实验室操作规范与安全 中国医科大学 Manipulation&Biosafty in biolaboratories

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1 实验室操作规范与安全 中国医科大学 Manipulation&Biosafty in biolaboratories
魏敏杰 陈 杰 阮 强 王振宁 单凤平 孟繁浩 富伟能 陈 磊 中国医科大学

2 本章主要内容 实验室规章制度 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 实验室感染事件有四种类型 实验室生物安全 生物危险度评估
生物危害程度的分级 生物安全水平分级 动物实验室的生物安全 对生物恐怖活动的防范 生物恐怖威胁的分级 A级生物武器 同位素的实验室操作规范与安全

3 Biological laboratories are special, often unique work environments that may pose identifiable infectious disease risks to persons in or near them. Infections have been contracted in the laboratory throughout the history of microbiology.

4 实验室感染事件时有发生，这主要是因为从事专职微生物研究的人员比其他工作人员有更多接触病原微生物的机会，稍有疏忽大意，就可能被试验的对象所感染。有人统计，从事病原微生物研究的工作人员传染病发生率比普通人群高5～7倍。实验室感染事件的发生有可能成为传染源，造成危害公众健康的严重后果。因此必须引起重视。

5 建立健全实验室各种规章制度（SOP)是科研工作有序进行的必要前提。 实验室规章制度一般包括：
人员规章制度，包括培训制度。 仪器使用制度。 动物使用制度。 药品使用及保管制度。 实验室环境与生物安全制度。 紧急情况下应急制度。例如：生物实验室里应备有急救药剂和用品如：创可贴，纱布，烫伤药品等。

6 生物安全制度是所有制度中的最重要的制度，为此，我国也和其他国家一样制订了本项制度。
中华人民共和国卫生行业标准《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》(WS 233—2002)  该通用准则是以美国CDC／NIH《微生物和生物医学实验室的生物安全》第四版为蓝本制定的。

7 《微生物和生物医学实验室的生物安全》基本内容
生物安全防护的基本原则、实验室的分类、分级及适用范围、一般生物安全防护实验室的基本要求、实验脊椎动物生物安全防护实验室、生物危险标志及使用、新建三级和四级生物安全防护实验室的验收和现有生物安全防护实验室的检测、现有三级和四级生物安全实验室的使用和维护、附录A安全操作规程、附录B二级生物安全柜的现场检测、附录C各国的微生物与生物安全防护实验室适用级别表等。

8 典型案例 安徽患者宋某和北京患者杨某曾同在中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所形态实验室工作，专家初步判定，此次疫情可能源于实验室工作人员感染。， 在新加坡的2003年9月，一名27岁的实验室研究者感染沙斯。 在同年的12月，一位44岁的台湾军事科学家也在实验室感染沙斯。幸好，这都是少数的沙斯个案。

9 美国一实验室感染黑死病的三只实验鼠下落不明, 这三只老鼠是供新泽西医学与牙科大学校园里的公共卫生研究院为联邦政府进行生物反恐研究用的，黑死病的一种症状，就是患者的皮肤上会出许多黑斑，所以这种特殊的瘟疫被人们叫做“黑死病”。对于那些感染上该病的患者来说，痛苦 ... 在1348年--1350年间，总共有2500万欧洲人死于黑死病.

10 气溶胶(aerosol) 指固体或＼和液体微粒稳定地悬浮于气体介质中形成的分散体系。其中的气体介质称为连续相，通常为空气；微粒(particles)称为分散相

11 实验室感染事件有四种类型 第一种是事故性感染，一般是因为试验人员操作过程中的疏忽，使本来接触不到的微生物污染环境，直接或间接感染实验人员。1956年前苏联的一个实验室中，有9支装有委内瑞拉马脑炎病毒鼠脑的安瓿被打破。事后没能很好地进行处理及采取必要的措施，也未进行彻底消毒，结果在几天内造成24名工作人员感染。

12 第二种是实验室动物引起的感染，是由于实验人员接触了被微生物感染的实验动物导致的感染。例如在2009年我国沈阳的某高校在使用大白鼠进行试验时，有两名学生被大白鼠咬伤，还有一些学生给实验的老鼠放血、解剖。在实验过程中，这些学生均未按照要求戴手套操作，结果在29名实验人员中造成9人感染了流行性出血热。

13 第三种类型是气溶胶导致的感染，是由于实验室中的病原微生物以气溶胶的形式飘散在空气中，人呼吸了这种空气造成的感染。最严重的一次实验室气溶胶感染事故是1961年在莫斯科的一家研究所发生的。他们的实验人员从流行性出血热疫区捕捉到一些野鼠带回实验室，由于疏忽而把这些野鼠放在了室内暴露的场所。过了不久，该实验室中有63人出现发热的症状，开始被误诊为流感，1周内又增加了30人，才开始怀疑到是流行性出血热。本次事故被认为是野鼠身上带有的出血热病毒以气溶胶的形式污染了空气所致。

14 第四种类型是人为破坏，生物武器可以说是一种人为的实验室感染。日本侵华战争时期的731细菌部队在中国犯下了制造实验室感染和细菌武器的滔天罪行。2001年以来在美国境内屡屡制造炭疽的恐慌事件，造成几十人染病，数人死亡，美国白宫和国会先后成为被袭击的目标。现已有证据表明，该事件是来自美国军队的生化实验室。

15 实验室生物安全 一、生物危害评估 当实验室活动涉及传染或潜在传染性生物因子时，应进行危害程度评估。危害程度评估应由适当的有经验的专业人员进行。

16 危害程度评估所涉及的内容： 生物因子的种类（已知的、未知的、基因修饰的或未知传染性的生物材料）、来源、传染性、致病性、传播途径、在环境中的稳定性、感染剂量、浓度、动物实验数据、预防和治疗。

17 2. 生物危险度评估 1）微生物的致病性和感染数量 2）暴露的潜在后果 3）自然感染途径 4）实验室操作所致的其他感染途径（非消化
道途径、空气传播、食入） 5）微生物在环境中的稳定性

18 生物危险度评估 6）所操作微生物的浓度和浓缩标本的容量 7）适宜宿主（人或动物）的存在 8）从动物研究和实验室感染报告或临床报告中得到
的信息 9）计划进行的实验室操作（如超声处理、气溶胶化、 离心等） 10）可能会扩大微生物的宿主范围或改变微生物对 于已知有效治疗方案敏感性的所有基因技术 11）当地是否能进行有效的预防或治疗干预。

19 二、生物危害程度的分级 根据对个体和群体的危害性分四级： Ⅰ级：指危害性最低的病毒、细菌、真菌和寄生虫等生物因子； Ⅱ级：指中等危害的生物因子，多为条件致病菌或机会致病菌； Ⅲ级：指能引起个体的严重感染，但不易在人群中传播扩散的生物因子；可用抗生素治疗 Ⅳ级：指能引起个体和群体严重感染，难治疗

20 四级操作规范 除下列修改以外，应采用三级生物安全水平的操作规范：
实行双人工作制，任何情况下严禁任何人单独在实验室内工作。这一点在防护服型四级生物安全水平实验室中工作时尤其重要。 在进入实验室之前以及离开实验室时，要求更换全部衣服和鞋子。 工作人员要接受人员受伤或疾病状态下紧急撤离程序的培训。 在四级生物安全水平的最高防护实验室中的工作人员与实验室外面的支持人员之间，必须建立常规情况和紧急情况下的联系方法。

21 三、生物安全水平分级及相应的实验设备要求
生物安全水平(biosafety level, BSL)分级： 1. BSL-1 实验室：基础实验室。 无特殊要求 2. BSL-2 实验室：基础实验室。 配备高压灭菌设备，着专用工作服，带乳胶手套，生物安全柜(A2级)内操作

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29 B2 型生物安全柜

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31 3. BSL-3 实验室：高度安全实验室 选址：建筑物中可隔离的区域或独立建筑物 分布：清洁区、半污染区、污染区，各区之 间设缓冲区
通风：独立的负压通风保护系统， 气流方向：清洁区→半污染区→污染区 安全柜：B2级

32 4. BSL-4 实验室：最(高度)安全实验室 选址：远离人口密集区，独立建筑，周围有 密封的安全隔离带 着装：正压防护服
安全柜： Ⅲ型(全密封型)

33 III级BSC

34 正压防护服

35 四、个人生物安全防护装备 实验室防护服 面部防护：安全护目镜、面罩 手套：乳胶手套 呼吸防护：口罩

36 五、安全工作行为 1. 有相应的危害分级标准和与之相应的实验室条件； 2. 对工作人员进行生物安全知识培训；
3. 制定相关的实验室安全管理条例和操作细则； 4. 实验操作时要遵守操作规程，如有危险样品泄漏，应立即报告，及时处理。

37 六、动物实验室的生物安全 动物实验室的生物安全防护设施应参照BSL-1~BSL-4实验室的相应要求,还应考虑对动物呼吸、排泄、毛发、抓咬、挣扎、逃逸、动物实验(如染毒、医学检查、取样、解剖、检验等人动物饲养、动物尸体及排泄物的处置等过程产生的潜在生物危害的防护。应特别注意对动物源性气溶胶的防护,例如对感染动物的剖检应在负压剖检台上进行。

38 动物实验室的生物安全 应根据动物的种类、身体大小、生活习性、实验目的等选择具适当防护水平专用于动物并符合国家相关标准的生物安全柜、动物饲养设施、动物实验设施、消毒设施和清洗设施等。 实验室建筑应确保实验动物不能逃逸,非实验室动物(如野鼠、昆虫等)不能进入。实验室设计(如空间、迸出通道等)应符合所用动物的需要。

39 操作技术规范 实验室中标本的安全操作 移液管和移液辅助器的使用 避免感染性物质的扩散 生物安全柜的使用
避免感染性物质的食入以及与皮肤和眼睛的接触 避免感染性物质的注入 血清的分离 离心机的使用

40 操作技术规范 匀浆器、摇床、搅拌器和超声处理器的使用 组织研磨器的使用 冰箱与冰柜的维护和使用 装有冻干感染性物质安瓿的开启
装有感染性物质安瓿的储存对血液和其他体液、组织及排泄物的标准防护方法 对可能含有朊蛋白物质的防护

41 对生物恐怖活动的防范 一、生物恐怖威胁的分级 按美国CDC的标准分三级： A 级：最大危害 B 级：中等危害 C 级：最低危害

42 (一) 炭疽芽胞杆菌 二、A级生物武器及其防范 1. 来源：气溶胶 2. 所致疾病：炭疽病(人畜共患)
肺炭疽(出血性肺炎):发热、头痛、胸痛、 咳嗽，无卡他症状 肠炭疽(出血性肠炎)：恶心、呕吐、发热、血便、腹痛 皮肤炭疽(黑炭状坏死)：丘疹、水泡、溃疡、发黑 3. 应急措施：立即离开气溶胶污染区，带口罩 4. 预防：注射炭疽减毒疫苗 5. 治疗：及早使用环丙沙星，强力霉素

43 (二) 鼠疫耶氏菌(Yersinia pestis)
1. 来源：气溶胶 2. 所致疾病：鼠疫(人畜共患) 腺鼠疫 (淋巴节炎)：人蚤 肺鼠疫 (黑死病)：发热、干咳、胸痛 败血症鼠疫：源于腺鼠疫或肺鼠疫 3. 应急措施： 不要进入疫区；带口罩 4. 预防：灭鼠、灭蚤 5. 治疗：早期足量氨基糖苷类抗生素。

44 (三) 出血热病毒 1. 来源：气溶胶 2. 所致疾病：出血热
临床表现：高热、头痛、咽痛、出血、肾脏损害和免疫功能紊乱为主，三红(面、颈、上胸部潮红)、三疼(头痛、眼眶痛、腰痛),五期(发热、低血压、少尿、多尿、恢复期)病死率高。 3. 治疗：无特异性治疗，严禁使用阿斯匹林类药物

45 (四) 天花病毒

46 (五) 兔热病 1. 来源：气溶胶 2. 病原菌：土拉弗朗西斯菌(Francisella) 3. 临床表现：肺兔热病表现为突然发热，头痛、
肌痛、咽痛、干咳；伤寒型为腹痛、 腹泻 4. 治疗：早期足量氨基糖苷类抗生素及环丙沙星、氧氟沙星等。

47 (六) T2毒枝菌素(T2毒素) 来源：镰刀菌属的真菌产生的毒素，可制成各种 剂型 2. 吸收途径：呼吸道、消化道粘膜；皮肤
3. 作用机理：阻断DNA的合成与转录 4. 临床表现： 不同吸收途径局部临床表现 不同； 而后出现的全身症状 为肌无力、头 晕、共济失调、低血压休克。24小 时内死亡。

48 人员应考虑生物安全因素 生物安全和重组DNA技术 生物表达系统的生物安全考虑 表达载体的生物安全考虑
用于基因转移的病毒载体 转基因动物和“基因敲除”动物 转基因植物 遗传修饰生物体的危险度评估 进一步的考虑

49 也要考虑： 意外事故应对方案和应急程序 意外事故应对方案 微生物实验室应急程序

50 实验室材料的清洁 化学杀菌剂 清除局部环境的污染 清除生物安全柜的污染 洗手／清除手部污染 热力消毒和灭菌 焚烧 废弃物处理 感染性物质的运输 国际运输规定 基本的三层包装系统 溢出清除程序

51 危害性化学品 暴露途径 化学品的储存 关于不相容化学品的一般原则 化学品的毒性作用 爆炸性化学品 化学品溢出 压缩气体和液化气

52 同位素的实验室操作规范与安全 ---同位素管理条例
放射性物质及辐射技术已经广泛应用于医疗卫生、教学科研和工农业等领域，由于放射物对人身和环境存在一定的危险性，因此，必须进行科学管理，否则就会给社会带来危害，给操作者和公众的身体健康带来损害，甚至造成社会恐慌。

53 遗传与发育所同位素管理条例 第一条 根据《中华人民共和国放射性污染防治法》，《放射形同位素与射线装置安全和防护条例》，为保证放射性同位素使用的安全，制定本条例。 第二条 管理机构 一．设立以各单位主管领导负责的“放射性同位素安全管理工作委员会”，委员会包括相关部门人员和专职管理员组成。“放射性同位素安全管理工作委员会”组成人员按要求报当地环保局、卫生局、公安局备案。

54 二．放射性同位素安全管理工作委员会负责整个单位同位素管理条例、操作规程和应急预案的制定和修改。
三．放射性同位素安全管理工作委员会负责监督整个单位放射性同位素管理条例的实施。对实施中出现的问题提出建议供所领导决策参考。

55 四．放射性同位素专职管理员负责放射性同位素许可证申报、审验、变更、同位素转入、转出协议的办理等手续。负责与当地环保局、卫生局、公安局等主管放射性工作部门的协调工作，确保同位素使用符合法律规定。

56 第三条 放射性工作场所 一、设立符合《防治法》规定的放射性工作场所。 二、放射性工作场所配备必要的防护设备、检测设备、 个人防护用具。
三、放射性工作场所标有国家规定的警示标志。 四、放射性工作场所设有专人管理，建立严格的使用 登记制度。 五、严禁在普通实验室内存储和进行同位素操作。

57 第四条 放射性同位素使用 一、使用核素种类严格控制在环保部门审批的辐射安全许可范围以内，专职管理员按法规要求统一与有经营资质的经销商签定转入、转出协议并报上级主管部门批准、备案后方可转入。 二、因科研需要使用许可证范围以外核素时，课题组应提前三个月报专职管理员, 专职管理员办理许可证增项手续，新增核素必须经上级相关部门批准后方可购买和使用。

58 三、课题组购买含有放射源设备时必须提前报专职管理员，并提供设备放射源部分的技术资料，以便办理含源设备审批手续。
四、建立完整的放射性同位素台帐制度。 五、严格执行放射性同位素操作程序和应急预案。

59 第五条 培 训 一、同位素操作人员必须经过培训上岗。放射性同位素安全管理工作委员会与人力资源处定期组织培训，培训分外部培训和内部培训。
第五条 培 训 一、同位素操作人员必须经过培训上岗。放射性同位素安全管理工作委员会与人力资源处定期组织培训，培训分外部培训和内部培训。 1．外部培训是请市相关资质部门依法组织的培训。 2．内部培训是定期组织同位素使用人员学习国家相关放射性管理的法律法规、组织学习各单位制定的放射性管理规章制度、请有经验的老师讲解和指导同位素正确使用，达到即安全使用又消除不必要的恐怖心理。 二、导师有责任教育学生遵守本单位有关同位素管理的规章制度，对放射性同位素的使用中安全防护、规范操作、专业知识、人身安全、环境安全进行指导。

60 第六条 建立场所监测、个人计量检测、健康 体检制度 一、定期组织相关人员对操作场所、废弃物仓库进 行检测，并保留检测记录。
二、按法规要求为长期同位素操作人员办理个人剂 量计，监控个人剂量的辐射情况并建立个人档案。 三、按法规要求定期组织同位素操作人员进行体检， 体检结果纳入个人放射性同位素健康档案。 四、个人计量、健康档案长期保存。

61 第七条．放射性废弃物的管理 一、设有符合标准的同位素废品储存仓库。 二、每个同位素操作场所设有临时废弃物（液体、
固体）存储装置，装置成满后在确保安全的情 况下运输到同位素废品仓库集中存储。 三、同位素废弃物定期由环保部门检测，按国家有关标准处理放射性废弃物。

62 第八条．违反本条例的处罚 对违反本条例的人员，管理人员应及时提出批评教育并限期整改。不服从管理的，管理人员将通知其课题组导师进行批评教育，并视情况报本单位放射性同位素安全工作管理委员会做出相应的处罚。

63 同位素操作的实验防护 以下物品不得带入实验室或在实验室中使用： 食物和饮料 任何香烟类物品 手提包 脣膏等一切化妆品 食用器皿
离开控制区必须彻底清洁双手，尤其注意指甲、 手指间和手指的边缘部分。

64 离开控制区必须用检测仪彻底检测手部、鞋子和衣服。
任何开封或者没有开封的放射源不得用手直接拿取。 放射源必须放置在具有遮挡射线功能的器皿或容器 中，该容器最好要有手柄，且开合要简单易操作，放射 源在不同区域的安全可检测剂量必须满足以下规定： 在控制区内<10µSV/h 在缓冲区内<3µSV/h 在普通公共区域内<0.1µSV/h

65 实验操作要在多层防护下进行，以避免放射源滴落在
实验台面上。可以在桌面上放置铁托盘，在托盘上铺 一层吸水性强的纸巾。该吸水纸要在实验完毕后及时 更换和处理掉。实验用的小仪器和工具都要放在如上 所述的托盘上，吸管等要接触放射源的物件不得直接 放在桌面和凳子上。 在同位素实验室内任何操作都不能直接用嘴进行，需 要用到嘴来操作的仪器不得在该实验室内使用。

66 皮肤上有伤口（无论是否包扎）的人员不得进入
该实验室。 实验室中不得使用边缘有坏损、容易割伤皮肤的 容器和玻璃器皿 在该实验室使用的标签必须是自带粘性的，需要 使用水或者胶水才能黏贴的标签不得使用 即使所操作的放射源放射剂量很小，进入控制区 的人员也必须穿戴防护实验服、鞋套、手套。

67 进入实验室必须穿戴橡胶手套，但必须明确橡胶
手套仅能阻止皮肤直接接触放射源，并不能够阻 隔射线。 不得直接戴着手套去触碰日光灯管、开关、门把 手等公共用品，以防止沾污，如需碰触请垫上一 层干净的纸巾。这些物品日后需要找专业人员来 修理和更换，请尊重这些人员的生命安全！ 任何冲洗被沾污物件的废水不得直接倒入下水 道，应用容器盛好倒入专门的废液桶。

68 穿戴手套时要注意，外面是沾污面，里面是干
净面，切记不要用外面触碰到里面干净的部分。 如果放射性沾污可能出现在空气、蒸汽、扬尘 和烟雾中时，操作必须在手套操作箱或者是通 风厨中进行。 实验设计优先考虑过程干燥的实验操作。 不要经常移动实验室内的物件。 若不小心溅落放射源，必须立即清理，以防止 干燥过程放射源进入空气。

69 排泄物、身体组织等的储存必须放置在专门的容器
中。 装有标记同位素动物的箱笼必须在显眼的位置做好 警示标记和详细标注：同位素类型、放射性活度、 使用时间。 不允许实验动物、器皿、箱笼在放射性和非放射性 实验室间流动。 实验过程要尽量防止被标记后的动物咬伤，同时要 注意由于动物的移动和咳嗽造成的空气污染。 必须考虑到寄生虫等潜在的污染扩散因素。