植物组织培养 Plant tissue culture.

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1 植物组织培养 Plant tissue culture

2 目 录 第二章 外植体的选择及灭菌 第三章 外植体的接种培养及驯化 第四章 愈伤组织的培养 第五章 器官和体细胞胚的发生
目 录 绪论 第一章 实验设备及技术 第二章 外植体的选择及灭菌 第三章 外植体的接种培养及驯化 第四章 愈伤组织的培养 第五章 器官和体细胞胚的发生 第六章 植物快繁与脱毒

3 绪 论 植物组织培养是二十世纪发展起来新技术，近几十年来，由于组培基础理论的研究深入，发展极为迅速，几乎以植物为研究对象的各个分支学科都在广泛进行组培。 定义：是指植物的任何器官、组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化形成完整植株的过成。

4 一、 植物组织培养的分类及 相关概念 1 根据培养的对象不同，可分为： 器官培养（organ culture）
1 根据培养的对象不同，可分为： 器官培养（organ culture） 组织培养（meristem culeure） 胚胎培养（embryoid culeure ） 细胞培养（cell culeure ） 原生质体培养（protoplast culeure ）

5 2 根据培养过程不同，分为 初代培养（primary culture） 继代培养（ subculture） 3 根据培养基物理状态，分为 固体培养（solid culture） 液体培养（liquid culture）

6 4 相关概念 （1）外植体（explant）：由活体（in vivo） 上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。 （2）愈伤组织（callus）：在人工培养基上由外植体形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。 （3）分化（differentiation）：指由受精卵经细胞分裂，引起极性生长发育成种子，经根、茎、叶生长，开花结实，形成完整植株。

7 （4）脱分化（dedifferentiation）：由高度分化的植物组织或器官产生无分化状态的愈伤组织的过程。
（5）再分化（redifferentiation）：将脱分化形成的愈伤组织转移到适当的培养基上继续培养，这些无定形的愈伤组织又会重新分化出根、茎、叶的完整植株的过程。

8 二、植物组织培养的理论依据及特点 （一）理论依据 植物细胞的全能性（totipotency）：
是指植物体任何一个细胞都携带着一套发育成完整植株的全部遗传信息，在离体培养条件下，这些信息可以表达，产生出完整植株。

9 原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必须的全套基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。
差异： （1）受精卵的全能性最高 （2）受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞低。

10 潜在全能性的原因： 基因表达的选择性 科学研究表明：处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质，激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物的组织培养。 要使细胞全能性表达出来，形成完整植株，除了生长以外，还要经过分化、脱分化和再分化等过程。

11 在正常情况下： 受精卵—分裂、分化—种子—萌发— 完整植株（具有根、茎、叶、花、果实） 在离体条件下： 离体组织、器官 （在培养基上） 细胞分裂（脱分化） 愈伤组织 再分化

12 （二）植物组织培养过程： 植物体 （分离）外植体 （脱分化）愈伤 组织 （再分化）生长点 完整植株（具有 幼根、幼茎）

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14 （三）植物组织培养条件： 含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适时的光照。 （四）离体器官的分化方式主要有三种； 1 、由分生组织直接分生芽 2 、由分生组织形成愈伤组织，经过再分化形成完整植株实现细胞全能性。 3 、 由游离的细胞或原生质体形成胚状体（embryoid），直接重建完整植株，或制成人工种子后重建植株

15 1、优越性：可以在不受植物体其他部分干扰的情况下研究被培养部分（外植体）的生长和分化规律。
（五）植物组织培养的特点 1、优越性：可以在不受植物体其他部分干扰的情况下研究被培养部分（外植体）的生长和分化规律。 2、 特点： （1）取材少，培养材料经济 （2）人为控制培养条件，不受自然条件影响。 （3）生长周期短，繁殖率高， （4）管理方便，利于自动化控制

16 3、重要性： （1）理论上：是研究细胞学、遗传学、育种学、生物化学和药物学等学科的重要手段。 （2）生产上：在农学、园艺、林业和次生代谢物工程等生产领域得到广泛应用。

17 三、植物组织培养的发展历史 1902年，德国植物学家Haberlandt提出细胞全能性的概念。
1904年，E. Hanning 培养萝卜和辣根菜属的一种植物的胚，使其发育成熟。 1908年，S. simon 研究培养白杨嫩茎，观察到愈伤组织的发生和根芽的形成。 1958年，美国科学家Steward等和德国Reinert分别用胡萝卜根细胞诱导形成胚状体，使细胞全能性得到证实，为组织培养技术程序奠定了基础。

18 1960年，E. C.cocking采用纤维素酶,果胶酶等酶制剂分离番茄幼根，获得大量健康的原生质体。
1962年，Murashige和Skoog在烟草培养中筛选出至今仍然被广泛使用的MS培养基。 1964年，印度科学家S. Guha和 Msheshwari培养南洋金花未成熟的花药时，发现了由大量胚状体形成的小植株（单倍体植株）。 罗士韦是我国植物组织和细胞培养研究的开拓者和奠基人之一。在30年代即开始离体根的培养，随着又进行幼胚和茎尖的培养。

19 70年代初期开始，我国掀起了单倍体育种的高潮，在小麦、水稻、烟草、玉米、三叶橡胶等作物上取得了一批有意义的成果。
80-90年代，全国研究工作内容明显倾向无性系的快速繁殖，许多机构开始转向应用，成为生产实体，如甘蔗、草莓、葡萄、菠萝、香蕉，各色观赏植物等。 现在，我国在原生质体培养，体细胞杂交、突变体筛选、去除病毒、次生代谢物的发酵生产、人工包装超级种子等方面都有了进步。

20 四、植物组织培养的应用 1、快速繁殖：运用组织培养途径，一个植株一年可以繁殖几万到几百万个植株，例如，一株葡萄一年繁殖3万多株，一株兰花一年繁殖到400万株。 2、种苗脱毒：针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗，已经取得的有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等。

21 3、远缘杂交：利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。比如辽宁果树研究所利用这一方法获得了苹果与梨的杂交种。
4、突变育种：采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病毒、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。象中国林科院用逐步加大培养基中盐的浓度，直接获得耐盐的杨树株系。

22 5、基因工程：基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后，必须通过组织培养途径才能实现植株再生。
6、生物制品：有些极其昂贵的生物制品，比如抗癌首选药物—紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。

23 第一章 实验设备及技术 在进行植物组织培养工作之前，首先对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产，影响效率。在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来设计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。

24 第一节 实验室 植物组织培养是在严格的无菌的条件下进行的，要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。 1、实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。 2、实验室组成： 化学实验室、洗涤菌室、无菌操作室（接种室）、培养室、细胞学实验室。

25 化学实验室（准备室）：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养基分装等。
主要设备：药品柜、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器。 洗涤、灭菌室：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。 主要设备：水池、操作台、高压灭菌锅、干燥灭火器（如烘箱）等。

26 无菌操作室（接种室）：主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。
主要设备：紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针）等。 接种室宜小不宜大，一般7~8平米，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。

27 接种室要求干爽安静，清洁明亮，在适当位置吊装1~2盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。
接种室应设有缓冲间，面积为1m²为宜。进入无菌操作室前在此更衣换帽，以减少进出时带入接种室杂菌。缓冲间最好也安装一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。

28 培养室：培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。
培养材料放在培养架上培养。培养架大多有金属制成，一般设5层，最低一层离地面高约10cm，其他每层间隙30cm左右，培养架即高1.7m左右。培养架的长度是根据日光灯的长度而设计的，如采用40W的日光灯，则长1.3m，30W的长度为1m，宽度为60cm。

29 培养室最重要的因子是温度，一般保持在20~27°C左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。
室内温度也要求恒定，相对湿度以保持在70%~80%为好，可安装加湿器。控制光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照10~16小时，也有的需要连续照明。短日照植物要求短日照条件，长日照植物要求长日照条件。

30 现代组培实验室大多设计为采用天然太阳能作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。
主要设备：培养架（控温控光控湿）、摇床、培养箱、紫外光源等。

31 细胞学实验室：用于培养物的观察分析与培养物的记数等。
主要设备：双筒实体显微镜、显微镜、倒置显微镜。 其他小型仪器设备：分注器、血球计数器、移液器、过滤灭菌器、电炉等加热器具、磁力搅拌器、低速台式离心机等。

32 第二节 植物组织培养的 培养条件 一、营养条件—培养基（culture medium）培养基：是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对培养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，

33 培养基有许多种类，根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的须选用不同的培养基。
在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才能成功。 培养基的种类 培养基有许多种类，根据不同的植物和培养部位及不同的培养目的须选用不同的培养基。 培养基的产生，最早是Sacks（1680）和Knop（1681），他们对绿色植物的成分进行了分析研究，根据植物从土中主要是吸收无机盐营养，设计出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液，至今仍在作为基本的无机盐培养基得到广泛应用。

34 以后根据不同目的进行改良产了许多培养基，White培养基在40年代用得最多，现在还常用。而到60-70年代则大多采用MS等高浓度培养基，可以保证培养材料对营养的需要，并能生长快、分化快，且由于浓度高，在配制、消毒过程中某些成分有些出入，也不致影响培养基的离子平衡。 培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基（MS培养基），也有对某些成分进行改良的改良

35 培养基。 目前国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基及特点如下： （1）MS培养基：它是1962年由Murashige和Skoog为烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养效果良好。有些培养基是由它演变而来。

36 （2）B5培养基：是1968年由Galmborg等为培养大豆而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。 （3）White培养基：是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MeSo4的浓度和增加了硼素。其特点是无机盐数量较低，适于生根培养。

37 （4）N6培养基：是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4
的含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养基和其他组织培养。 （5）KM—8P培养基：它是1974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包含了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质体融合的培养。

38 培养基的成分主要可以分为水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。
水（H2o） 是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶液。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。

39 无机元素（inorganic element）
（1）N 是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分。是生命不可缺少的物质。在制备培养基时以NO3—N和NH4—N两种形式供应。大多数培养基既含有NO3—N又含有NH4 —N。 NH4—N对植物生长较为有利。供应的物质有KNO3、NH4NO3等。也添加氨基酸来补充氮素。 （2）P 是磷脂的主要成分，而磷脂又是

40 原生质、细胞核的重要组成部分。磷也是ATP、ADP等的组成成分。在植物培养过程中，向培养基内添加磷、不仅增加养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。常用的物质有KH2PO4或NaH2PO4等。 （3）K 对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等密切关系。K增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。但浓度不易过大，一般为1—3mg/L为好。制备培养基时，常以KCL、KNO3等盐类提供。

41 （4）Mg、S和Ca、Mg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S是氨基酸和蛋白质的组成成分。它们常以MgSO4•7H2O提供。用量为1-3mg/l较为适宜；Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl2•H2O提供。

42 微量元素 指小于0.5mmol/L的元素，Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。
铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢等酶的组成成分。同时，它又是叶绿素形成的必要条件。培养基中铁对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。在制作培养基时不用FeSO4和FeCl3（因其在PH值5.2以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀），而使用FeSO4•7H2O和Na—EDTA的结合成的结合物。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。

43 有机化合物（organic compound）
培养基中只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基（basic medium）。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的的有机成分要以下几类：

44 碳水化合物：最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好生长。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。蔗糖使用浓度在2%—3%，常用3%，即配制一升培养基称取30g蔗糖，有时可用2.5%。但在胚培养时采用4%—15%的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。 不同糖类对生长的影响不同。从各种糖对水稻根培养的影响来看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。不同植物不同组织的糖类需要量也不同，实验时要根据配方规定按量称取，不能任意取量。高压灭菌时，一部分糖会发生分解，制订配方时要给予考虑。在大规模生产时，可用食用的棉白糖代替。

45 维生素（vitamin）：这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养基中都能合成所必须的维生素，但在数量上还明显不足，通常需要加入一至数种维生素，以便获得最良好的生长。主要有VB(盐酸硫胺素) 、VB6(盐酸吡多醇)、VPP(烟酸)、VC(抗坏血酸)，有时还使用生物素、叶酸、VB12等。一般用量为0.1—1.0mg/L。有时用量较高。VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，VPP与植物代谢和胚的发育有一定关系。VC有防止组织变褐的作用。

46 肌醇（myo—inosltol）：又叫环己六醇，在糖类的转化中起重要作用。通常可由磷酸葡萄糖转化而成，还可进一步生成果胶物质，用于构建细胞壁。肌醇与6分子磷酸残基相结合形成植酸，植酸与钙、镁等阳离子结合成植酸钙镁，植酸可进一步形成磷脂，参与细胞膜的构建。使用浓度一般为100mg/L，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。

47 氨基酸（almino acide）：是很好的有机氮源，可直接被细胞利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它们是牛乳用酶法等加工的水解物，是含有20种氨基酸的混合物，用量在10-100mg/L之间。由于它们营养丰富，极易引起污染。如在培养中无特别需要，以不用为宜。

48 天然复合物 天然复合物的成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，它对器官的分化作用不明显。它的成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用。

49 椰乳：是椰子的液体胚乳。它是使用最多，效果最大的一种天然复合物，一般使用浓度在10%-20%，与其果实成熟度和产地关系也很大，它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用。 香蕉：用量为 ml/L。用黄熟的小香蕉，加入培养基后变紫色。对PH值缓冲作用大。主要在兰花的组合培养中应用，对发育有促进作用。

50 马铃薯：去掉皮和芽后，加水煮30min，再经过滤，取滤液使用。用量为150-200g/L。对PH值缓冲作用大。添加后可得到健壮的植株。
水解酪蛋白：为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸，使用浓度为100—200mg/L，受酸和酶的作用易分解，使用时应注意。 其他：酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%).主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液（0.01%-0.5%）、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟的玉米胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用。

51 植物生长调节物质（hormone） 植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各种成分中，植物生长物质是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。

52 1）生长素类（auxin）：在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度下（10-5—10-8mg/L）就可促进生长，其次是茎和芽。天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受体内酶的分解，组织培养中常用人工合成的生长素类物质。

53 IBA（indolebutyri acid 吲哚丁酸）：是促进发根能力较强的生长调节物质。
2，4—D（2，4—二氯苯氧乙酸）启动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育，适宜的用量范围较窄，过量常有毒效应。

54 IAA（indo acetic acid 吲哚乙酸）：
NAA（naphthalene acetic acid 萘乙酸）：在组织培养中的启动能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛应用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。

55 2）细胞分裂素类（cytokinin）：这类激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA（6-苄基氨基嘌呤）、Kt（kinetin 激动素）、Zt（zeatin 玉米素）等。其中Zt活性最强，但非常昂贵，常用6-BA。 在培养基中添加细胞分裂素有三个作用（1）诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长（2）促进细胞分裂与扩大 （3）抑制根的分化。 因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养中使用较少或用量较低。

56 3）GA（gibberellic acid 赤霉素）：

57 激素配比模式 生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素浓度，或调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。 高 有利于根和愈伤组织形成 生长素/细胞分裂素{ 中 有利于芽的分化 低 有利于芽的形成

58 生长调节物质的使用甚微，一般用mg/L表示浓度。在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0.05%-5mg/L，细胞分裂素的浓度 mg/L。

59 抗生物质（antibiotic） 抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5-20mg/L之间。
添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物，采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间。尤其对大量通气长期培养，效果好。对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5%-10%的抗菌素。抗生素各有其抗菌谱，要选择加以利用，也可两种抗生素混用。

60 但是应当注意抗生素对植物组织的生长也有抑制作用，可能有些植物适宜用青霉素，而另一些植物却不适应。
值得一提的是，在工作中不能以为有了抗生素，而放松灭菌措施，此外，在停止抗生素使用后，往往污染率显著上升，这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来。

61 活性碳（active carbon） 活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉末结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附力越强。温度低吸附力强，温度高吸附力弱，甚至解吸附。通常使用浓度为0.5—10g/L。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、琨类物质以及蔗糖在高压消毒只产生的5—羟甲基糖醛及激素等。

62 活性炭作用： 茎尖初代培养，可以吸附外植体产生的致死性褐化物。 活性炭在生根时有明显促进作用。其机理一般认为与活性炭减弱光照有关。 在培养基中加入0.3%的活性炭，还可降低玻璃苗的产生频率。 活性炭在胚胎培养中也有一定作用，可减少组织变褐和培养基变色，产生较少的愈伤组织。 但是，活性炭有副作用，研究表示，每毫克活性炭吸附100mg左右的生长调节物质，这说明

63 只要极少量的活性炭就可以完全吸附培养基的调节物质。
大量活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加一些琼脂。很细的活性炭也易沉淀，通常在琼脂凝固之前，要轻轻摇动培养瓶。总之，在使用时要有量的意识，不能随意添加，使活性炭发挥其积极作用。

64 二 .培养材料的支持物 琼脂（agar）：在固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40ºC即凝固为固体溶胶。通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解于90ºC以上的热水。琼脂的用量在6-10g/L之间，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度太低，凝固性不好。新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。一般

65 琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、PH值等因素有关。长时间的高温会使凝固力下降，过酸过碱会加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。

66 三、环境条件 在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、pH值、渗透压等各种化学环境条件都会影响组织培养育苗的生长和发育。

67 温度(temperature) 因为温度是植物组织培养中的重要因素，所以植物组织培养在最适宜的温度下生长分化才能表现良好，大多数植物组织培养都是在23～27℃之间进行，一般采用25± 2℃。低于15℃℃时培养，植物组织会表现生长停止，高于35℃时对植物生长不利。但是，不同植物培养的适温不同，百合的最适温度是20℃、月季足25-27℃、番茄是28℃。温度不仅影响植物组织培养育苗的生长速度，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽的形成以28℃为最好，在120℃以下，33℃以上形成率皆最低。

68 不同培养目标采用的培养温度也不同，百合鳞片在30℃以下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率都比在25℃以下的高。桃胚在2—5℃条件进行一定时间的低温处理，有利于提高胚培养成活率。用35℃处理草莓的茎尖分生组织3—5d，可得到无病毒苗。

69 光 照 (light) 组织培养中光照也是重要的条件之一，主要表现在光强、光质、以及光照时间方面
1．光照强度(light intensity) 光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植体及细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。 2．光质(light wave) 光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如百合珠芽在红光下培养，8周后，分化出愈伤组织。生长旺盛，而白光下幼苗纤细。

70 但在蓝光下培养，几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种15d后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗
3．光周期(light period) 试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，有时需要暗培养，尤其是一些植物的愈伤组织在暗下比在光下更好。如红花、乌饭树的愈伤组织

71 湿度 (humidity) 湿度的影响包括培养容器保持和环境的湿度条件，容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。前者又受琼脂含量的影响。在冬季应适当减少琼脂用量，否则，将使培养基干硬，以致不利于外植体接触或插进培养基，导致生长发育受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，但封闭性较高的封口材料易引起透气性受阻，也会导致植物生长发育受影响。

72 环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发，一般要求70%—80%的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进行。湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。

73 渗透压(penetrating pressure)
培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，而影响到渗透压的变化。通常1—2个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而5—6个大气压植物生长就会完全停止，6个大气压植物细胞就不能生存。

74 pH值 (pH value) 不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的(表2—1)，大多在5、6．5左右，一般培养基皆要求5.8，这基本能适应大多植物培养的需要。 pH值适度因材料而异，也因培养基的组成而不同。以硝态氮作氮源和以铵态氮作氮源就不一样，后者较高一些。一般来说当pH值高于6．5时，培养基全变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固。因为高温灭菌会降低pH值(约0.2—0.3个pH值)因此在配制时常提高pH值0．2—0．3单位。pH值大小调整可用0．1M的NaOH和0．IM的HCI来调整。lml的NaOH可使pH值升高0．2单位，lml的HCl可使pH值降低0．2单位。调节时一定要充分搅拌均匀。

75 不同植物的最适pH值 种类 最适pH值 杜鹃 4.0 月季 5.8 越桔 4.5 胡萝卜、石刁柏 6.0 蚕豆 5.5 桃 7.0 番茄
5.7

76 氧气(oxygen) 氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染。固体培养基可加进活性炭来增加通气度，以利于发根。培养室要经常换气，改善室内的通气状况。液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等

77 第三节 培养基的制备 一、母液(stock solution)的配制和保存
第三节 培养基的制备 一、母液(stock solution)的配制和保存 在植物组织培养工作中，配制培养基是日常必备的工作。为简便起见，通常先配制一系列母液，即贮备液。所谓母液是欲配制液的浓缩液，这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏。一般母液配成比所需浓度高10-100倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如Ca2+和S042+，Ca2+、

78 Mg2+和PO43- 一起溶解后，会产生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。药品的称量及定容都要准确。各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素等母液，其中维生素、氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起。母液配好后放人冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。

79 母液的配制方法： 单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用a:b表示，即每b毫升溶液中含有a毫克溶质。
混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后每一类混合在一起定容到一定体积配成混合母液，浓度可用a mg/L表示，即配制一升培养基吸取该母液a ml. 生长素配制时可先用少量95%酒精助溶。2，4—D可用O．1mol／L的NaOH或KOH助溶，加入温水定容。生长素常配成1mg／ml的溶液贮于冰箱中备用。

80 细胞分裂素类一般先用少量1N盐配溶解后，再加入温水冷却后定容，
铁盐配法（MS为例）：在装有400ml 蒸馏水的烧杯中加入2粒苛性钠，溶解后加入3.73g EDTA-Na2，加热使其全部溶解，然后边搅拌边慢慢加入2.78g FeSO4.7H2O直至全部溶解，冷却后定容至500ml，置于冰箱中备用。

81 第四节 培养基的选择 在建立一个新的实验体系时，为了能研制出一种适合的培养基，最好先由一种已被广泛使用的基本培养基(如Ms培养基或B5培养基)开始。当通过一系列的实验，对这种培养基做了某些定性和定量的小变动之后，即有可能得到一种能满足实验需要的新培养基，选择最佳培养基。常用试验方法主要有单因子试验、多因子试验及广谱实验等。

82 一、单因子试验 在单因子试验中．由于培养基中其他成分都维持在一般水平上，所以只变动一个因子，就可以找出这一因子对试验的影响和影响的程度。例如Ms基本培养基的其他成分和用量都不变，只变动NAA用量对某一培养物生根的影响，这种只研究一个因素的试验就是单因子试验。 生物学试验不同于物理学或化学试验，最显著的差别是在生物学试验中必需设置对照组与试验组，试验组可以有一组或几组，随试验的复杂性而设置，对照组也可能有一组以上。

83 试验中要求对照组与试验组中的试验个体，即植物组织块或其他培养物，必须在遗传性、生理状态、前培养条件等方面，尽可能完全一致。以保证试验结果是来源于试验因子，而不是由于试验材料的不一致导致的。
试验中各处理一般都要设有一定的重复，以取得可靠的试验结果。随试验规模和要求不同，大多每个项目要有4—10瓶，每瓶至少3块培养物或3丛小幼苗。

84 二、多因子试验 对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验，试验可采用完全试验方案，也可选用正交设计方案，完全试验方案具有均衡完全的特点，各个因子的每个水平都相互搭配，构成了所有可能的处理组合，如研究NAA和6—BA的最佳浓度组合，每个因子各设5个浓度水平(0，0.5，2.5，5，10mg／L)，这两种因子各种浓度的所有组合，就构成了一个具有25项处理的试验见下表：

85 2种激素5种浓度的实验组合 6-BA mg/L） 0 0.5 2.5 5 1 0 NAA 0 1 2 3 4 5

86 完全试验方案试验因子越多，处理数越多，试验越复杂，消耗的精力、物力越多。为了减少试验处理，但又能准确全面地获得试验信息，通常采用正交试验。例如，采用正交设计，在使用此表时就可以安排4个因子，3种水平的试验，一共做9种不同搭配的试验，其结果相当于做了27次种种搭配的试验。正交试验虽然是多因素搭配在一起的试验，但

87 是在试验结果的分析中，每一种因素所起的作用却又能够明白无误地表现出来。因此，一次系统的试验结果，就可以把问题分析得清清楚楚，用有限的时间取得成倍的收获。在组织培养研究中，可用于同时探求培养基中适宜的几种成分的用量，如细胞分裂素、生长素、糖和其他成分的用量。

88 三、逐步添加和逐步排除的 试验方法 在植物组织分化与再生的研究中，在没有取得可靠的分化与再生之前，往往添加各种有机营养成分，而在取得了稳定的再生之后，就可以逐步减少这些成分。在逐步添加时是使试验成功，在逐步减少时是缩小范围，以便找到最有影响力的因子，或是为了实用上的需要竭力使培养基简化，以降低成本和利于推广。在寻求最佳激素配比时，也经常用到这种加加减减的简单方法。

89 四、广谱实验法 在广谱实验法中，把培养基中所有组分分为4大类： 无机盐 有机营养物质(蔗糖、氨基酸和肌醇等) 生长素 细胞分裂素
对每一类物质选定低(L)、中(M)、和高(H)3个浓度,4类物质各3种浓度的自由组

90 合即构成了一项包括81个处理的实验。在这81个处理中最好的一个可用4个字母表示,例如，一个包含中等浓度无机盐，低等浓度生长素、中等浓度细胞分裂素和高等浓度有机营养物质的处理即可表示为MLMH。达到这个阶段，再试用不同类型的生长素和细胞分裂素即可找到培养基的最佳配方。这是因为不同类型的生K素和细胞分裂素对不同植物的活性有所不同。

91 第二章 外植体的选择及灭菌 第一节 外植体的选择 泛指第一次接种所使用的植物组织、器官等一切材料。如，顶芽、茎段、叶片等。
（一）.外植体的选择： 一. 部位：不同的植物、器官和组织其形态发生能力很不相同。在组培中，选择合适的，最易表达全能性的部位，是决定组培系成功建立的前提之一。

92 在选择植物外植体进行组织培养时，还要考虑待培养材料的来源是否保证，是否容易成苗；同时要考虑到该外植体，特别是经过脱分化产生的愈伤组织，是否会引起不良变异，丧失原品种的优良性状。
茎尖：对大多数植物来讲，茎尖是较好的部位，由于其形态已经基本建成，生长速度快，遗传性稳定，也是获得无病毒苗的重要途径，但茎尖易受到材料来源的限制，而采用茎段（一般木本植物、较大的草本植物）可解决培养材料的不足。

93 叶片：由于叶片的来源最有保证，因而许多植物的组织培养以叶片为起始培养物，如，玫瑰、海棠、矮牵牛和豆瓣绿等许多植物。
子叶或下胚轴：对一些培养较困难的植物，则往往可以通过其子叶或下胚轴来建立其组织培养体系。 若有可能，最好对培养较困难的植物各部位的诱导及分化能力进行比较，从中筛选出最佳外植体。

94 二. 取材季节： 对大多数植物而言，应在生长开始的季节采样较好，若在生长末期或已进入休眠期时取样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。在母株生长旺盛的季节取材料，不仅成活率高而且增殖率也大。如，马铃薯在12月和4月所取的外植体具有强烈的再生能力。而2~3月间或5~11月间所取的材料，则很少能够再生。

95 三. 生理年龄： 按照生理学基本观点，沿植物体主轴，越向上的部位所形成的器官其生长时间越短的，其生理年龄也相应越老，越接近发育上的成熟，越易形成花器官。反之，越向基部，其生理年龄越小，幼年的组织都比老年的组织具有较高的形态发生能力。植株下部组织产生营养芽的比例高，而上部组织产生花器官的比例高。因此，外植体的采集尽量选用植物体最幼态的组织。

96 四. 外植体的大小： 外植体越大，污染率越高，但也不能过小，越小成活率越低。在通常情况下，叶片、花瓣等的面积约为5mm²，茎段为0.5cm²，除非是用于去除病毒，否则不宜将外植体切得过小。

97 第二节 灭菌 灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。依此观点，无菌室等未经处理的地方、超净台表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。

98 这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。茵的特点是：极小，肉眼看不见。无处不在，无时不有，无孔不人。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。
无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体(当然这些方法必须已经证明是有效的)。高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的。从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小得多。

99 菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台、等)和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作。

100 一. 灭菌方法 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。

101 湿热灭菌（培养基） 培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在o．1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到O．05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到0．1MPa时压力0．1-0．15MPa，20min。

102 对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。
对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20-30min。 高压灭菌前后的培养基，其pH值下降 单位。高压后培养基pH值的变化方向和幅度取决于多种因素。在高压灭菌前用碱调高pH值至预定值的则相反。培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度

103 物质时，高压灭菌后的pH值变化幅度较大，甚至可大于2个pH值单位。环境pH值的变化大于0.5单位就有可能产生明显的生理影响。
高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。在8%-20%蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高0．43倍。 培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基值小于5.5，其水解量更多，培养基中添加0.1%活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1%活性炭，蔗糖水解率可达5%。

104 防止高压灭菌培养基变化的方法： (1)经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，及时采取有效措施。
(2)设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量(在0.1%以下)注意pH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。

105 (3)配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙和铁放在最后加入。
(4)注意高压灭菌后培养基pH值的变化及回复动态。如高压灭菌后的pH值常由5.80升高至6.48。而96h后又回降至5.8左右。这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握。

106 灼烧灭菌（用于无菌操作的器械 ） 在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具

107 干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具） 干热灭菌是利用烘箱加热到 ~C的温度来杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽抱的抗热水平，通常采用170℃持续90min来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温，达到顶定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。

108 过滤灭菌（不耐热的物质 ） 一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。
防细菌滤膜的网孔的直径为0.45μm以下，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。

109 紫外线和熏蒸灭菌（空间） (1)紫外线灭菌 在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200—300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2m为宜。 (2)熏蒸灭菌 用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。

110 常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5—8ml／m3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。
化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例外。

111 喷雾灭菌（物体表面） 物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用70%的酒精反复涂擦灭菌，l%-2%的来苏儿溶液以及0.25%—1%的新洁尔灭也可以。

112 消毒剂灭菌（用于植物材料表面） 从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带人培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。 第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。

113 洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质—吐温。
第二步 是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10～30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。

114 第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1—2种使用见表。
常用灭菌剂使用浓度及效果比较表 灭菌剂 使用浓度(%) 持续时间（min） 去除的难易 效果 次氯酸钙 9~10 5~30 易 很好 次氯酸钠 2 氯化汞 0.1~1 5~8 较难 最好 抗菌素 4~50mg/L 30~60 中 较好

115 上述灭菌剂应在使用前临时配制，氯化汞可短期内贮用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的，故灭菌时用广口瓶加盖较好；升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的；过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的，这种药剂残留的影响较小，灭菌后用无菌水涮洗3—4次即可；由于用升汞液灭菌的材料，难以对升汞残毒较难去除，所以应当用无菌水涮洗8～10次，每次不少于3min，以尽量去除残毒。 灭菌时，把沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中，记好时间，倒人消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快到时间之前1—2min，开始把消毒液倾人一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即

116 倒入无菌水，轻搅涮洗。灭菌时间是从倒人消毒液开始，至倒入无菌水时为止。记录时间还便于比较消毒效果，以便改正。灭菌液要充分浸没材料，宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。
在灭菌溶液中加吐温—80或Tnton X效果较好，这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布，更容易浸人到灭菌的材料表面。但吐温加人后对材料的伤害也在增加，应注意吐温的用量和灭菌时间，一般加入灭菌液的O.5%，即在100ml加入15滴。 最后一步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-l0次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。

117 第三章 外植体的接种培养及驯化 第一节 接 种 接种时由于有一个敞口的过程，所以是极易引起污染的时期，这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起，接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用1%—3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期间用70%的酒精或3%的来苏儿喷雾，使空气中灰尘颗粒沉降下来。无菌操作可按以下步骤进行：

118 (1)在接种4h前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外灯进行灭菌；
(2)在接种前20min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯； (3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等； (4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后擦拭工作台面； (5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干； (6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等； (7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。 若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。

119 具体的接种操作： (1)将初步洗涤及切割的材料放人烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的4层纱布上或滤纸上。 (2)材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm见方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含l—2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。 (3)用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。具体操作过程是：先解开包口纸，将试管几乎水平拿着，使试管囗靠近酒精灯火焰，

120 并将管口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。若用棉塞盖口，可先在管口外面灼烧，去掉棉塞，再烧管口里面。然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内，轻轻插入培养基。若是叶片直接附在培养基上，以放1—3块为宜。至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放(尖端向上)外，其他尚无统一要求。放置材料数量现在倾向少放，通过统计认为：对外植体每次接种以一支试管放一枚组块为宜，这样可以节约培养基和人力，一旦培养物污染可以抛弃，接完种后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟。并用棉塞，塞好后，包上包口纸，包囗纸里面也要过火。

121 第二节 培养和驯化 指把培养材料放在培养室(有光照、温度条件)里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。

122 一、培养方法 (1)固体培养法 即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。虽然该方法设备简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。 (2)液体培养法 即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50-100r／min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。

123 二、培 养 步 骤 1 . 初代培养 初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。即接种某种外植体后，最初的几代培养。初代培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。初代培养建立的无性繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。根据初代培养时发育的方向可分为：

124 1)顶芽和腋芽的发育 采用外源的细胞分裂素，可促使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长，从而形成 一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。在几个月内可以将这种丛生苗的一个枝条转接继代，重复芽——苗增殖的培养，并且迅速获得多数的嫩茎。然后将一部分嫩茎转移到生根培养基上，就能得到可种植到土壤中去的完整的小植株。一些木本植物和少数草本植物也可以通过这种方式来进行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。这种繁殖方式也称作微型扦插，它不经过发生愈伤组织而再生，所以是最能使无性系后代保持原品种特性的一种繁殖方式。

125 适宜这种再生繁殖的植物，在采样时，只能采用顶芽、侧芽或带有芽的茎切段，其他如种子萌发后取枝条也可以。
茎尖培养可看作是这方面较为特殊的一种方式。它采用极其幼嫩的顶芽的茎尖分生组织作为外植体进行接种。在实际操作中，采用包括茎尖分生组织在内的一些组织来培养，这样便保证了操作方便以及容易成活。 用靠培养定芽得到的培养物一般是茎节较长，有直立向上的茎梢，扩繁时主要用切割茎段法，如香石竹、矮牵牛、菊花等。但特殊情况下也会生出不定芽，形成芽丛。

126 2)不定芽的发育 在培养中由外植体产生不定芽，通常首先要经脱分化过程，形成愈伤组织的细胞。然后，经再分化，即由这些分生组织形成器官原基，它在构成器官的纵轴上表现出单向的极性(这与胚状体不同)。多数情况下它先形成芽，后形成根。 另一种方式是从器官中直接产生不定芽，有些植物具有从各个器官上长出不定芽的能力如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。当在试管培养的条件下，培养基中提供了营养，特别是提供了连续不断植物激素的供应，使植物形成不定芽的能力被大大地激发起来。许多种类的外植体表面几乎全部为不定芽所覆盖。

127 在许多常规方法中不能无性繁殖的种类，在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生，如柏科，松科，银杏等一些植物。许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽，用臼合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。
在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基。用靠培养不定芽得到的培养物，一般采用芽丛进行繁殖，如非洲菊、草莓等。

128 3)体细胞胚状体的发生与发育 体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不同，它也通过球形、心形、鱼雷形和子叶形的胚胎发育时期，最终发育成小苗。但它是由体细胞发生的。胚状体可以从愈伤组织表面产生，也可从外植体表面已分化的细胞中产生，或从悬浮培养的细胞中产生，也可从外植体表面已分化的细胞中产生，或从悬浮培养的细胞中产生。

129 2 继代培养 在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等，数量都还不多，它们需要进一步增殖，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。
2 继代培养 在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等，数量都还不多，它们需要进一步增殖，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。 继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。旨在繁殖出相当数量的无根苗，最后能达到边繁殖边生根的目的。继代培养的后代是按几何级数增加的过程。如果以2株苗为基础，那么经10代将生成210株苗。

130 继代培养中扩繁的方法包括：切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。切割茎段常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物。这种方法简便易行，能保持母种特性。培养基常是MS0基本培养基；分离芽丛适于由愈伤组织生出的芽丛。培养基常是分化培养基。若芽丛的芽较小，可先切成芽丛小块，放人MS0培养基中，待到稍大时，再分离开来继续培养。

131 增殖使用的培养基对于一种植物来说每次几乎完全相同．由于培养物在接近最良好的环境条件，营养供应和激素调控下，排除了其他生物的竞争，所以能够按几何级数增殖；；
在快速繁殖中初代培养只是一个必经的过程，而继代培养则是经常性不停的进行过程。但在达到相当的数量之后，则应考虑使其中一部分转入生根阶段。从某种意义上讲，增殖只是贮备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。

132 3 培养过程中常出现的问题及解决方法 初代培养外植体的褐变
外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。

133 褐变的主要原因 ①植物品种 研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差异，因此，有些花卉品种的外植体在接种后较容易褐变，而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。 ②生理状态 由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。一般来说，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。

134 ③培养基成分 浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。
④培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。

135 减轻褐变现象发生的方法 ①选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。
①选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。 ②合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。 ③使用抗氧化剂 在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸、PVP等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。另外，使用0.1%-0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。 ④连续转移 对容易褐变的材料可间隔12~24h的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-l0d后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。

136 继代培养时材料的玻璃化 实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化为试管苗的生理失调症。 因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，因此，使繁殖系数大为降低。在不同的种类、品种间，试管苗的玻璃化程度也有所差异。当培养基上细胞分裂素水平较高时，也容易出现玻璃化现象。在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生。呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作

137 用强，无法进行正常移栽。这种情况主要是由于培养容器中空气湿度过高，透气性较差造成的，其具体解决的方法为：
①增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势； ②减少培养基中含氮化合物的用量； ③增加光照； ④增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用； ⑤降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生； ⑥降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。

138 4 生根培养 当材料增殖到一定数量后，就要使部分培养物分流到生根培养阶段。若不能及时将培养物转到生根培养基上去，就会使久不转移的苗子发黄老化，或因过分拥挤而使无效苗增多造成抛弃浪费。根培养是使无根苗生根的过程，这个过程目的是使生出的不定根浓密而粗壮。生根培养可采用1／2或者1/4MS培养基，全部去掉细胞分裂素，并加入适量的生长素(NAA、IBA等)。

139 诱导生根方法： ①将新梢基部浸入50或100×10-6I IBA溶液中处理4—8h；②在含有生长素的培养基中培养4-6d；③直接移入含有生长素的生根培养基中。上述三种方法均能诱导新梢生根，但前二种方法对新生根的生长发育则更为有利。而第三种对幼根的生长有抑制作用。其原因是当根原始体形成后较高浓度生长素的继续存在，则不利于幼根的生长发育。不过这种方法比较可行。 另外也可采用下列方法就可生根： ①延长在增殖培养基中的培养时间；

140 ②有意降低一些增殖倍率，减少细胞分裂素的用量(即将增殖与生根合并为一步)；
③切割粗壮的嫩枝在营养钵中直接生根，此方法则没有生根阶段。可以省去一次培养基制作，切割下的插穗可用生长素溶液浸蘸处理，但这种方法只适于一些容易生根的作物。 另外少数植物生根比较困难时，则需要在培养基中放置滤纸桥，使其略高于液面，靠滤纸的吸水性供应水和营养，从而诱发生根。

141 从胚状体发育成的小苗，常常有原先已分化的根，这种根可以不经诱导生根阶段而生长。但因经胚状体途径发育的苗数特别多，并且个体较小，所以也常需要一个低浓度或没有植物激素的培养基培养的阶段，以便壮苗生根。
试管内生根壮苗的阶段，为了成功地将苗移植到试管外的环境中，以使试管苗适应外界的环境条件。通常不同植物的适宜驯化温度不同。如菊花，以18～20℃为宜。

142 实践证明植物生长的温度过高不但会牵涉到蒸腾加强。而且还牵涉到菌类易滋生的问题。温度过低使幼苗生长迟缓，或不易成活。春季低温时苗床可加设电热线，使墓质温度略高于气温2～3℃，这不但有利于生根和促进根系发达，而且还有利于提前成活。 移植到试管外的植物苗光强度应比移植前培养有所提高，并可适应强度较高的漫射光，(约4000h左右)，以维持光合作用所需光照强度。但光线过强刺激蒸腾加强，会使水分平衡的矛盾更尖锐。

143 三、试管苗移栽驯化 试管苗移栽是组织培养过程的重要环节，这个工作环节做不好，就会造成前功尽弃。为了做好试管苗的移栽，应选择合适的基质，并配合以相应的管理措施，才能确保整个组织培养工作的顺利完成。 试管苗由于是在无菌、有营养供给、适宜光照和温度近100%的相对湿度环境条件下生长的，因此，在生理、形态等方面都与自然条件生长的正常小苗有着很大的差异。所以必须通过炼苗，例如通过控水、减肥、增光、降温等措施，使它们逐渐地适应外界环境，从而使生理、形态、组织上发生相应的变化，使之更适合于自然环境，只有这样才能保证试管苗顺利移栽成功。

144 从叶片上看，试管苗的角质层不发达，叶片通常没有表皮毛，或仅有较少表皮毛，甚至叶片上出现了大量的水孔，而且，气孔的数量、大小也往往超过普通苗。由此可知，试管苗更适合于高湿的环境生长，当将它们移栽到试管外环境时，试管苗失水率会很高，非常容易死亡。因此，为了改善试管苗的上述不良生理、形态特点，则必须经过与外界相适应的驯化处理另外，对栽培驯化基质要进行灭菌，因为试管苗在无菌的环境中生长，对外界细菌、真菌的抵御能力极差。为了提高其成活率，在培养基质中可掺入75%的百菌清可湿性粉剂 倍液，以进行灭菌处理。 ，通常采取的措施有：对外界要增加湿度、减弱光照；对试管内要通透气体、增施二氧化碳肥料、逐步降低空气湿度等。

145 一. 移栽用基质 适合于栽种试管苗的基质要具备透气性、保湿性和一定的肥力，容易灭菌处理，并不利于杂菌滋生的特点，一般可选用珍珠岩、蛭石、砂子等。为了增加粘着力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土。配时需按比例搭配，一般用珍珠岩，蛭石，草炭土或腐殖土比例为1:1:0.5。也可用砂子：草炭土或腐殖土为1:1。这些介质在使用前应高压灭菌。或用至少3h烘烤来消灭其中的微生物。要根据不同植物的栽培习性来进行配制，这样才能获得满意的栽培效果。以下介绍几种常见的试管苗栽培基质。

146 (1)河砂:河砂分为粗砂、细砂两种类型。粗砂即平常所说的河砂，其颗粒直径为1—2mm。细砂即通常所说的面砂，其颗粒直径为0. 1—0
(1)河砂:河砂分为粗砂、细砂两种类型。粗砂即平常所说的河砂，其颗粒直径为1—2mm。细砂即通常所说的面砂，其颗粒直径为0.1—0.2mm。河砂的特点是排水性强，但保水蓄肥能力较差，一般不单独用来直接栽种试管苗。 (2)草炭土:草炭土是由沉积在沼泽中的植物残骸经过长时间的腐烂所形成，其保水性好，蓄肥能力强，呈中性或微酸性反应，但通常不能单独用来栽种试管苗，宜与河砂等种类相互混合配成盆土而加以使用。

147 (3)腐殖土:腐殖土是由植物落叶经腐烂所形成。一种是自然形成，一种是人为造成，人工制造时可将秋季的落叶收集起来，然后埋人坑中，灌水压实令其腐烂。第二年春季将其取出置于空气中，在经常喷水保湿的条件下使其风化，然后过筛即可获得。腐叶上含有大量的矿质营养、有机物质，它通常不能单独使用。掺有腐殖土的栽培基质有助于植株发根。

148 二. 移栽前的练苗 移栽前可将培养物不开口移到自然光照下锻炼2—3d，让试管苗接受强光的照射，使其长得壮实起来，然后再开口练苗1—2d，经受较低湿度的处理，以适应将来自然湿度的条件。

149 三. 移栽和幼苗的管理 从试管中取出发根的小苗，用自来水洗掉根部粘着的培养基，要全部除去，以防残留培养基滋生杂菌。但要轻轻除去，应避免造成伤根。栽植时用一个筷子粗的竹签在基质中插一小孔，然后将小苗插入，注意幼苗较嫩，防止弄伤，栽后把苗周围基质压实，栽前基质要浇透水。栽后轻浇薄水。再将苗移入高湿度的环境中。保证空气湿度达90%以上。

150 (1)保持小苗的水分供需平衡 在移栽后5-7d内，应给予较高的空气湿度条件，使叶面的水分蒸发减少，尽量接近培养瓶的条件，让小苗始终保持挺拔的状态。保持小苗水分供需平衡首先营养钵的培养基质要浇透水，所放置的床面也要浇湿，然后搭设小拱棚，以减少水分的蒸发，并且初期要常喷雾处理，保持拱棚薄膜上有水珠出现。当5—7d后，发现小苗有长趋势，可逐渐降低湿度，减少喷水次数，将拱棚两端打开通风，使小苗适应湿度较小的条件。约15d以后揭去拱棚的薄膜，并给予水分控制，逐渐减少浇水，促进小苗长得粗壮。

151 (2)防止菌类滋生 由于试管苗原来的环境是无菌的，移出来以后难以保持完全无菌，因此，应尽量不使菌类大量滋生，以利成活。所以应对基质进行高压灭菌或烘烤灭菌。可以适当使用一定浓度的杀菌剂以便有效地保护幼苗，如多菌灵、托布津，浓度800—1000倍，喷药宜7—l0d一次。在移苗时尽量少伤苗，伤口过多，根损伤过多，都是造成死苗的原因。喷水时可加入0.1%的尿素，或用1／2MS大量元素的水溶液作追肥，可加快苗的生长与成活。

152 (3)一定的温、光条件 试管苗移栽以后要保持一定的温光条件，适宜的生根温度是18—200C，冬春季地温较低时，可用电热线来加温。温度过低会使幼苗生长迟缓，或不易成活。温度过高会使水分蒸发，从而使水分平衡受到破坏，并会促使菌类滋生。 另外在光照管理的初期可用较弱的光照，如在小拱棚上加盖遮阳网或报纸等，以防阳光灼伤小苗和增加水分的蒸发。当小植株有了新的生长时，逐渐加强光照，后期可直接利用自然光照。促进光合产物的积累，增强抗性，促其成活。

153 (4)保持基质适当的通气性 要选择适当的颗粒状基质，保证良好的通气作用。在管理过程中不要浇水过多，过多的水应迅速沥除，以利根系呼吸。 综上所述，试管苗在移栽的过程中，只要把水分平衡、适宜的介质、控制杂菌和适宜的光、温条件控制好，试管苗是很容易移栽的。

154 第四章 愈伤组织的培养 植物的脱分化形式有两种，器官发生型和胚胎发生型，在有些情况下，再分化可以直接发生于脱分化的细胞中，无须经历愈伤组织阶段，但大多数情况下，再分化过程是在愈伤组织细胞中发生的。

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156 一． 愈伤组织形成的条件 虽然如全能性所言，发育和分化过程并不导致细胞全能性的丧失，但是，在一个完整的植物中，每个分化细胞都是某个器官和组织中的一个成员，它只能在与其周围成员相互协调和彼此制约当中，恰如其分地发挥整个植株所赋予它的一定的功能，而不具备施展其全能性的外部条件。然而，这些细胞若是一旦脱离了母体植株，摆脱了原来所受到的遗传上的控制和生理上的制约，在不定期下的培养条件下，就会发生一种回复变化，从而失去分化状态，变为分生细胞，实现脱分化过程。然后，这些脱分化细胞经过连续的有丝分裂，形成愈伤组织（离体隔离）。

157 大量研究表明，几乎所有高等植物的各种器官，如根、茎、叶和花等，以及各种组织，如皮层、茎髓和形成层等，离体后在适当条件下，都能产生愈伤组织。由此可见，愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类，而是培养条件，其中激素的种类和浓度最为重要。当然，外植体的类型和外植物体原来在植株上所处的位置（反映了内源激素水平）对愈伤组织诱导的影响也不能忽视。

158 二．愈伤组织形成的过程 外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱导下通过脱分化后形成愈伤组织，这一过程被大致划分为三个时期（诱导期、分裂期和形成期）。

159 诱导期：细胞分裂的准备期 诱导期是细胞准备进行分裂的时期。接种的外植体材料的细胞通常都是成熟细胞，处于静止状态，细胞大小没有多大变化，外观无明显特征，但细胞内物质代谢旺盛，王凯基等（1981）在研究离体培养的油橄榄茎段时发现，细胞内合成代谢活跃，RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大。 诱导期的长短，因植物种类和外植体的生理状况和外部因素而异，如胡萝卜的诱导期要好几天，新鲜的菊芋块茎则只要22h，但菊芋块茎经过5个月的贮藏后，诱导期则须延长到40h以上。

160 分裂期：细胞从开始分裂到持续分裂的时期 分裂期是指细胞通过一分为二的分裂，不断增生子细胞的过程。外植体的细胞一旦经过诱导，其外层细胞开始迅速分裂，使细胞脱分化。分裂期主要表现如下： 1.细胞的数目迅速增加。如胡萝卜培养7天后，细胞数可增加10倍。 2.每个细胞平均鲜重下降。这是由于细胞鲜重的增加不如细胞数目的增加快的缘故。

161 3.细胞体积小，内无液泡，如同根尖和茎尖的分生组织细胞特性。
4．细胞的核和核仁增大到最大 5. 细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不变。 6. 随着细胞不断分裂和组织生长，细胞的总干重、蛋白质和 核酸含量大大增加，新细胞壁的合成极快 总之，分裂期的愈伤组织的共同特征是：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态。

162 形成期：从愈伤组织到器官发生 形成期是指外植体经过诱导期和分裂期后形成了无序结构的愈伤组织的时期。进入形成期后，细胞的平均大小相对稳定，不再减少，细胞分裂由原来局限在组织外缘的平周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂，结果形成瘤状或片状的拟分生组织（meristemoid），称做分生组织结节。

163 分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心，或者进一步分化为维管组织结节——由分生组织结节外围的细胞作平周分裂成为形成层状细胞，并形成了部分维管组织如管胞、纤维细胞等，但不形成维管系统。由于此期细胞分裂已基本停止，细胞内发生生理代谢等的变化而开始形成一些不同形态和功能的细胞，因此有人又将此期称为分化期。

164 三. 愈伤组织的继代培养 脱分化细胞不断进行分裂，从而形成了愈伤组织，愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。这个过程叫做继代。通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保持在不分的增殖状态。然而，如果让愈伤组织留在原培养基上继续培养而不继代，它们则不可避免地发生分化，产生新的结构。

165 四. 愈伤组织的生长 一般来说，愈伤组织的增殖生长只发生在不与琼脂接触的表面，而与琼脂接触的一面极少细胞增殖，只是细胞分化形成紧密的组织块。它是愈伤组织表面或近表面瘤状物生长的结果。 愈伤组织之间的质地有显著不同，有的很松脆，有的很坚实，且这两类愈伤组织可互相转变。其方法是：加入高浓度的生长物质，可使坚实的愈伤组织变为松脆。反之，减低或除去生长物质，则松脆的愈伤组织可以转变为坚实。松脆愈伤组织都有大量的分生组织上中心，进行活跃的细胞分裂，为大而未分化的细胞所分开；而不脆的坚实的愈伤组织很少分化，大都是高度液泡化的细胞。

166 脆的愈伤组织是进行悬浮培养最适合的材料，稍经机械振荡，即可使组织分散成单细胞或少数几个细胞组成的小细胞团。在培养中细胞产生迅速增殖，而坚实的愈伤组织中的细胞间被果胶质紧紧地粘着，因而往往不能形成良好的悬浮系统。 愈伤组织的质地不同是由其内部结构上的差异所引起的。坚实致密的愈伤组织内无大的细胞间隙，而由管状细胞组成维管组织；松脆愈伤组织内有大量的细胞间隙，细胞排列毫无次序。 生长旺盛的愈伤组织一般呈奶黄色或白色，有光泽，也有淡绿色或绿色的；老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。

167 外植体的脱分化因植物种类和器官及其生理状况而有很大差别，如烟草、胡萝卜等脱分化较易，而禾谷类的脱分化较难；花器脱分化较易，而茎叶较难；幼嫩组织脱分化较易，而成熟的老组织较难。
一个多细胞外植体通常包含着各种不同类型的细胞，因此，由它所形成的愈伤组织也是异质性的，其中不同的组分细胞具有不同的形成完整植株或器官的能力，即不同的再分化能力。

168 以上对愈伤组织形成过程的时期的划分并不具有严格的意义，实际上，特别是分裂期和形成期往往可以出现在同一块组织上。另外，有一些研究者曾反复指出的，虽然细胞脱分化的结果在大多数情况下是形成愈伤组织，但这绝不意味着所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织。相反，脱分化后可直接分化为胚性细胞而形成体细胞胚。

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170 五. 愈伤组织的形态发生方式 愈伤组织分生细胞团可进行再分化，即进行形态建成，可再产生完整的植株。
形态建成：外植体在适宜的培养条件下经脱分化、分化或直接发育成各种形态完整的植物体的过程。 在愈伤组织培养物中，细胞分裂常以无规则方式发生，并产生无明显形态或极性的无序结构组织块，这时虽然在愈伤组织中发生了细胞分化，形成维管化组织和瘤状结构，但并无器官发生。只有满足某些条件，才可从愈伤组织发生再分化而产生苗或根的分生组织，甚至胚状体，进而使它发育成苗或完整植株。

171 在组织培养中，从外植体形成器官或无性系的形态发生，有下面两种方式：
1．不定芽方式（unfixed bud） 指细胞或愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成植株，这是细胞和组织培养中常见的器官发生方式。愈伤组织的器官发生顺序有四种情况： （1）愈伤组织中有根或芽器官的分别形成，即无根的芽或无芽的根； （2）先形成芽，再在芽伸长后，在其茎的基部长出根而形成小植株，多数植物属这种情况；

172 （3）先产生根，再从根的基部分化出芽而形成小植株。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；
（4）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株小植株。 2．胚状体方式（somatic embryo） 指由培养细胞诱导分化出的胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。（以后章节中介绍）

173 六．愈伤组织形态发生的调控 来源于不同植物或同一种植物不同部们的愈伤组织，在颜色、结构和生长习性上都可能存在差异，其遗传生理功能也可能或是具有胚性，或是不具胚性，在不同的实验中由于目的的不同，对愈伤组织状态的要求也不完全相同，但优良的愈伤组织通常必须具备以下4个特性中的2-3个。 1.高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植物。

174 2．容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性的原生质体。
3. 旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。 4．经过长期继代保存而不丧失胚性，有便有可能对它们进行各种遗传操作。 细胞和愈伤组织的形态发生，主要受外植体本身、培养基和培养环境等三大类因素的调控。

175 （一）材料本身 1．遗传型 材料的基因型对愈伤组织的器官分化有决定性的影响。不同植物种的器官分化明显不同，如烟草、胡萝卜和矮牵牛等植物容易诱导器官形成，而禾谷类、豆类、棉花等就比较困难。 2．器官和部位 通常同一种植物的不同器官或组织所形成的愈伤组织，无论在生理上或形态上，其差别均不大。但是有些植物而言，确有明显差异。如油菜的花器官比叶、根易于分化成苗，水稻和小麦幼穗

176 的苗分化频率也比其他器官为高。 3．年龄 年龄较幼的外植体，不仅易于诱导形成愈伤组织，而且也容易诱导分化成植株。如油菜植株的自下而上的茎段的培养结果表明，下部的器官形成频率低，愈入上部，苗的分化频率越高，苗分化频率越低。因此在组织培养中，要及时转移已形成的愈伤组织进行分化培养，可大大提高苗的分化频率。

177 （二）培养基 培养基的各种成分和物理性质，都对器官发生产生一定影响，但起决定作用的仍然是植物生长调节剂，特别是生长素和细胞分裂素的配比。 1．生长调节剂 细胞分裂素/生长素的比例是控制芽和根形成的重要条件之一，生长素对芽的抑制作用可为细胞分裂素所克服。细胞分裂素/生长素比例高时有利于芽形成；而这一比例低时，有利于根的形成。这样通过变换激素的种类和浓度，即可有效地调节培养组织的器官分化。

178 但是，要注意的是不同的生长素和细胞分裂素，对生根和长芽的效果是不同的。如NAA对生根的作用比IAA和IBA的效果好，但用IAA和IBA处理，产生的根比较健壮，而用NAA处理，产生的根则较纤细。2，4-D往往对生根不利，特别是在较高浓度下。Kt和BA能广泛地诱导芽的形成，但BA比Kt的效力大。玉米素的作用范围较窄，但对某些植物有特效。因此，往往多数植物采用BA 和Kt来诱导芽的形成。

179 2．无机营养元素 在植物组织培养中和整体植物一样，细胞的生长也要求满足植物生长的必要元素，若完全投入或过多或不足，也会影响细胞生长和分化。不过其影响不如激素的影响明显。但是各种类型的植物，器官所需要的每种元素的量，特别是大量元素是有区别的，如生根培养要求无机离子浓度小一些，所以常用1/2MS或White。如有些植物要求的氮，以硝酸态形式供应为佳；而有些植物要求的氮，以铵态氮的形式供应为佳。

180 当某些营养元素的供应不足时，愈伤组织所表现出来的症状如下：
氮——某些组织（如五叶地锦）表现出一种很引入注目的花色素苷的颜色；不能形成导管。 氮、钾和磷——细胞过度生长，形成层组织减退； 硫——非常明显地褪绿。 铁——细胞分裂停止。 硼——细胞分裂停滞，细胞伸长。 锰或钼——影响细胞伸长。

181 3．有机成分 在培养基中加了糖各类B族维生素、肌醇和甘氯酸等，可以满足愈伤组织的生长和分化的要求。各中氯基酸和嘌 呤、嘧啶类物质，可以促进器官分化。其中酪氨酸可明显增加烟草组织培养的器官形成。酰胺类往往有促进器官形成的作用。水解酪蛋白中含有多种氨基酸，在进行器官分化培养时，加入一定量是有益的。

182 4． 物理性质 培养基的物理性质（固体或液体状态，渗透压等）对形态发生有明显的影响。在胡萝卜和石刁柏的培养过程中，需要改变培养基的形式，才能顺利地分化出苗。其方法是：第一阶段诱导形成愈伤组织，应在固体培养基上进行培养；第二阶段细胞和胚状体的增殖，需在液体培养基中完成；第三阶段由胚状体发育成可移植的植株，又应转移到固体琼脂培养基上进行培养。

183 培养基中的渗透压，对细胞增殖和胚状体的形成都有十分明显的影响，在花药培养中受到普遍的重视。如油菜花药培养宜先在高糖（9-10%）培养基中培养，有利于细胞增殖和胚状体的形成。

184 （三）培养环境条件 光周期的影响： 光周期的需要与否，应根据植物种类培养目的来决定。 在愈伤组织诱导阶段，一般采用三种做法：全暗、周期性光照、散射性光照，上述两种做法诱导率差异不大。另一些植物差异较大，如石刁柏全暗诱导愈伤组织，要比周期性光照下好得多。大豆愈伤组织诱导采用散射性光照比较好；光照对地钱干重的增加明显地优于黑暗培养。 器官发生阶段，一般给予周期性光照比较好。光周期长短因植物种类而异。多数植物8-10小时黑暗为宜。如茄子、苹果等。也有例外，有些植物如石刁柏需要16小时光照，12小时黑暗。

185 温度：在组织培养中，一般都采用22-25℃的恒温条件下进行外植体的培养。对一般植物来讲，都可较好地形成芽和根。但是很多资料表明 ，温度高低对器官发生的数量和质量仍有影响。如对喜温性植物如茄科、葫芦科、兰科、禾本科等的培养温度一般可控制在26-28℃比较适宜。而对于冷凉性植物如百合科、十字花科、菊科等植物则培养温度可控制在25℃以下较为适宜。 培养周期中的昼夜温差，至今，多数植物离体培养，均采用恒温培养。而国内有关小麦、水稻花药培养温度试验的报道认为：在诱导花形成愈伤组织时，昼夜恒温较好，而在器官分化时，昼夜具有一定温差比较好，分化出的小植株比较健壮。菊芋试验也有类似的报道。

186 第五章 器官发生与体细胞 胚胎发生 一．器官发生 （一）概念：离体培养的组织、细胞在诱导条件下经分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的过程。
第五章 器官发生与体细胞 胚胎发生 一．器官发生 （一）概念：离体培养的组织、细胞在诱导条件下经分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的过程。 （二）发生方式：有两种发生方式 （1）直接发生：（具有初生分生能力的）外植体直接分化成器官的过程。（由茎尖、腋芽、原球茎、块茎、鳞茎等器官发生） （2）间接发生：外植体（已分化的成熟组织）经脱分化形成愈伤组织再分化形成器官的过程。

187 二.胚状体发生(somatic embryo)
指由培养细胞诱导分化出具胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。 由外植体经胚状体形成完整植株可分三个不同发育阶段： 1)外植体细胞脱分化。外植体发生细胞分裂，或进而形成愈伤组织。这一阶段同不定芽方式一样。 2)胚状体形成 在植物有性生殖中，精于和卵子结合形成合子，合子进一步发育成胚。

188 但在组织培养条件下胚状体的发育过程是：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。 3)胚状体再发育成完整植株 在外观上，这种方式和不定芽均有光滑、圆形突起的形状。

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191 三. 胚状体与不定芽的区别 胚状体在组织学上具备以下和不定芽不同的三个特征：
①最根本的特征是具有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都为单向极性。 ②胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系。

192 ③胚状体的维管组织的分布是独立的“v”字形，而不定芽的维管组织无此现象。
胚状体也是植物组织培养形态发生最常见而重要的方式，它较不定芽方式有更多的优点：如胚状体产生伪数量比不定芽多；胚状体可制成人工种子，便于运输和保存；胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。这些对组织培养应用于育种是十分有利而重要的。

193 四. 胚状体与合子胚的比较 合子胚 胚状体 质量 萌发率高，质量好 萌发率低，质量差 来源 受精卵 体细胞 胚柄 有，明显 即使有也不明显
形态 固定，体积相对较小 复杂，常有两个以上的子叶体积相对较大 变异率 低 高

194 五.影响体细胞胚胎发生的因素 1．生长调节物质 (1)生长素类：
我们以离体培养条件下胡萝卜的体细胞胚胎发生的诱导过程来进行分析，在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一个包括两个步骤的过程，每个步骤需要一种不同的培养基。愈伤组织的建立和增殖所需要的是一种含有生长素的培养（增殖培养基），通常所用的生长素是2，4-D，浓度范围0.5—1mg/L。在这样一种培养上，愈

195 伤组织的若干部位分化形成分生细胞团，称作“胚性细胞团”。在增殖培养基上反复继代，胚性细胞团的数量不断增加，但并不出现成熟的胚。然而，如果把胚性细胞团转移到一种生长素含量很低或完全没有生长素的培养（成胚培养基）上，它们就能发育为成熟的胚。看来，在增殖培养基中生长素的存在，对于胚性细胞团后来在成胚培养基上发育为胚是必不可少的。一直保存在无生长素培养基中的愈伤组织不能形成胚。在这个意义上，可把增殖培养基看成是体细胞胚胎发生的诱导培养基，而把每个胚性细胞团看成是一个无结构的胚。

196 （2）细胞分裂素类： 细胞分裂素对于体细胞胚胎发生的作用有相反的结论，既或促进也可抑制体细胞胚的发生，这主要取决于植物的种类及其基因型。一般而言，细胞分裂素对于促进体细胞胚的成熟有显著作用，特别有利于子叶的发育。另外有研究表明，不同的外植体对于细胞分裂素的需要可能具有不同的专一性，如在胡萝卜的研究中发现，虽然BAP和激动素对胚胎发生过程表现抑制作用，但浓度为0.1μmol/L的玉米素却能促进这个过程，而BA对胡萝卜则是促进其愈伤组织的增殖，但不形成胚性愈伤组织。

197 （3）赤霉素类： 赤霉素类能抑制体细胞胚胎发生，但对于许多植物而言，赤霉素对于体细胞胚胎的成熟与萌发有促进作用。 （4）脱落酸： 抑制剂特别是ABA，在体细胞胚胎发生过程中的作用正逐渐被提示出来，ABA是一种天然产生的生长调节剂，当把无抑制作用剂量（通常是0.1~1μM）的ABA用于荷兰芹属培养物时，可以允许胚成熟过程进行。但是其抑制异常增殖，包括不定胚的启动。另一方面抑制早熟萌发。

198 2．氮源 氮源的形态有还原态氮（NH4+）和氧化态氮（NO3—）两种。在以KNO3为唯一氮源（如White培养基）的培养上建立起来的愈伤组织，去掉生长素以后不能形成胚。然而是，若在培养基中加入少量NH4Cl即可明显促进胚状体的发育，上述结论是否说明，胚胎发生过程中还原态氮是必需的？我们可以对以下的实验进行分析。

199 Reinert及基合作者在栽培胡萝卜愈伤组织培养中( 培养基均为White培养基)得到以下结果：
[NH4+—氮]（M） [NO3——氮] （M） 体胚发生数（个/2ml） ±219 ±0.3 ±4.1 从上表可以分析得出，尽管高浓度的氧化态氮同样可以诱导体细胞胚胎发生，但是其诱导率远远低于还原态氮和氧化态氮配合使用时的诱导率。

200 六. 长期培养物形态发生潜力的丧失 有些愈伤组织或悬浮培养物起初具有器官发生或胚胎发生的潜力，但经过反复继代保存之后喧种形态发生能力常常逐渐下降，有些甚至完全损失。为了解释这种现象，现在有三种假说。

201 1．遗传说 该假说认为，形态发生潜力的丧失是由于在培养细胞中的核的特性发生了改变，即细胞核内的遗传物质在培养继代过程中由于变异等原因而发生了改变或是突变。因此，可以推知，由这种原因所造成的形态发生潜力的丧失是不可逆的。

202 2．生理说 从前面体细胞胚胎发生中的甜橙的驯化组织的形成的实例中，不难分析，随着不断的培养继代的进行，培养组织或细胞中的内源激素平衡关系可能会发生改变，而导致不能形态发生。在这种情况下，细胞虽然停止了器官和胚胎的分化，但并不一定就丧失了这种分化能力。因而，在这种情况下，如果改变外部处理条件，应该有可能使细胞的这种内在潜力得到恢复。

203 3．竞争说 这个假说本质上是前两个假说的结合。按照这个假说的倡议者Smith 和Street（1974）的看法，在胡萝卜细胞长其连续继代培养基间，有两个过程可能与胚胎发生能力的下降以至最终的丧失有关。首先，细胞对于生长素（2，4-D）抑制全能性表达的作用变得比较敏感；其次，随着时间的推移，由于培养细胞在细胞学上的不稳定性，出现了缺乏胚性潜力的新的细胞系，这些细胞学上的变化不一定是染色体数目的变化，而可能只是遗传信息的小的突变、丢失或易位，实际上，Jones（1974）已经证实，在胡萝卜培养物中，细胞群体在成胚能力上的不稳定性，可能是由用于建立该培养物的组织带来的。

204 在复杂的多细胞外植体中，只有少数细胞能够产生胚性细胞团，其余细胞都是无法表达其全能性的。按照这种假说，如果非胚性的细胞类型在所用的培养基中具有生长上的选择优势，在反复的继代培养中，非胚性细胞的群体将会爱步增加，而胚性成分则逐渐减少。到了一定时期之后，在培养物中已不再含有任何胚性细胞，这时若想再恢复它们的胚胎发生能力就不可能了。然而，如果在培养物中存在少量胚性细胞，只是由于处在支配地位的非胚性细胞的抑制作用，这些胚性细胞的全能性无法表达，在这种情况下，通过改变培养基成分，使之有选择地促进全能细胞的增殖，就应当有可能恢复该培养物的形态发生潜力。

205 第六章 快速繁殖与脱毒培养 第一节 快速繁殖（微繁殖）
第六章 快速繁殖与脱毒培养 第一节 快速繁殖（微繁殖） 概念：所谓快速繁殖，就是得用组织培养的方法，使植物的部分器官、组织在人工控制的适宜条件下，迅速扩大培养，并移植到温室或农田繁殖出大量幼苗的繁殖方法。 特点：繁殖速度快；使用材料少，生产效率高，省时省工；节约空间有利于植物的工厂化生产；在无菌条件下进行，不受病虫害侵害。

206 主要适用于（1）加速某些难繁或繁殖速度低的植物，特别是一些珍稀名贵的花卉，需要发展的濒危植物的繁殖。（2）用有性繁殖的方法难以保持品种特性的异花授粉植物，如油棕、猕猴桃、非洲菊等。（3）需要去除病毒的植物。（4）原种很少，生产上又急需推广的植物 快速繁殖过程 快速繁殖过程一般包括四个阶段，即无菌培养物的建立、芽的增殖、诱导生根和试管苗的移植。

207 一．外植体的选择 选择适当的外植体对于快速繁殖能否成功是极其重要的，而选择什么样的外植体首先决定于第二阶段芽的增殖所采用的途径。
一．外植体的选择 选择适当的外植体对于快速繁殖能否成功是极其重要的，而选择什么样的外植体首先决定于第二阶段芽的增殖所采用的途径。 通过腋芽的形成来增加芽的数量时，应从带有营养芽的部分得到外植体，并注意以下问 （1）外植体大小，如为一般繁殖而非脱毒繁殖，可使用普通茎尖、芽或带芽的茎切段作为外植体。 （2）取材植株的生理状态对培养成败是极重要的，一般在植物开始生长，芽已膨大但芽鳞片还未张开时最为合适，此时芽生长旺盛，并有芽鳞片的保护，不易污染。

208 为了避免季节的影响，在有条件时也可以将植物放在光、温条件稳定的人工气候箱或温室中，使植物保持营养生长状态，对某些需低温或高温或特殊光周期处理才能打破休眠的块茎、鳞茎、球茎等，常要处理后才可剥取茎尖进行培养。 （3）芽在植物株上的部位也是需要注意的，在一些草本植物（如菊花等）中，使用顶芽或上部的芽作为分生组织或茎尖培养时的成功率常比侧芽或基部的芽要高，这可能和它们生长较旺盛有产。

209 （4）多年生的木本植物随着年龄的增加，分生组织、茎尖和芽的培养越困难，特别是成年树较幼态树的培养要困难得多，此时，常使用部分返幼阶段或年龄较低的根蘖苗或不定芽做材料，或采取某些措施如将芽接在实生苗上，修剪、保持高水平的水肥进行营养繁殖，或用细胞分裂素喷洒植株的方法等。

210 在通过不定芽途径使芽增殖时，可以根据不同的植物采用不同的外植体，如根、茎、叶或花器官的各部分，在自然界中能够产生不定芽的器官应当首先被采用，如非洲紫罗兰、秋海棠、大岩桐、落地生根等可用叶片，某些兰花等可以用茎尖；很多种植物，特别是单子叶植物，可以作用花器官，如黄花菜、鸢尾等。 在使用体细胞胚胎发生途径时，常使用胚分生组织或生殖器官作为外植体

211 二 . 芽的诱导及扩大化繁殖（增殖） 这是快繁技术中最重要性一环，在这一阶段潜在的植物体体（芽或胚状体）通过腋芽的形成和生长、外植体或愈伤组织上不定芽的形成和胚状体发生三条件途径在数量上得迅速增殖，由于外植体种类的不同，在增殖时可能采用的途径不同。

212 （1）. 促进腋芽的形成和生长 在高等植物的每一个叶腋中通常都存在着腋芽，每一个腋芽在一定的条件下都能生长并形成一个枝条，项端优势可抑制腋芽生长，使用外源的细胞分裂素可以打破顶端优势，促进腋芽生长。在培养条件下，为了促使腋芽生长，需在培养基中加入一定浓度的合适种类的细胞分裂素，有时同时可加入少量的生长素以促进腋芽的生长（注意：生长素过多易导致愈伤化）。由于细胞分裂素的持续作用，腋芽生长成枝条，新产生的枝条的腋芽在细胞分裂素的作用下又可生长，这样反复数次就可以形成一丛嫩枝，将它们切割成带有几个芽的小块接种到同样的培养基上，这一过程又能重复进行，这样就可以在短时间内产生大量的芽。

213 有些植物即使在含有细胞分裂素的培养基中其项端优势也不易被打破，接种的茎尖只能长成不分枝的一根枝条，此时可以用切段法（每个切段带有一个腋芽）加以繁殖。
用促进腋芽生长的方式进行增殖时，一般速度较其它两种方法要慢些，但每经一个流程，嫩枝就以对数速度增长，并且由于茎尖的细胞是均一的二倍体，又不易受环境条件的影响而发生变异，所以遗传的稳定性较好，适用这种方法繁殖的植物种类也较多。

214 （2）. 诱导不定芽的形成 从现存的芽之外的任何组织器官上通过器官发生行政机关后期怕芽称为不定芽。
通过不定芽形成途径进行快繁，对于很多有贮藏器官的植物如百合、风信子等是很合适的，因为这些植物在自然条件下的营养繁殖速度一般不太快，而它的鳞片、叶基部或花梗等在培养时都容易产生不定芽或小鳞茎或小球茎等不定器官，而且这一过程常可在试管中反复进行。 不定芽也可以在愈伤组织上上产生，但如果经过愈伤组织阶段，特别是多次继代的愈伤组织，不但器官发生的能力会逐渐降低以至完全丧失，而且后代的遗传性不能稳定，所以在快速繁殖中除少数作物外常不使用这种方法。对于不定芽的形成，除特殊情况外，一般都要在培养基中同时加入适当的细胞分裂素和生长素。

215 （3）．诱导胚状体的形成 在自然界只有少数植物可以通过体细胞胚胎发生而产生胚状体，但在培养条件下，现在已知有30多个科、150多种植物可以产生胚状体。诱导胚状体时一般使用胚分生组织或生殖器官的组织作为外植体。在一个含有丰富还原态氮的基本培养基，在存在生长素，特别是2，4-D时诱导胚状体的发生，然后转移到降低浓度呀没有生长素的培养基上使胚状体成熟和生长。

216 通过胚状体发生途径可以在一个委小的容器中产生比前两种增殖方法高得多的增殖速度，而且由于胚状体是两极性的可以免去诱导生根的步骤，加上它容易分散，可以减少前两种增殖方法中因分离、切割、接种所需消耗的大量人力，有利于将来实行机械化的操作。如果能够控制好胚状体发生和生长的同步性，诱导休眠和制造人工种子的技术无疑将是最理想的快速繁方法，但是目前除柑桔、枣椰、油棕和咖啡等少数作物外，

217 种方法使用并不普遍。这是因为很多重要的经济作物还不能诱导胚状体的发生或者产生的胚状体难以形成植株，或成苗率太低。另外遗传性的变异和由胚状体形成的植株的返幼（多年生植物的胚状体长成的植株和实生苗一样要经过一个幼年期才能开花结果）也是重要的障碍。

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219 三. 根的诱导 这一阶段的目的是使第二阶段通过腋芽生长和不定芽形成途径得到的嫩枝生根产生小植株，以便移栽。很多草本植物的不定根的形成是很容易的，但木本植物一般要困难些，其中从成年树得到的材料就更困难。由于生长的嫩枝本身能全盛丰富的生长素，所以一部分植物可在无激素的培养基上生根。

220 （1）．剪下无根苗转接到生根培养基中，试管苗的生根，对基本培养基的种类要求不严，如MS、B5、White等培养基，都可用于诱导生根，但是其含盐浓度要适当加以稀释。前面的几种培养基中，除White外，都富含N，P，K盐，它们都抑制根的发生。因此，应将它们降低到1／2，1／3或1／4，甚至更低的水平。生根培养基适当加大生长素的浓度，不用或少用细胞分裂素，生长素浓度在0.1-10mg/l，使用较多的是NAA，其次为IAA和IBA，生长素浓度过高时容易

221 引起愈伤组织化和抑制根的生长。培养基中蔗糖的浓度降低到1. 0-1
引起愈伤组织化和抑制根的生长。培养基中蔗糖的浓度降低到 %，以增强植株的自养能力。培养基不宜过硬以免影响生根，可在培养基中加入1%左右的活性碳，为提高小植株的光合能力，可将光强度增加到 lux，光周期可用24小时光照或16小时，8小时黑暗以利于光形成建成。

222 （2）．对较难诱导生根的植物，可先半无根苗浸泡在高浓度生长素（100mg/L）的无菌水中几小时到1天，用无菌水洗净生长素后再接种到生根培养基。对蔷薇科的果树如苹果、梨等，可在生根培养基中加入适量的根皮苷或根皮酚（间苯三酚）以促进根的形成，浓度约150 mg/L，但也发现对一种李树而PG加入后反而抑制根的形成，说明PG的刺激效应可能因基因型而不同。 （3）．嫁接到根系发达、抗逆性强的合适砧木上，如三倍体西瓜苗接到瓠子上，在25-30℃、饱和湿度条件下，三天伤口长出愈伤，一周可成活。

223 第二节 . 植物无病毒苗的培育 一、病毒在植物上的危害
病毒的危害给植物生产带来的损失是很大的，如草莓病毒的危害，使草莓产量严重降低，品质大大退化。葡萄扇叶病毒使葡萄减产l0%-18%，为害马铃薯的病虫害则更多，大约有几十种，田此，给马铃薯生产带来严重障碍。花卉病毒的危害一般会影响花卉的观赏价值，其表现是花少而小，产生畸形、变色等。

224 用组织培养方法生产无毒苗，是一个积极有效的途径，由于排除了使用药剂，所以对减少污染，防止公害，保护环境都有积极的意义。
由于病毒对植物造成如此严重的危害。所以世界各国都开始重视这方面的研究，如日本用柑桔茎尖微嫁接繁殖无病毒柑桔营养系。美国用组织培养法，使苹果无病毒苗已工厂化育苗，并在各国普遍开展。 二、无病毒苗培育的意义 用组织培养方法生产无毒苗，是一个积极有效的途径，由于排除了使用药剂，所以对减少污染，防止公害，保护环境都有积极的意义。

225 三、脱毒的方法 （一） 热处理脱毒 1．热处理法的发现及应用 热处理又称温治疗法(theomtherapy)，原理是当植物组织处于高于正常温度的环境中时，组织内部的病毒受热之后部分或全部钝化，在高温下，不能生成或生成病毒很少，而破坏却日趋严重，以致病毒含量不断降低，这样持续一段时间，病毒自行消灭，从而达到脱毒的目的。

226 (1)温汤浸渍处理 适用于休眠器官、剪下的接穗或种植的材料，在50℃左右的温水中浸渍10min至数小时，方法简便易行，但易使材料受伤。
(2)热空气处理 热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好，将生长的盆栽植株移入温热治疗室(箱)内，一般在35—40℃。处理时间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。 热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒，因此热处理需与其他方法配合应用，才可获得良好的效果。

227 （二）茎尖培养脱毒 1．茎尖培养脱毒原理 感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低，生长点(约0.1～1.0mm区域)则几乎不含或含病毒很少、这是因为分生区域内无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。在切取茎尖时越小越好，但太小则不易成活，过大又不能保证完全除去病毒。 茎尖培养脱毒，由于其脱毒效果好，后代稳定，所以是目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径。

228 茎尖培养方法 在进行脱毒培养时，由于微小的茎尖组织很难靠肉眼操作，因而需用带有适当光源的简单解剖镜(8—40倍)。除了在进行植物组织无菌培养一般工具外，还需要一套解剖刀。剥离茎尖时，应尽快接种，茎尖暴露的时间应当越短越好，以防茎尖变干。在切取外植体之前一般须对茎芽进行表面消毒。叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花，只须在75%酒精中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，则要用0.1%次氯酸钠表面消毒10min。将接处

229 好的茎尖置于22℃左右的温度下。每天以16h 2000—30001x的光照条件下培养。由于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。微茎尖需数月培养才能成功。
茎尖培养的继代培养和生根培养和一般器官的培养相同

230 （三） 其他途径脱毒 1.愈伤组织培养脱毒 通过植物的器官和组织的培养去分分诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗。 2．茎尖微体嫁接 木本植物茎尖培养难以生根成植株，将实生苗砧木在人工培养基上种植培育，再从成年无病树枝上切取0.4—1.0mm茎尖，在砧木上进行试管微体嫁接，以获得无病毒幼苗。

231 许多化学药品(包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等)对离体组织和原生质体具有脱毒效果。常用的药品有：8—氮鸟嘌呤、2—硫脲嘧啶、杀稻瘟抗菌素、放线菌素D、庆大霉素等。例如，将100μg 2—硫脲嘧啶加入培养基可除去烟草愈伤组织中的PVY(马铃薯病毒)。

232 四.病毒植物的鉴定 （一）指示植物(indmatingplant)法
利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法，就是枯斑和空斑的测定法。这种专门选用以产生局部病斑的寄主即为指示植物，又称鉴别寄主。它只能鉴定靠汁液传染的病毒。 指示植物法最早是美国的病毒学家Holmes 1929年发现的。他用感染TMV的昔通烟叶的粗汁液和少许金刚砂相混合，然后在烟叶子上摩擦2—3d后叶片止出现了局部坏死斑。在一定范围内，枯斑与侵染性病毒的浓度成正比。这

233 种方法条件简单，操作方便，故一直沿用至今，仍为一种经济而有效的鉴定方法。枯斑法不能测出病毒总的核蛋白浓度，而只能测出病毒的相对感染力。
由于病毒的寄生范围不同，所以应根据不同的病毒选择适合的指示植物。此外还要求所选择的指示植物不但一年四季都容易栽培，并且在较长的时期内还能保持对病毒的敏感性和容易接种，而且在较广的范围内具有同样的反应。指示植物一般有两种类型：一种是接种后产生系统性症状，其病毒可扩展到植物非接种部位，通常没有局部病斑；另一种是只产生局部病斑，

234 木本多年生果树植物及草莓等无性繁殖的草本植物用汁液接种法比较困难，所以通常采用嫁接接种的方法。植物作砧木，被鉴定植物作接穗，常用劈接法。
常由坏死、褪绿或环状病斑构成。 木本多年生果树植物及草莓等无性繁殖的草本植物用汁液接种法比较困难，所以通常采用嫁接接种的方法。植物作砧木，被鉴定植物作接穗，常用劈接法。 （二）抗血清(antisemm)鉴定法 用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。这种抗血清就是高度专一性的试剂，这种方法特异性高，测定速度快，一般几小时甚至几分钟就可以完成。所以抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。

235 （三）电子显微镜(elecmc microscope)检查法
由于人的眼睛难以观察小于0.1mm的微粒，而借助于普通光学显微镜也只能看到小至200bm的微粒，所以只有通过电子显微镜才能分辨0.5μm大小的病毒颗粒。这样采用电子显微镜既可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，了解病毒颗粒的大小、形状和结构，又可以鉴定病毒的种类。这是一种较为先进的方法，但需一定的设备和技术。 这一方法的优点是灵敏度高和能在植物粗提取液中定量测定病毒。

236 （四）酶联免疫鉴定法(Enzyme linked immunity absorption assay ELISA)
酶联免疫法是指采用酶标记抗原或抗体的定量测定法。将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记的抗体，使待检血清中与对应抗原的特异性抗体结合，最后用特殊分光光度计测定。此法是现在灵敏度较高和常使用的方法。

237 五． 无病毒植物的利用 一、无病毒苗的保存繁殖
无病毒植株并不是有额外的抗病性，它们有可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到无病毒苗，就应很好地隔离与保存。 二、无病毒苗的利用 无病毒苗在生产中的利用也要防止病毒的再感染。生产场所应隔离病毒感染途径，做好土壤消毒或防蚜等工作。在此种植区及种植规模小的地方，要较长时间才会感染。而在种植时间长、轮作及种植规模大的产地则在短期内就可以感染。一旦感染，便会影响产量和质量的保证。因此，应重新采用无病毒苗，以保证生产的质量。

238 三、无病毒苗的效果 无病毒苗可以表现出明显的优良效果。如草莓可增产20%—50%，植株结果多，单果重增加，上等果比例提高。菊花切花品种的脱毒株，表现出株高增加，切花数增多，花朵大，切花较重等特点。