名以清修 利以义制 绩以勤勉 汇通天下 新晋商理念 李安平

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1 名以清修 利以义制 绩以勤勉 汇通天下 新晋商理念 李安平
名以清修 利以义制 绩以勤勉 汇通天下 新晋商理念。从97年开始振东就一直以名以清修、利以义制、绩以勤勉、汇通天下来奋斗。我们要让我们的产品汇通天下。 李安平

2 中国药典2010年版 药品微生物实验室规范指导原则
李 英

3 内容 A 微生物实验室规范管理的目的与意义 B 管理内容：人、机、料、法、环 C 培养基 D 菌种

4 微生物实验室管理的目的与意义 目的：用于指导药品微生物检验实验室的质量控制。
意义：药品微生物的检验结果受很多因素的影响，如样品中微生物可能分布不均匀、微生物检验方法的误差较大等。因此，在药品微生物检验中，为保证检验结果的可靠性，必须使用经验证的检测方法并严格按照药品微生物实验室规范要求进行试验。避免因试验条件不规范，造成误差及危害。

5 微生物实验室管理的内容 微生物实验室管理 环 法 人 料 机

6 人：人员管理-基本步骤 相关法律要求 再培训 上岗培训 考核、上岗

7 人：人员管理-人员要求 《中国药典》2010年版要求 ： — —微生物实验人员应具备微生物专业知识。
CNAS-CL09《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明》第5.2.1节要求： — —实验室使用人员时，应考虑以下条件 a) 有颜色视觉障碍的人员不能执行某些涉及到辨色的试验。 b) 实验室人员应熟悉生物检测安全操作知识和消毒知识。 c) 实验室应对在培人员实施有效监督。 d) 实验室应对新员工进行检测技能的培训，对新员工的检测 技能进行确认。

8 人：人员管理-人员培训 硬件培训 生物安全操作知识和消毒知识；卫生要求（包括个人卫生和人物进入洁净区应遵循的消毒、灭菌、洗手、更衣及着装等）；洁净室的使用、保洁、洁净度检测培训；设施、仪器及设备的使用等。 软件培训 实验室的质量目标、体系文件、计量知识、法律法规、质量标准的查找与使用；企业内部制定的各种SOP的书写与掌握等。 技能培训 无菌操作技能；培养基配置；灭菌及验证；菌种的转种、传代、保管；无菌检验法及微生物限度检查法。 再培训 制定继续教育计划。

9 人：人员管理-人员考核 上岗与再培训 考核 根据培训内容进行相关知识（笔试）与实验技能的考核。 上岗 考核合格后方可持证上岗。
人：人员管理-人员考核 上岗与再培训 考核 根据培训内容进行相关知识（笔试）与实验技能的考核。 上岗 考核合格后方可持证上岗。 再培训 根据需要进行再培训。 注：所有人员的培训、考核内容和结果均应记录归档。

10 机：仪器设备管理-总体要求 实验室应配备与检验能力和工作量相适应的仪器设备，某种类和型号、测量范围和准确度等应满足检验的要求，设备的安装和布局应便于操作，易于维护、清洁和校准。

11 机：仪器设备管理-种类 保证实验环境设备：隔离系统、净化工作台、生物安全柜。 灭菌设备：高压蒸汽灭菌器、电热恒温干燥箱。
微生物生长和保存设备：培养箱、冰箱、超低温冰箱等。 菌种鉴定设备：全自动生化分析仪，全自动病原微生物快速检测系统，PCR仪等。 常用仪器：电动匀浆仪、电热恒温震荡器、离心机、集菌仪、薄膜过滤装置、显微镜等 常用实验物品：试管、三角烧杯、刻度吸管、培养皿及移液抢等。

12 机：仪器设备管理-基本要求 清单化管理：将实验室所有仪器设备列出清单，并编好内部唯一性编号及指定保管人，及时更新清单；
标识化管理：每台设备上均贴有标识，包括内部编号、生产厂家、型号、状态等，若需定期校验，还需贴校验标识； 建立每台仪器设备的SOP； 建立使用等级制度、记录。

13 机：仪器设备管理-基本要求 仪器设备的分类管理 无需校验的设备
如：真空泵、集菌仪、振荡器、旋涡混匀器、离心机、光学显微镜、搅拌器、手动菌落计数器等； 上述仪器确认运转正常并贴好状态标识即可。

14 机：仪器设备管理-基本要求 需要定期校验的仪器、设备
如天平/砝码、温湿度计、压力仪表、灭菌锅、尘埃粒子计数器、浮游菌采样器、生物安全柜、层流超净工作台、水浴恒温箱、培养箱等，制定校验计划与校验周期。 此项中可再分类，如法规强制检定类、内部校准类等。

15 机：仪器设备管理-基本要求 需性能验证或连续监控的设备 温控设备，如培养箱、冷藏冰箱、冷冻冰箱等 高压灭菌锅、电热恒温干燥箱
自动菌落计数器及微生物自动鉴别系统等。

16 机：仪器设备管理-基本要求 关键仪器设备 重要的仪器设备，应由专人负责，保证其运行状态正常和受控，同时实验室应有相应的备用设备以保证试验菌株和微生物培养等实验过程的连续性。 培养箱、冰箱、高压灭菌锅等影响实验准确性的关键设备应在其运行过程中对关键参数（如温度、压力）进行连续观测和记录，有条件的情况下尽量使用自动记录装置。如果发生偏差，应评估对以前的检测结果造成的影响并采取必要的纠正措施。

17 料：重要耗材的管理-基本步骤 采购 销毁 存储 使用

18 料：重要耗材的管理-耗材种类 药品微生物实验室，除培养基作为最重要的消耗性材料外，重要的还包括： 1）集菌培养器 2）滤膜 3）试剂
4）生物指示剂

19 料：重要耗材的管理-耗材采购 对重要的耗材应由实验室选择质量稳定、信誉好的生产厂商供应，标准品作为计量物质应由权威法定机构提供；
建立该类耗材的合格供应商名录及采购记录，以便于质量追溯。 选择新的耗材供应商或变更耗材时，需要进行验证，以评价变更对检验结果的影响。 如用于微生物限度检查的滤膜，变更时应确认对试验菌的回收率； 建立耗材进货验收制度，必要时定期对耗材生产厂商进行质量审计。

20 料：重要耗材的管理-存储与使用 应严格按产品说明书的要求进行储放，以防止失效或受到污染；
建立领用登记制度，由管理员按先进先出的原则发放使用，详细记录品名、规格、批（编）号、来源、数量、购进日期、领用数量、领用日期、结余等信息； 定期对某些消耗品进行抽样检查，以确认是否符合要求。

21 料：重要耗材的管理-耗材的销毁 对过期或使用完毕的耗材，都应及时销毁，以防止其被误用或污染环境； 做好销毁记录。

22 法：文件与记录管理-要求与内容 内容： 人员培训与资格确认 设备验收、检定/校准期间核查与维修 设备的关键参数和使用记录
培养基制备、储存与质量控制 检验规程的关键步骤 数据记录与结果计算的确认 质量责任人对试验报告的评估 数据偏高的调查

23 法：文件与记录管理-要求与内容 微生物实验室的文件通常可分为以下两大类：
1、管理制度：微生物实验室人员工作规范、实验人员上岗资格考核要求、各岗位职责说明书、无菌检查与微生物限度检查等洁净室的管理制度、实验室安全、菌种管理、仪器设备管理、实验用品的清洁、消毒规范、偏差管理、变更管理及文件与记录管理等。 2、操作规程：主要仪器/设备的使用操作、样品取样、检验方法、洁净区的环境监控方案、阳性标本及污染物的处理、微生物的鉴别等。

24 法：文件与记录管理-记录的基本要求 所有记录均应符合GMP/GLP的原则要求，具体有以下几点：
1、使用受控的表格/纸张，而不得将数据或结果记录于私人笔记本及其它散页的非受控纸张上； 2、确保原始数据记录的真实性，做到及时、准确； 3、原始记录上要有实验者的签名和日期； 4、数字后需要单位表示的，应明晰附有实验室内通用的计量单位（如CFU/ml）； 5、日期与时间，与所做的实验相一致，并不得更改；培养时间需指明培养的起始时间和结束时间； 6、记录与实验相关的其他基本信息，如供试品制备、培养基配制等。

25 法：文件与记录管理-记录的内容 编号、实验日期、实验材料、操作程序、实验结果、误差、实验相关的因素（使用的设备、菌种、培养基）、检验依据、实验人员签名、复核人签名、管理人员签名等。

26 环：实验室的设施与环境管理 法规要求 功能区域划分 洁净室布局与环境要求 隔离器技术 无菌取样环境要求

27 环：实验室的设施与环境管理 法规要求 《中国药典》2010年版
实验室应具有进行微生物检测所需的适宜、充分的设施条件。实验室的布局与设计应充分考虑到良好微生物实验室操作规范和实验室安全的要求。实验宣布局设计的基本原则是既要最大可能防止微生物的污染，又要防止检验过程对环境和人员造成危害。合适的规划及活动区域的合理区分将提高微生物实验操作的可靠性。

28 环：实验室的设施与环境管理-功能区域划分
开展无菌检查的洁净室或隔离器室（区） 开展微生物限度检查的洁净室（区） 开展菌种处理、微生物鉴别试验的生物安全试验室（阳性菌室） 无菌取样室 培养室 普通试验室（用于点计，镜检等）

29 环：实验室的设施与环境管理-功能区域划分
培养基及试剂配置室 样品接收/储放区 污染物存放与处理区 器皿清洗、烘干室 灭菌室（区） 办公室（区） 实验消耗品、器材储藏室。

30 环：实验室的设施与环境管理-功能区域要求
总体要求 各功能区域应明确标识，特别是菌种储藏区、污染物处理区、阳性菌室等存在生物安全危害的区域。

31 环：实验室的设施与环境管理-功能区域要求
洁净室要求 洁净室作为药品微生物实验室的核心区域，应远离交通干道、厕所及污染区，应选上、下水道及其他安装适宜的位置。 洁净室与配套功能区，包括清洗、培养基配制、消毒/灭菌、灭菌物品存放和传输、培养区域、结果观察、试验菌实验和办公室等，要集中，减少污染，便于管理和使用。 洁净区

32 环：实验室的设施与环境管理-功能区域要求
实验室应建立洁净室（区）和隔离系统的验证、使用和清洁维护标准操作规程，对可能影响检测结果的工作（如洁净度验证及检测、消毒、清洁维护等）能够有效地控制、监测并记录。实验室对所用的消毒剂应进行效力验证并定期更换，消毒剂在使用前应尽可能使用0.22µm的无菌滤膜进行除菌过滤。

33 环：实验室的设施与环境管理-功能区域要求
无菌取样的环境 无菌取样应在无菌实验室内进行，特别是采用无菌生产的产品。应有非常严格的无菌防护措施，避免在抽样过程中造成微生物的污染。 如果可能，所有的样品包括非灭菌药品均应在具有无菌条件的特定抽样间进行无菌抽样。

34 环：实验室的设施与环境管理-功能区域要求
无菌洁净室的运行 建立使用登记制度 按洁净室管理规范的要求建立SOP（开启运行、人员进入程序、日常监测、UV灯与过滤器定期更换等） 定期再验证管理与环境监测计划

35 环：实验室的设施与环境管理-功能区域要求
环境的情节、消毒 所用清洁、消毒剂的种类和使用规定 规定清洁、消毒的频次、方法；（每次试验/或每日、每周、每月等） 建立清洁、消毒记录； 实验室对所用的消毒剂种类应定期更换，使用的消毒剂应无菌。

36 培养基

37 内容 A 定义及重要性 B 主要成分及作用 C 分类 D 质量控制 E 注意事项

38 定义及其重要性 定义 培养基是人工配制的生物营养物质，即用人工方法将多种物质按各种微生物生长繁殖的需要配制成的一种混合营养物，用于细菌培养分离鉴定研究和保存。目前已使用的各种培养基都是前人经过反复实践，比较设计的成果。 重要性 培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证。

39 培养基主要成分及作用 培养基 凝固物 生长因子 氮源 水 无机盐 碳源

40 培养基的分类 分类 按物理性质分 按用途分 液体 基础 流体 选择 增菌 固体 鉴别 半固体

41 培养基的质量控制 灭菌 配制 适用性 1 2 3 溶解 PH 温度 时间 无菌性检查 性能试验

42 培养基的配制 溶解：一般应使用玻璃器皿或搪瓷器皿配置培养基。采用商品脱水培养基时应按照说明书进行精密称量，用量筒加入蒸馏水或去离子水，用玻璃棒搅拌均匀，需加热时应不停搅拌，亦可防止干粉成团不好溶解，另外还可防止糊锅。有琼脂的培养基应煮开后再微火煮几分钟，使琼脂完全融化。采用化学试剂配制培养基时，应按中国药典规定的处方配制，使用的化学试剂均需用CP规格的，除糖类及指示剂外，处方中的各成份应先煮开溶解，再加入糖类及指示剂。

43 培养基的配制 校正PH值：培养基配制后均需进行PH值校正，可用稀盐酸或稀碱液加以校正。一般采用1mol/L的氢氧化钠溶液校正弱碱性培养基。灭菌前培养基的PH值可比最终PH值调高0.2左右，灭菌后基本合适。校正PH值时应注意要慢慢滴加稀酸或稀碱，边加边测，最好不要用酸碱来回校正。

44 培养基的配制 培养基的分装：液体、半固体培养基约装试管容积的1/3。固体培养基一般分装在250ml或500ml的三角瓶中，高度不能超过瓶高的1/2，灭菌后可根据需要分装平板或斜面，平板约装15～ 20ml，斜面约占容积的1/5（低层）或1/3（高层）。 培养基的灭菌：采用商品脱水培养基应按照说明书的要求进行灭菌，按处方配制的培养基应按照中国药典的要求进行灭菌。通常消毒培养基的温度为121℃，灭菌时间一般为15分钟，但含牛奶、血清的培养基可适当降低灭菌温度及时间。

45 培养基的灭菌 灭菌验证： 在线验证： 生物指示剂：嗜热脂肪芽孢杆菌 培养基：含澳甲酚紫葡萄糖胨液体培养基
方法：取含有生物指示剂的滤纸不少于5片，分别放在平皿中，再用牛皮纸将平皿包扎严，随消毒物品分别放上、中层各一片，下层的前、中、后各一片，灭菌完毕后，随消毒物品取出，以无菌操作将消毒后的菌片加置含澳甲酚紫葡萄糖胨液体培养基中，55～ 60℃培养5天，逐天观察结果，如未长菌，判定本批物品消毒合格。如有菌生长，培养基的颜色由紫色变为黄色。

46 含澳甲酚紫葡萄糖胨液体培养基 蛋白胨：10.0g 牛肉浸膏：3.0g 氯化钠：5.0g 葡萄糖：5.0g
0.04%澳甲酚紫水溶液：25.0ml 水：1000ml PH：7.2±0.1 消毒温度：121℃ 15分钟

47 培养基的灭菌 过滤除菌：可以除去溶液或液体培养基中直径大于过滤膜网孔直径的微粒、微生物和病毒。与高压蒸气灭菌法相比，该法不会改变那些在高压蒸气灭菌中不稳定物质，但是也有些明显的缺点，如复杂而费时。通常采用0.22~0.45μm孔径的醋酸纤维素或硝酸纤维素膜筛。对培养基中的不稳定成分进行过滤灭菌时，首先对除不稳定成分以外的培养基进行高温高压灭菌，灭菌后放置于超净工作台中冷却，温度降到40~50℃时，在琼脂培养基尚未固化之前，在无菌条件下用注射器和无菌微孔滤膜（图1.7）将高温不稳定物质溶液打入培养基。

48 培养基的储存 培养基的储存：商品脱水培养基应避光储存于25 ℃以下阴凉干燥处；制备好的培养基应保存在2-25 ℃避光环境，有条件置4 ℃冰箱冷藏储存更好，非密闭容器配制的培养基应在三周内使用，若密闭容器配制的培养基则可保存一年。

49 培养基适用性检查 微生物限度 计数 控制菌 对照培养基 对照培养基 促生长力 检查用菌 抑制能力 结果计算 指示能力

50 培养基适用性检查 无菌检查 无菌性 灵敏性 培养基 检查用菌 培养基温度 菌液制备 培养基时间 检查方法 结果判断 结果判断

51 培养基注意事项 使用 制备 贮藏 水化 溶解 PH 灭菌 保温 液体培养基 固体培养基 (平板 斜面） 干粉培养基 配制好的 培养基 1 2
3 水化 溶解 PH 灭菌 保温 液体培养基 固体培养基 (平板 斜面） 干粉培养基 配制好的 培养基

52 菌种

53 内容 A 菌种保藏的概念 B 菌种保藏和使用的法规 C 常用菌种保藏方法 D 常用菌种管理和保存

54 基本概念-名词解释 标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。
标准储备菌株：由标准菌株经一次传代得到的培养物。 商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株。 代：将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养，并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式，新培养物对接种培养物而言称为一代。 工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物。

55 菌种复活传代示意图 0代 代 代 代

56 基本概念 菌种保藏机构 目前，世界上约有550个菌种保藏机构。 国外的菌种保藏机构 国外的菌种保藏联合会（WFCC）
美国菌种保藏中心（ATCC） 美国农业部“北部地区研究实验室”（NRRL） 英国“国立标准菌种收藏所”（NCTC） 英国“国际真菌研究所”（ CMI） 荷兰“真菌中心保藏所”(CBS) 日本微生物菌种保藏联合会（JFCC）

57 菌种保藏机构 我国的菌种保藏机构 普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC） 农业微生物菌种保藏管理中心（ACC）
工业微生物菌种保藏管理中心（CICC） 医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC） 抗菌素菌种保藏管理中心（CACC） 兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC） 林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC） 专利微生物菌种保藏管理中心

58 菌种保藏和使用的法规 中国药典2010年版 实验室认可准则 其他行业标准

59 菌种保藏和使用的法规 中国药典2010年版 —在新增的“药品微生物实验室规范指导原则”中对菌种有了较为明确的规定
允许使用标准菌株和商业派生菌株 标准菌株应按保藏机构提供的说明进行复活 标准储备菌株应进行纯度和特性确认 标准储备菌株建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存或超低温冷冻保藏的方法 标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株。 冷冻菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用 工作菌株不可替代标准菌株，商业派生菌株仅可用作工作菌株

60 菌种保藏的原理 菌种保存的原理是根据菌种的生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的新陈代谢，使细胞基本上处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以减低菌种的变异率。低温、干燥、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物的代谢作用。因此低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。

61 菌种保藏的要点 选择适宜的培养基、培养温度和菌龄，以便得到健壮的细胞或孢子；保存于低温、隔氧、干燥、避光的环境中，尽量降低或停止微生物的代谢活动，减慢或停止生长繁殖；不被杂菌污染，在较长时期内保持着生活能力。

62 菌种保藏方法 菌种保存方法有多种，如琼脂斜面低温保存法、液体石蜡保存法、干燥（沙土）保存法；冷冻真空保存法、浓氮超低温保存法等。但对不同的微生物应通过保存试验来选择最适宜的保存方法。 注意事项：保存的菌种均应是新鲜纯菌培养物，至少应是第三代的培养物。不同细菌用不同的培养基，定期检查菌种保存环境做好记录。

63 培养基主要成分及作用 培养基 液氮超低温 冻结法 冷冻真空 干燥法 定期 移植法 方法 麸皮法 沙土管法 矿油 封藏法

64 菌种保藏方法 定期移植法：将菌种接种于所要求的培养基上，在最适温度中培养，至静止期或产生成熟的孢子时，置入5℃的冰箱（或冰库）保存。在培养和保存的过程中，由于代谢产物的累积而改变了原菌的生活条件，结果菌落群体中的个体就不断衰老和死亡，因此每5-15天或1-4个月重新移植一次，具体间隔时间因种而异。凡能人工培养的微生物都可用此法保存。此法不需特殊设备，但烦琐，费时，而且经常移植容易引起菌种退化。

65 菌种保藏的方法 琼脂斜面低温保存法：此方法是实验室菌种最常用的保存方法，具有操作简便，使用方便的优点。具体方法是：用无菌的接种环挑取菌株一环，划线于适宜的琼脂斜面（细菌为营养琼脂斜面、真菌为改良马丁琼脂斜面）上，细菌置37 ℃培养18~24小时，真菌置25 ℃培养18~24小时。

66 菌种保藏的方法 矿油封藏法：将化学纯的液体石蜡（矿油）经高压蒸气灭菌，放在40 ℃恒温箱中蒸发其中的水分，然后注入斜面培养物中，使液面高出斜面约1厘米。将试管直立，放在15-20 ℃室温中保存。由于在斜面培养物上覆盖一层液体，既能隔绝空气，又能防止培养基因水分蒸发而干燥，可以延长菌种保藏的时间。但注入的液体必须不与培养基混溶、对菌种无毒，不易被利用和挥发。此法适用于酵母菌、芽孢杆菌；不适用于固氮菌、乳酸杆菌、明串杆菌、法门氏菌和毛徽目中的大多数属种。此法简便，但必须注意防火和污染。

67 菌种保藏的方法 甘油冷冻管保存法：用无菌接种环挑取菌种接种在相应的琼脂培养基斜面上，置适宜的培养条件培养后，加入0.9%无菌氯化钠溶液3~5ml，并通过接种环轻轻刮取菌苔，使细菌充分扩散，制成菌悬液，再加入等体积的、浓度为20%的无菌甘油溶液，轻轻振摇，最后分装于无菌小试管中，置-30 ℃条件下保存。此法应注意菌悬液的浓度应高一些，而且不能含有培养基等营养物质，以防止长时间保存造成菌数下降；另外甘油的浓度不宜过高，否则影响细菌细胞渗透压，引起细菌死亡。厌氧菌、霉菌不宜用此法保存。

68 菌种保藏方法 沙土管法：将沙或土过筛、烘干、装管、灭菌，然后将菌种制成孢子悬液滴入其中混匀，放到盛氧化钙的干燥器里吸除水分，干燥后保存或用火焰封管后保存。吸附在干燥沙土上的孢子因缺水而处于休眠状态，可保存较长时间。此法适用于芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、放线菌、镶刀菌等。

69 菌种保藏方法 麸皮法： 将麸皮制成培养基，培养要保存的菌种，待生长良好后，置干燥器中保存。这是根据中国酿造酒、醋、酱时制麴的经验所采用的一种保藏方法，适用于谷物微生物区系中的种类。

70 菌种保藏方法 L—干燥法：又称液体干燥法或真空干燥法，用含3%谷氨酸钠的0.1M磷酸缓冲溶液（PH7.0)做分散酶，将待保藏的微生物制成高浓度的细胞悬液，滴入无菌安瓿瓶中，每管0.05毫升；将安瓿瓶固定在多歧管上，并以水浴保持安瓿瓶内样品温度为10℃，在 帕的真空度下干燥，火焰封管保存。此法不经冻结，用真实泵迅速抽干，可避免菌种的冻伤或死亡。广泛运用于病毒、可避免菌种的冻伤或死亡。广泛应用于病毒、噬菌体、细菌、酵母菌、蓝藻、原生动物等。

71 菌种保藏方法 梭氏法：将荣有1滴细胞悬液的小管，置于盛有氢氧化钾或五氧化二磷吸水剂的大试管中，用真空泵抽至1.3帕时，将大试管密封保存。这是为减少细胞死亡率而采取的一种不经冻结、缓慢脱水的干燥保藏法，适用于多种细菌、真菌。

72 菌种保藏方法 液态氮超低温冻结法：用甘油或二甲亚（DMSO)做保护剂制备细胞悬液，分装入无菌安瓿瓶，每管0.2毫升，在控制温度下降速率为1 ℃/分钟的条件下预冻至-40 ℃，然后立即放入液氮生物贮存罐中气相（-150 ℃）保存。恢复保养 时，先直接侵入38 ℃水浴中解冻5-10分钟，再种植于适宜培养基内培养。这是根据在低于-130 ℃时一切生化反应处于停止状态、微生物也不能进行代谢活动而设计的冻结法。为避免冻死、冻伤和细菌内形成大量冰晶，用保护剂制备悬液并控制预冻时的冷却速率和解冻时融化速率。微生物的大多数属种适于慢速冻结和快速解冻。此法适用于病毒、枝原体、各种细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌、蓝藻等。

73 菌种保藏方法 冷冻真空干燥法：将细胞悬液每 毫升注入一无菌安瓿瓶，于-40℃预冻一小时，再于-20-30℃、真空度为13.3帕的条件下脱水。在脱水过程后期，安瓿瓶外温度可逐渐升至25℃。脱水后的样品含水量应在3%以下。最后，将安瓿瓶保持真空度1.3帕，用火焰熔封，置10℃保存。为防止细胞在冻结和脱水过程中损伤或死亡，要用保护剂制备细胞悬液。保护剂有脱脂牛奶、血清、10%蔗糖或葡萄糖溶液等，其作用是通过氧和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。此法适用于病毒、衣原体、枝原体、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等的长期保存，是当前保持菌种的一个重要方法。但是，盐杆菌、发光杆菌、黏杆菌、阿舒囊徽、多囊徽、担子菌中的大多数属种不适用于此法保存。

74 菌种管理 菌种的申购 菌种的复苏 菌种的传代 菌种的保藏 菌种的使用和销毁

75 菌种管理 菌种的申购 — 每年年底，由实验室菌种管理人员提出下一年度菌种采购的计划，计划购置的菌种一般为药典收载的标准菌种，填写请购单，经批准后，由所采购部门向指定的菌种保藏机构购置。 —所购菌种均为冷冻干燥菌种。 —采购部门购入菌种后，应及时移交实验室。实验室菌种管理人员应仔细核对菌种发放单和冷冻干燥菌种管标签等各项信息，确认无误后，置4-6 ℃暂存。

76 菌种管理 菌种的复苏传代和使用 —菌种在打开前应仔细核对标签上菌名、菌号。并注意一株菌种使用一套打开用具，严防交叉污染。
—菌种复苏应在生物安全柜内操作。

77 菌种管理 冷冻菌种的复苏：将冷冻干燥的菌种定位0代。首先，用75%酒精或碘伏棉球将安瓿擦拭一下，用砂轮在安瓿上部1/3处划一下，用干燥的无菌纱布包裹安瓿，将安瓿搬开，用无菌滴灌吸取0.5~0.8ml适宜的培养基滴加到安瓿中，轻轻旋转安瓿并吹打，使冻干菌粉完全溶解，再将菌液全部吸出，分别转种在相应的培养基中。

78 菌种管理 细菌置37 ℃培养24~48小时，真菌置25 ℃培养3~7天，观察培养基是否浑浊，如培养基浑浊，菌体生长良好，进行确认，确认无误，则可作为第一代储备菌种，如不浑浊可适当延长培养时间，细菌可延长7天，真菌可延长14天。如仍未浑浊，说明菌种复活失败，培养物应按照有关规定进行灭菌处理。

79 菌种管理 菌种的确认：用无菌接种环挑取上述培养物1 环，划线在相应的琼脂平板上，置适宜温度培养后，挑去单一的纯菌落，进行草兰氏染色镜检，观察其染色特性及菌体形态，并作相应的生化试验鉴定该菌株。 菌种的使用：对已通过确认的菌种方可使用。用无菌接种环挑取上述纯菌菌落转种在相应的琼脂斜面上，可多转种几支，培养后挑选几支菌苔较厚的斜面进行保存，另外几支作为日常检验用。

80 菌种复活传代示意图 0代 代 代 代

81 菌种管理 菌种的使用和销毁 所保藏的菌种主要供本所检验工作使用。 本所保藏的菌种，一般每年更换标准菌种（冷冻干燥管）
过期菌种应及时销毁，销毁时应经121 ℃20分钟的生物灭活处理。

82 谢谢