自身免疫性肝炎实验模型中的T细胞、NKT细胞、NK细胞

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1 自身免疫性肝炎实验模型中的T细胞、NKT细胞、NK细胞

2 导言 ConA注射小鼠或大鼠诱导急性或慢性肝损 依赖T细胞和肝巨噬细胞的激活 研究集中于免疫介质和细胞，该模型中肝细胞损伤的相关机制
该模型用于研究： 免疫介导的肝炎 过度激活免疫应答的治疗

3 小鼠ConA诱导的肝损伤免疫细胞 免疫细胞 证据 T淋巴细胞 T细胞耗竭，SCID、RAG-/-、裸鼠抵抗，免疫抑制治疗有效 CD4+T细胞
NKT细胞 CD4+细胞耗竭，Vα14-/-和CD1-/-小鼠抵抗 Kupffer细胞 KC耗竭

4 小鼠ConA诱导的肝损伤免疫介质 免疫介质 证据 TNFα
抗TNF，TNF受体融合蛋白，TNF-/-、TNFR-1-/-和TNFR-2-/-小鼠抵抗 IFNγ 抗IFNγ， IFNγ-R 融合蛋白，IFNγ-R-/-小鼠抵抗，IFNγ信号干扰 IL-12 抗IL-12，重组(r)IL-12加剧 IL-18 抗IL-18 MIP-2 抗MIP-2 NO INOS -/-小鼠，选择性iNOS阻断剂 FasL 抗FasL，gld小鼠

5 小鼠ConA诱导的肝损伤保护性因子 保护性细胞因子 证据 IL-6 rIL-6保护， IL-6 -/-小鼠敏感性提高 IL-10

6 自身免疫性肝炎（AIH） 一种主要在门静脉周围的病因不明的慢性人类肝炎，是一种特发性疾病，可以导致肝硬化 特征性自身抗体
抗核抗体（ANA） 抗平滑肌抗体（SMA） 肝肾微粒体（LKM）抗体 针对细胞色素P450 (CYP) 2D6和UDP-glucuronosyl-转移酶，识别可溶性肝抗原（SLA）或肝胰抗原（LP）的抗体 循环中抗人唾液酸糖蛋白受体 hASGPR抗体 易感个体外在始动因素： 病毒感染 药物反应：替尼酸，双肼屈嗪，氟烷 其它肝毒素 伴发其它自身免疫病 原发性胆汁性肝硬化（PBC） 原发性硬化性胆管炎（PSC） 特征见附表

7 实验性自身免疫性肝炎（EAH） 1990年，Lohse等，用合成的可溶性肝抗原免疫诱导的肝炎
C57BL/6小鼠最易感 在泼尼松龙转基因鼠中建立CD4+T细胞依赖性自身免疫性肝炎 Th1细胞因子应答 血清抗核抗体水平显著升高 特征见附表

8 Con A诱导的小鼠肝炎 Con A：刀豆素A——黑豆中的植物凝集素，T细胞丝裂原 单一鼠静脉注射8到24小时内导致严重肝炎
8小时内，转氨酶释放，肝内DNA片段增多 24小时后，转氨酶水平下降，肝再生明显 Con A诱导的肝炎是在体研究T细胞激活-诱导的肝损伤的基本规律的模型 依据见附表

9 AIH/EAH和ConA肝炎的区别与联系
自身免疫性标准 AIH/EAH ConA肝炎 1.抗原特异性T细胞应答 + - 2.CD4+T细胞率 +，EAH未测 3.被动转移疾病 4.遗传患病率 +，EAH种系差别 +，种系差别 5.特异自身抗体产生 +， EAH中非疾病相关 未测 6.缓解状态免疫抑制 7.对免疫抑制药物的应答 +， EAH未测

10 T细胞在Con A诱导的肝炎中的作用 CD4+T细胞浸润：Con A给药后6到8小时内CD4+T细胞开始浸润肝实质，8小时后聚集达到6倍。24小时后大多数CD4+T细胞以大细胞群形式分布于门静脉周围，肝窦内几乎检测不到CD4+T细胞 黏附因子：Con A诱导的CD4+T细胞聚集依赖于E－选择素，ICAM-1和VCAM-1，阻断黏附因子显著抑制肝内浸润，但不能防止肝损 CD4+和CD25+ T细胞开始浸润之前，TNFα和IFNγ依赖的细胞内途径——干扰素调节因子（IRF）-1表达、c-JunN末端激酶（JNK）激活——导致肝损，中和因子不能阻断细胞聚集；其它肝内细胞：NKT，其它T，Kupffer细胞 缓解阶段， CD4+T细胞参与清除有害淋巴细胞浸润，CD44依赖

11 NK细胞在Con A诱导肝炎中的作用 不起主要作用 不直接参与肝损： RAG-/-小鼠对Con A抵抗
perforin-/-小鼠比wt鼠更敏感

12 NKT细胞 NKT细胞表型： 识别单一形态的NHCI类样分子CD1d提呈的糖脂 来源：胸腺和胸腺外，分布于不同组织
CD4+：60％，DN：40％； 活化T细胞表面标志：Thy1high, CD44high, CD45RBhigh 表达NK细胞表面标志：NK1.1int, IL-2Rβint, CD69int(15%), Ly49C(60%) 表达恒定TCRα链：Vα14-Jα281和Vβ8(55%, 主要Vβ8.2)、Vβ7（14％）或Vβ2（7％）？其中之一 识别单一形态的NHCI类样分子CD1d提呈的糖脂 来源：胸腺和胸腺外，分布于不同组织 胸腺、肝脏——CD1d依赖的CD4+多见 脾、骨髓——CD1d非依赖的DN和CD8+多见

13 在感染、抗肿瘤和自身免疫中 NKT细胞的作用
离体和在体激活迅速产生大量细胞因子：IL-4, IFNγ IFNγ应答对于清除病原重要 与IFNγ依赖的效应相反，IL-4介导抑制Th1相关的自身免疫

14 αGalCer诱导的NKT细胞介导的抗病毒和抗肿瘤效应
对HBV感染的抵抗力由人造的特异性NKT细胞抗原αGalCer诱导 由αGalCer或IL-12诱导的抗病毒和抗肿瘤效应似乎由产IFNγ的NKT细胞介导，后者依次激活肝和脾的NK细胞的细胞毒性 对于自身免疫： 第一次注射：诱导高水平IL-4, IFNγ；肝脾内NKT迅速活化诱导细胞死亡 一周内：离体再刺激后，肝细胞再生，产生大量Th2细胞因子 重复给药，向Th2细胞应答极化 Th1相关自身免疫治疗的希望 问题：首次剂量造成严重肝损！

15 NKT细胞在ConA诱导肝炎中的作用 正方：NKT细胞是ConA诱导肝炎中的重要的亚群 反方：反驳NKT引发作肝损伤观点的推理
在体刺激后立即活化产生大量IFNγ和IL-4 活化NKT细胞24h内引发肝毒性 肝内NKT细胞主要是CD4+，因此属于介导ConA肝炎的T淋巴细胞亚群 反方：反驳NKT引发作肝损伤观点的推理 ConA诱导肝炎与自身免疫性肝炎有相似处 NKT抑制自身免疫性

16 NKT细胞相关报道三篇 1. Toyabe等，同时耗竭NKT和NK显著抑制ConA肝炎，而单独耗竭NK不能；产生TNFα、CD25+细胞聚集、血清转氨酶升高需要产IL-4的NKT。？ 2. Kaneko等，产IL-4的而非产IFNγ的NKT为ConA肝炎发生必需；通过穿孔素、FasL杀伤肝细胞 3. Takeda等，CD1-/-小鼠抵抗ConA诱导肝炎；wt鼠肝内NKT和T重建ConA诱导肝炎，NK则不能

17 根据Kaneko等的观点 wt gld CD1-/- NKT

18 ConA与αGalCer对肝的作用比较 相似点： 区别点： 时程相同 单独耗竭NK不影响肝毒性，同时耗竭NKT和NK显著抑制肝毒性
通过穿孔素、FasL杀伤肝细胞；gld和lpr小鼠抵抗 CD1-/-小鼠抵抗 反复给药诱导NKT迅速凋亡从肝中清除； αGalCer反复给药抑制自身免疫， ConA反复注射通过诱导Th2应答，诱导自身抵抗 区别点： αGalCer肝毒性不由IFNγ介导，而ConA诱导肝炎依赖IFNγ及其胞内信号 Lpr：fas缺失

19 抗ConA肝炎的治疗 保护机制 物质 1.阻断T细胞激活 环孢素A，他克莫司，地塞米松 2.T细胞耗竭 半乳凝素－1
3.抑制正性炎症细胞因子产生，IL-10增长 咯利普兰，莫他匹酮，己酮可可碱，依布硒，低分子量肝素，大豆皂醇，inchinko-to(TJ-135) 4.抑制肝IFNγ表达 I型干扰素，莫拉丁酯 5.抑制IL-1β转换酶（ICE） NO-水杨酸，NO-熊去氧胆酸 6.抑制iNOS 氨基胍，L-N6-(1-iminoethyl)-赖氨酸(L-NIL) 7.阻止黏附 合成的RGD类似物 8.抗凝 低分子量肝素 9.NFκB肝内核转运增加 大豆皂醇，低分子量透明质酸酶（LMW-HA）

20 Con A肝炎肝内免疫细胞激活 和肝细胞死亡的机制
KC NKT CD4+T IFNγ TNFα IFNγ? IL-4? IL-12 IL-18 IFNγR TNFR1 TNFR2 IRF-1 ? Con A激活胸腺来源的NKT细胞 Con A激活胸腺来源的经典的产生IFNγ和IL-4的T细胞 Con A激活Kupffer细胞产生TNFα，IL-12，和IL-18 IL-12和IL-18是产生IFNγ需要的 两型TNFα，诱导肝损 通过两种受体的激活，即p55 TNFR-1和p75 TNFR-2 半胱天冬酶－3和半胱天冬酶－8非依赖性 可能依赖JNK IFNγ信号对于 肝损害重要 免疫细胞活化 肝细胞死亡

21 总结 Con A诱导的肝炎是肝内胸腺依赖性T细胞介导的，最可能属于CD4+的细胞亚群。
NKT细胞，狭义来讲是经典的CD3+NK1.1-T细胞，是介导肝损伤的肝内T细胞。

22 待讨论的问题1 ConA准许最终激活CD1依赖性NKT细胞的抗原进入的机制
假想：在应激状态和细胞坏死过程中，天然脂类配体可作为自身抗原（类比肿瘤组织的设想） 这种天然脂类抗原尚未知

23 待讨论的问题2 广泛描述的IFNγ依赖性与Toyabe等和Kaneko等描述的IL-4介导的肝毒性之间的矛盾 产生IL-4的Th2细胞不能诱导肝毒性，分泌IFNγ的Th1细胞诱导肝毒性 转基因小鼠 表达IFNγ——慢性活动性肝炎 缺乏SOCS-1——爆发性肝炎 缺乏IFNγ， SOCS-1-/-——不发生爆发性肝炎 Kaneko等 ？ IL-4-/-小鼠有抗ConA作用？ ？ 获得性转移的NKT细胞与肝内NKT细胞因子谱不同（wt鼠脾细胞——NKT缺乏小鼠），正如肝脾似乎含有不同NKT亚群81？ ？IFNγ比IL-4对于NKT介导的肝内细胞毒性更相关，但为什么ConA肝炎不依赖IFNγ激活的NK？ Toyabe组 抗IL-4抗体预处理防止ConA肝炎发生 中和IFNγ有保护作用 SOCS-1-/-小鼠，稳定的IFNγ和IL-4信号——爆发性肝炎 实验解释：清除STAT-1或STAT-6基因都阻止肝炎发生，没有SOCS-1 IFNγ不能抑制IL-4 信号 自身免疫相关因素： 缺乏产生IL-4的NKT 产生IFNγ的NKT稳定存在 SOCS-1:supressor of cytokine signaling-1, 一种细胞因子signaling的负反馈分子 STAT: SIGNAL TRANSDUCER AND ACTIVATOR OF TRANSCRIPTION

24 待讨论的问题3 存在争议——Con A诱导的肝损害中FasL诱导的肝细胞凋亡的作用
2：Fas/FasL参与 Fas/FasL未参与Con A诱导的肝损害，gld小鼠的抵抗应归因于其它遗传效应 Lpr小鼠显示敏感性 未发现caspase3的活性