 1978 年 Genentech 公司利用基因重組技術在大腸桿
菌 (E. coli)中生產人類胰島素 (insulin)，並於 1982 年在美國核准上市 (Humulin)，為全球第 一個核准上市的生技藥品。 1985 年 Mullis 發明 PCR 技術 1997 年 英國發表第一隻複製動物 桃莉羊 2003 年 人類基因組序列圖繪製完成

5 DNA Double Helix 1962 諾貝爾生醫獎
James Watson Francis Crick Frederick Wilkins 1953 年 4 月 25 日，英國《Nature》雜誌發表了 Watson 和 Crick 的文章 “核酸的分子結構 — DNA 的一個結構模型”。標誌著 DNA 雙螺旋結構的建立，從此，遺傳學和生物學的歷史從細胞階段進入了分子階段。

6 限制酶 (restriction endonuclease) 的發現-1970 年 EcoRI
1978 Nobel prize 1970 年首先由大腸桿菌 (E. coli) 中分離出第二型限制酶 (type II restriction endonuclease) EcoRI

7 Restriction site in DNA, showing symmetry of the sequence around the center point (Palindrome): 迴文序列
Peter J. Russell, iGenetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.

8 Peter J. Russell, iGenetics: Copyright © Pearson Education, Inc
Peter J. Russell, iGenetics: Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings.

9 DNA 體外操作技術與細胞融合技術 Berg (美國生物化學家) 通過把兩個不同來源的 DNA 連結在一起並發揮其應有的生物學功能，證明了完全可以在體外對基因進行操作。他作為 “重組 DNA 技術之父” ，且於 1972 年開發細胞融合技術。于 1980 年獲諾貝爾化學獎。 Paul Berg 1980 年獲諾貝爾化學獎

10 Gilbert 與 Sanger 的 DNA 定序方法
Frederick Sanger 1958, 1980 年諾貝爾化學獎 Walter Gilbert 1980 年諾貝爾化學獎 Sanger (英國化學家) 最早測定胰島素的氨基酸順序獲得。22 年後，他因測定了一種噬菌體的一級結構獲 1980 年的諾貝爾化學獎。 Gilbert 在 DNA 定序領域，因其卓越的工作獲得 1980 年諾貝爾化學獎。

11 聚合酶連鎖反應 (polymer chain reaction, PCR)
Kary Mullis 資料來源：農委會網站 1993 年諾貝爾化學獎 1985 年穆利斯 (Mullis) 發明了高效複製 DNA 片段的聚和酶鏈鎖反應 (PCR) 技術，利用該技術可從極其微量的樣品中大量生產 DNA 分子，使基因工程獲得了革命性發展。

12 基因工程技術 基因工程技術是將目的基因插入載體，拼接後轉入新的宿主細胞，構建成基因工程菌 (或細胞)，並使目的基因在基因工程菌內進行複製和表達的技術。

13 基因工程技術常用工具材料 質體 (plasmid)：
質體是存在於細菌等微生物細胞及某些種的真核細胞染色質以外的環狀雙股 DNA (一般質體大小約 1.5～15kb)，具有獨立自行複製和調控能力，可表現特定的基因；如：抗藥性基因，特殊代謝基因。質體是獨立而可自行複製與表現的環形核酸分子。質體可進行轉型作用 (transformation)。 JRH/biotech

14 基因選殖常用工具材料 質體 (Plasmid) 的基本要素： ① 複製原 (origin of replication, ori)：
在菌體中獨立複製 ② 篩選標記 (selection marker) ： 以利選殖出帶有此質體的細菌株。 如抗藥基因、lacZ ③ 限制內切酶切位點或多選殖位置 (multiple cloning site, MCS)： 供選殖基因接入的位置。

15 基因選殖常用工具材料 限制酶 (Restriction Enzyme) - 能辨識 DNA 的特定序列，並做剪切的酵素
- 將質體 DNA 與選殖基因 DNA 切開 - 如一把剪刀在特定專一位置上剪開 DNA 分子。 接合酶 (Ligase) - 將兩段 DNA 接合 - 像膠水般可以將試管中切開的二段 DNA 接合在一起。 勝任細胞 (Competent Cell) ‧可以接受外來質體進入的細胞

16 DNA ligase DNA ligase will seal a nick in a DNA strand and can therefore be used to join two DNA fragments. It’s natural role is in repairing double strand breaks in DNA molecules. T4 DNA ligase is able to join fragments with either blunt or sticky ends but bacterial ligases are only able to join fragments with sticky ends. It is commonly used for the insertion of restriction enzyme-generated DNA fragments into vector backbones. Commercial ligases are supplied with a reaction buffer containing ATP and Mg2+, which are both essential for ligase activity.

17 DNA ligase

18 基因選殖技術操作的一般流程 ․專一性 DNA 內切酵素 (Restriction Enzymes) ․DNA 片段連接酵素 (T4 DNA Ligase) ․DNA 片段轉接質/載體 (DNA fragment carrier- Plasmids/Vectors) ․將選殖基因轉型入微生物或細胞 (Transformation) ․轉型株的篩選 (Screening)

19 細菌轉型成具抗生素的抗藥性，即可自帶抗生素的培養基中長成菌落
Cloning

20 載體轉型 (Transformation)
基因導入微生物的方法： (1) 轉型作用 (transformation)：指微生物細胞直接吸收外源 DNA 的過程，而通過轉型接受外源 DNA 的細胞稱為轉型株。  氯化鈣 (CaCl2) 轉型法：利用低透壓的 CaCl2 溶液，使細胞膨脹，再經高溫衝擊 (heat-shock) 後，細胞可吸收外源 DNA。  電轉型法 (electroporation)：利用高壓脈衝電擊，使 DNA 進入細胞。 (2) 轉導 (transduction) 作用： 利用噬菌體感染的過程將外源 DNA 送入細菌內。

21 Nutrient media plus antibiotic
Plasmid Vector: pBR322 Contains: 2. Selectable Markers: Ampicillin Resistance Tetracycline Resistance Bacteria plus plasmid Non-transformed bacteria Nutrient media plus antibiotic Overnight growth Only colonies from bacteria that have plasmid

22 Blue/White Selection Only colonies Colonies with insert - white
Bacteria plus empty plasmid Bacteria with plasmid plus insert Non-transformed bacteria Nutrient media plus antibiotic plus X-Gal Overnight growth Colonies with insert - white Colonies w/o insert - blue Only colonies from bacteria that have plasmid

23 寄主細胞與基因表現 (一) Host cell (1) High density of cell mass ；
(2) Low culture or fermentation cost； (3) No toxicity； (4) Easy for metabolic controlling； (6) Easy for recombinant technique handling； (7) Highly yield， (8) Easy for product extraction and purification。

24 (一) Host cell Prokaryotic cells：大腸桿菌 (E. coli)、枯草芽胞桿菌 (Bacillus subtilis)、鏈黴菌 (Streptomyces spp.) 等； Eukaryotic cells：酵母菌 (yeast)、絲狀真菌 (filamentous fungi)、哺乳動物細胞等。

25 (一) Host cell： Prokaryotic cells
(1) E. coli (gram negative bacteria) Advantages: The bacteria can also be grown easily and its genetics are comparatively simple and easily-manipulated, making it one of the best-studied prokaryotic model organisms. Disadvantages： Endocellular protein Inclusion body More difficult for product purification Lack of post-translational modification Endotoxin f) Proteases

26 (一) Host cell： Prokaryotic cells
(2) Bacillus subtilis (枯草芽胞桿菌, gram positive bacteria) Advantages: have protein secretion ability and more easy for protein purification. Disadvantages: Less useful expression vectors Production yield is less than E. coli Lack of post-translational modification Higher extracellular protease activities

27 (一) Host cell： Prokaryotic cells
(3) Streptomyces spp. (鏈黴菌, gram positive bacteria) In recent years, biotechnology researchers have begun to use Streptomyces spp. for production of recombinant human proteins. Advantages： No toxicity Have the ability to secrete correctly folded recombinant proteins into the medium Simplifying the purification steps Glycosylation Less RM ability in mutants

28 (一) Host cell： Eukaryotic cells
(1) Yeast (酵母菌) - Saccharomyces cerevisiae Yeasts are unicellular eukaryotic microorganisms. Genetics are comparatively simple and easily-manipulated. Short life cycle; Grown fast; lower fermentation cost; No toxicity; Generally recognized as safe (GRAS) Well developed gene expression systems Extracellular expression (secretion to medium) Reduced the protein purification steps Glycosylation and post-translational modifications are similar to the multicellular eukaryotic cells

29 (一) Host cell： Eukaryotic cells
(2) Filamentous fungi (絲狀真菌) DNA transformation systems have been developed for filamentous fungi. Advantages： Strong protein secretion ability Glycosylation and post-translational modifications are similar to the multicellular eukaryotic cells The fermentation processes are well developed Many filamentous fungi are defined as safe microorganism Aspergillus niger (黑麴菌)

30 (一) Host cell： Eukaryotic cells
(3) Mammalian (哺乳動物細胞) Advantages: Extracellular expression (secretion to medium) Easy for products purification Glycosylation and post-translational modifications Disadvantages: cell growth slow; low yield; high cost of growth medium

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32 寄主細胞與基因表現 (二) Gene expression in E. coli
The factors effect on the gene expression in E. coli (1) Copy number (2) Gene expression efficiency ① Promoter、② SD sequence、③ distance of SD to initiation codon (ATG)、④ codon usage (3) Product stability (4) Culture condition

33 (二) Gene expression in E. coli
Promoter and inducting factor for gene expression in E. coli

34 Expression vector：pQE system

35 寄主細胞與基因表現 (三) Gene expression in yeast
1. Vectors：A wide range of vectors are available to meet various requirements for insertion, deletion alteration and expression of genes in yeast (1) Classification by replication sequence of vector ① YEp (yeast episomal plasmid, 附加體型載體)： - The YEp vectors replicate autonomously - The 2 μm ori is responsible for the high copy-number (20~100 plasmids/cell) and high frequency of transformation (103~105 transformants/μg DNA) of YEp vectors.

36 (三) Gene expression in yeast
② YIp 類 (yeast integrative plasmid，酵母整合型質體)： - The YpI vectors do not replicate autonomously, but integrate into the genome at low frequencies (1~100 transformants/μg DNA) by homologous recombination - Linearization increases the efficiency of integrative transformation from 10- to 50-fold. - The YIp vectors typically integrate as a single copy - Strains transformed with YIp plasmids are extremely stable

37 YIp (yeast integrative plasmid)：

38 ③ YCp 類 (yeast centromeric plasmid，酵母著絲粒質體)：
- The YCp vectors are autonomously replicating vectors - Very low copy numbers, from 1 to 3 per cell - Transformation efficiency is 103~104 transformants/μg DNA) - YCp is replicate during mitosis and meiosis - High stability - The stability and low copy-number of YCp vectors make them the ideal choice for cloning vectors, for construction of yeast genomic DNA libraries, and for investigating the function of genes altered in vivo.

39 YRp 類 (yeast replication plasmid，酵母複製型質體)：
- YRp vectors, containing ARS but lacking functional CEN elements, transform yeast at high frequencies, but are lost at too high a frequency (unstable), over 10% per generation, making them undesirable for general vectors. - Low copy numbers, from 5 to 10 per cell

40 (2) Shuttle vector： Which contain sequences permitting them to be selected and propagated in E. coli. The most common yeast vectors originated from pBR322 and contain an ori, promoting high copy-number maintenance in E. coli, and the selectable antibiotic markers, the β-lactamase gene and sometime to tetracycline-resistance gene. (3) Expression vector： Constructed the yeast promoter and terminator elements in the yeast vector for gene expression.

41 (三) Gene expression in yeast
Expression vector (三) Gene expression in yeast Shuttle vector Yeast terminator Yeast promoter E. coli ori Selection marker Yeast ori

42 (三) Gene expression in yeast
2. 影響目的基因在酵母菌中表達的因素： (1) Copy number and stability： 高拷貝數與高穩定度的載體可使外源基因高效表達。 (2) Gene expression efficiency： 　① Promoters：持續表現型 (constitutive promoter)、誘導型 (regulatory promoter) 　② Signal peptide：幫助表達產物分泌到細胞外，並可經 由蛋白酶將訊號胜肽切除，產生正確的蛋白產物。減輕 細胞代謝壓力，產物純化較方便。 　③ Terminator：使轉錄在適當的位置終止並加上 poly A tail，可穩定 mRNA 並使 mRNA 有效的轉譯。

43 (三) Gene expression in yeast
2. 影響目的基因在酵母菌中表達的因素： (3) Glycosylation： 酵母菌對外源蛋白的醣基化與哺乳動物相近，可使外源蛋 白正確的摺疊與修飾，以具活性的型態分泌到細胞外。 (4) Host cell：表達用的宿主應具有下列要求： 　① 菌體生長力強：可增加表達產量 　② 菌體內源蛋白酶要較弱：避免產物蛋白被分解 　③ 菌體穩定性高：選用高穩定性的突變株 　④ 分泌能力強：發展高分泌效率的突變菌株

44 (三) Gene expression in yeast
Yeast 表現系統的啟動子 (promoter) 及誘導方式 (持續表現型) (調控誘導型) (磷酸甘油酸激酶) (磷酸甘油醛脫氫酶) (半乳糖激酶) (酸性磷酸酶) (蔗糖轉化酶) (Metallothionein, 金屬硫蛋白基因啟動子)

45 基因工程產物分離純化 分離純化的基本過程 發酵液 細胞分離 (離心或膜過濾) 胞內產物 胞外產物 打破細胞 固液分離 (去除細胞碎片)
包涵體 可溶蛋白 變性 複性 (再摺疊) 初步分離 濃縮 純化 製劑 產品 成品檢定

46 分離純化的技術要求： ① 高活性：技術條件要溫和，保持產物生物活性。 ② 高回收率：能從複雜的混合物中有效的將目的產物分離，
達到較高的純化效率。 ③ 高純度。 ④ 方便快速。 ⑤ 經濟：低成本。

47 細胞分離或固液分離：多利用離心或膜過濾方式達成 細胞破碎方法：
設備 特點 機械破碎法 均質機、球磨機 利用機械力將組織搗碎 壓力法 高壓細胞破碎機 利用高壓力差將細胞破碎 不產生熱源，避免蛋白質變性 反復凍融法 冰櫃 方法設備簡單、活性保存好 操作時間長 超音波震盪 超音波細胞震碎機 破碎效果好。但局部發熱會破壞蛋白質結構，造成活性損失 酶解法 Lysozyme (溶菌酶) 大量回收時較少使用

48 蛋白質產物分離純化： 沉澱 透析 膠體過濾層析法 離子交換層析法 親和層析法 疏水性及反向層析法

49 蛋白質產物分離純化： (1) 沉澱法 (初步純化)　 - 原理是破壞蛋白質分子表面水分子的聚集或 表面電荷，使蛋白質沉澱。 - 常用：鹽析法、有機溶劑沉澱法、等電點沉 澱法等。 - 優點：操作簡單、成本低，並有濃縮的效果 - 缺點：蛋白質可能變性失活

50 鹽析法 (salting-out)

51 (2) 按分子大小分離方法 (size exclusion)
 - 有超濾法、透析法、膜分離法、 凝膠過濾層析 法、超高速離心法等。 - 除分離純化外可用於生物大分子物質的濃縮、 分級及脫鹽亦可用於除菌及去病毒

52 Dialysis (透析)：去除不要的小分子雜質、脫鹽

53 Gel Filtration Chromatography (膠體過濾層析法)
大分子移動較快先流出

54 (3) 按分子所帶電荷進行分離 胺基酸、多肽、蛋白質、酶均為兩性電解質，具有等電點 (PI)。在遠離等電點的 pH 時便會帶正電荷或帶負電荷。 包括離子交換層析法、電泳法、等電聚焦等。

55 Ion-exchange Chromatography (離子交換層析法)
陽離子交換樹脂 (Cation exchange) 陰離子交換樹脂 (Anion exchange)

56 (4) 親和層析法 (Affinity Chromatography)
大部分生物活性物質都有與其作用的專一性物質。如酶和基質 (或抑制物)、抗原和抗體、激素與受體等，它們之間有特異的親和作用。專一性強、操作簡便。

57 Ni couple with His base 競爭 Enterokinase recognition site Ni-NTA column used for the 6xHis tagged recombinant proteins purification

58 (5) 疏水性及反向層析法： 反向層析 (reversed phase chromatography)：
利用極性與極性，非極性與非極性之間相互作用力大小來分離。 疏水層析 (hydrophobic interaction chromatography)： 利用蛋白質表面的疏水性區域與介質的疏水基團之間交互作用的強弱來分離。

59 Thanks for Your Attention