7.食品添加剂的测定 目标：了解常用食品添加剂中甜味剂、防腐剂、漂白剂、护色剂、着色剂、抗氧化剂的基本概念、理化性质、检测意义、食品中使用的限量标准、ADI值。能掌握常用食品添加剂的含量的检测方法。

Presentation on theme: "7.食品添加剂的测定 目标：了解常用食品添加剂中甜味剂、防腐剂、漂白剂、护色剂、着色剂、抗氧化剂的基本概念、理化性质、检测意义、食品中使用的限量标准、ADI值。能掌握常用食品添加剂的含量的检测方法。"— Presentation transcript:

1 7.食品添加剂的测定 目标：了解常用食品添加剂中甜味剂、防腐剂、漂白剂、护色剂、着色剂、抗氧化剂的基本概念、理化性质、检测意义、食品中使用的限量标准、ADI值。能掌握常用食品添加剂的含量的检测方法。

2 主要内容 甜味剂的测定（糖精钠） 防腐剂的测定（山梨酸、苯甲酸） 发色剂的测定（亚硝酸盐、硝酸盐） 漂白剂的测定（二氧化硫及亚硫酸盐）
抗氧化剂的测定（BHA、BHT） 合成着色剂的测定

3 7.1 概述 定义： 所谓食品添加剂是指为改善食品品质和色、香、味以及因防腐和加工工艺的需要加入到食品的天然或化学合成的物质。
功能：保持食品营养、防止腐败变质，增强食品感官性状、满足加工工艺要求，提高食品质量。

4 分类： （1）按来源分为两大类：天然食品添加剂和化学合成添加剂。 天然食品添加剂是利用动物与植物组织或分泌物及以微生物的代谢产物为原料，经过提取、加工所得到的物质。如辣椒红色素、番茄红色素等是从植物中提取出来的。天然食品添加剂一般对人体无害。 化学合成添加剂是通过一系列化学手段所得到的有机或无机物质，或多或少都有毒性，在剂量上应该严格掌握。

5 （2）按食品添加剂的功能、用途划分，各国分类不尽相同，我国《食品添加剂使用卫生标准》将其分为22大类：甜味剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂、护色剂、香精香料、酸度调节剂、抗结剂、消泡剂、漂白剂、膨胀剂、胶姆糖基础剂、乳化剂、酶制剂、增味剂、面粉处理剂、被膜剂、水分保持剂、营养强化剂、稳定剂和凝固剂、增稠剂和其他类添加剂。

6 食品添加剂的安全使用及管理 WHO/FAO规定了《使用食品添加剂的一般原则》，就食品添加剂的安全性和维护消费者利益方面制定了严格的管理办法，并订出它们的ADI 值（Acceptable Daily Intake成人每天每公斤允许的最大摄入量， mg/Kg体重. 日） 食品添加剂法典委员会（CCFA）每年定期召开会议，对食品添加剂制定统一的规格和标准，确定统一的试验方法和评价方法，对食品添加剂联合专家委员会（JECFA）所通过的各种食品添加剂的标准、安全性评价方法等进行审议和认可，在提交食品法典委员会（CAC）复审后公布。

7 我国1995年颁布《食品卫生法》，2009年6月1被《食品安全法》取代
1997年颁布《食品添加剂使用卫生标准》（最新GB 2760—2007）

8 测定意义 食品添加剂的检测，目的在于监督、保证和促进正确合理地使用食品添加剂，确保人们的身体健康。

9 7.2 甜味剂（糖精钠）的测定 7.2.1概述 定义：甜味剂是指能够赋予食品甜味的食品添加剂。 按其来源可分为天然甜味剂和人工合成甜味剂
7.2 甜味剂（糖精钠）的测定 7.2.1概述 定义：甜味剂是指能够赋予食品甜味的食品添加剂。 按其来源可分为天然甜味剂和人工合成甜味剂 按其营养价值可分为营养型与非营养型甜味剂 通常所讲的甜味剂系指人工合成的非营养型甜味剂，如糖精钠、环己氨基磺酸钠(甜蜜素)、乙酰磺胺酸钾(安赛蜜)、天冬酰苯丙氨甲酯(甜味素、阿斯巴甜)、三氯蔗糖、纽甜等。

10 性质及应用：白色结晶或粉状，无臭或微有酸性芳香气，味极甜。对热不稳定，长时间加热失去甜味。
在水中溶解度极小，故在食品生产中常用其钠盐，易溶于水，浓度低时呈甜味，浓度高时有苦味。进入人体后不分解，不供给热能，无营养价值，对其使用的安全性至今尚未有定论。 糖精及其钠盐是使用较广的甜味剂之一，我国《食品添加剂使用卫生标准》中对其使用范围和使用量都有明确规定。但在凉果、蜜饯等产品的检验过程中，经常会出现其含量超标现象。

11 7.2.2 糖精钠的测定方法 高效液相色谱法 薄层色谱法

12 以饮料为样品，讲解甜味剂糖精钠的测定，并演示样品的处理、HPLC的使用
高效液相色谱法测定糖精钠的含量 以饮料为样品，讲解甜味剂糖精钠的测定，并演示样品的处理、HPLC的使用 原理： 样品经加温除去二氧化碳和乙醇后，调节pH至近中性，过滤后进高效液相色谱仪。经反相色谱柱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量。

13 仪器和试剂 (1)仪器：高效液相色谱仪，带紫外检测器 (2)试剂：甲醇 氨水（1+1）：氨水加等体积的水混合 0.02mol/L乙酸铵溶液 糖精钠标准溶液

14 操作步骤 (1)样品处理： 汽水和配制酒类：微热搅拌除去二氧化碳和乙醇，再用氨 水(1:1)调 节PH约为7，加水定容，过滤； 饮料、果汁类：用氨水(1:1)调节PH约为7，加水定容， 离心沉淀， 过滤； 固体样品：如凉果、蜜饯等，将样品捣碎，称取适量用 温水浸泡，冷却后定容，过滤。必要时加入硫酸铜和氢氧化钠做澄清剂。

15 (2)高效液相色谱分析参考条件： 检测器：紫外检测器 检测波长：230nm 色谱柱：C18柱 流动相：甲醇+0.02mol/L乙酸铵（5+95） 流速：1.0mL/min 进样量：20µL (3)测定：仪器稳定后，分别将20µL标准溶液和样品溶 液注入色 谱系统，根据保留时间定性，峰面 积定量。

16 结果计算： A样----样品的峰面积 A标----标样的峰面积 C标----标样的浓度(ug/mL） V样----样品的定容体积（mL） m样----样品质量(g)

17 说明： ( 1）本方法国家标准检验方法(GB/T ），适用于各类食品中糖精钠含量的测定。另外，本方法可同时测定食品中糖精钠、苯甲酸、山梨酸的含量。 （2）被测溶液的PH值对测定和色谱柱使用寿命均有影响， PH>8或PH<2时会影响被测组分的保留时间，对仪器有腐蚀作用，以中性为宜。

18 薄层色谱法测定糖精钠的含量 原理 样品经处理除去蛋白质、果胶、CO2、酒精等杂质后，在酸性条件下，用乙醚提取食品样品中的糖精钠，经薄层层析分离后用溴甲酚绿—溴甲酚蓝混合指示剂显色后，与标准样品的斑点进行比较定性。在经薄层色谱分离、显色后，刮下斑点用2%的NaHCO3溶解后，以标准曲线法进行定量分析 。 操作步骤 样品的提取→薄层板的制备→点样→展开与显色 结果计算

19 7.2.3 环己氨基磺酸钠（甜蜜素）的测定 以饮料或蜜饯等为样品示范样品的处理操作；示范气相色谱仪的使用。
原理：在酸性介质中，甜蜜素与亚硝酸钠反应，生成环己醇亚硝酸酯，利用气相色谱进行定量和定性。 测定步骤：样品处理(液体样品除CO2和酒精；固体样品用水浸泡) →冰浴中加入 亚硝酸钠和硫酸，反应30min → 正己烷萃取→气相色谱分析, 采用标准曲线法定量。

20 7.2.4 乙酰磺胺酸钾（安赛蜜/AK糖）的测定 采用液相色谱法（GB/T 5009.140) 样品处理条件同糖精钠。
该方法可同时测定糖精钠、咖啡因、阿斯巴甜。

21 几种常见甜味剂的检测情况 糖精钠— GB/T 5009.28， HPLC法
AK糖（安赛蜜、乙酰磺胺酸钾） — GB/T ， HPLC法 甜蜜素—GB/T ， GC法 三氯蔗糖— GB/T ，HPLC法 纽甜—GB/T ，HPLC法

22 7.3 防腐剂（山梨酸、苯甲酸）的测定 7.3.1 概述 定义：防腐剂是指能防止食品腐败、变质，抑制食品中微生物繁殖，延长食品保存期的物质，它是人类使用最悠久、最广泛的食品添加剂。 目前，我国允许使用的品种主要有苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钾盐、对羟基苯甲酸乙酯和丙酯、丙酸钠、丙酸钙、脱氢乙酸等。

23 性质：（1）苯甲酸，微溶于水，易溶于氯仿、丙酮、乙醇、乙醚等有机溶剂，化学性质较稳定。苯甲酸钠易溶于水，难溶于有机溶剂，与酸作用生成苯甲酸。
（2）山梨酸，难溶于水，易溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。山梨酸钾易溶于水，难溶于有机溶剂，与酸作用生成山梨酸。

24 苯甲酸及其钠盐主要用于酸性食品的防腐，在pH 2.5-4其抑菌作用较强，当pH＞5.5时，抑菌效果明显减弱。对霉菌和酵母菌效果甚差。
苯甲酸进入人体后，大部分与甘氨酸结合形成无害的马尿酸，其余部分与葡萄糖醛酸结合生成苯甲酸葡萄糖醛酸甙从尿中排出，不在人体积累。苯甲酸的毒性较小。 山梨酸钾易溶于水，难溶于有机溶剂，与酸作用生成山梨酸。比苯甲酸更安全，在体内最后成CO2和水。

25 苯甲酸(钠)和山梨酸(钾)的测定方法 酸碱滴定法测定苯甲酸及苯甲酸钠 紫外分光光度法测苯甲酸 硫代巴比妥酸比色法测定山梨酸
气相色谱法—氢焰检测器，两种同时测 高效液相色谱法—同时测这两种及糖精钠 薄层色谱法 GB/T —2003 酸碱滴定法测定苯甲酸及苯甲酸钠 紫外分光光度法测苯甲酸 硫代巴比妥酸比色法测定山梨酸

26 7.3.2气相色谱法测定山梨酸、苯甲酸 以酱油等产品为样品示范样品的处理操作；示范气相色谱仪的使用。 山梨酸、苯甲酸的气相色谱测定原理：
样品经酸化后，用乙醚提取山梨酸和苯甲酸，再用带氢火焰离子化检测器的气相色谱仪进行分离测定，根据保留时间定性，使用标准曲线法定量。

27 仪器和试剂 ： （1）乙醚、石油醚（沸程30～60 ℃） （2）山梨酸、苯甲酸标准溶液：用石油醚-乙醚（3:1）混合溶剂配制溶液每毫升相当2mg山梨酸或苯甲酸。 （3）山梨酸、苯甲酸标准使用液：吸取适量山梨酸、苯甲酸标准溶液，以石油醚-乙醚（3:1）混合溶剂稀释至每mL相当于50、100、150、200、250µg山梨酸或苯甲酸。 （4）仪器：气相色谱仪，带氢火焰离子化检测器

28 降低苯甲酸在水中溶解度；防止发生乳化 操作步骤 (1)样品的处理：均匀的样品→HCI酸化→乙醚提取→氯化钠酸性溶液洗涤→通过无水硫酸钠过滤（除去水分）→乙醚定容(25mL )→取乙醚提取液于5mL40℃水浴上挥干→加入2mL石油醚-乙醚（3：1）混合溶液溶解残渣。 酸化处理的目的??

29 (2)色谱参考条件 色谱柱：玻璃柱，内径3mm，长2m， 气流速度：载气、氮气，50ml/min（氮气和空气、氢气比按各仪器型号不同选择各自的最佳比例条件）。 温度：进样口 230 ℃ ，检测器230 ℃ ，柱温170 ℃ 。

30 进样2µl标准系列中各浓度标准使用液于气相色谱仪中，以浓度为横坐标，相应峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线。
（3）测定： 进样2µl标准系列中各浓度标准使用液于气相色谱仪中，以浓度为横坐标，相应峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线。 同时进样2µl样品溶液，测得峰面积可从标准曲线相应的山梨酸、苯甲酸的浓度。 山梨酸和苯甲酸的标准色谱图

31 结果计算 式中： X----样品中山梨酸或苯甲酸的含量 ρ----标准曲线上查得山梨酸或苯甲酸的量，μg/mL
V1----加入石油醚-乙醚(3+1)混合溶剂的体积，mL m-----样品的质量，g 5----测定时吸取乙醚提取液的体积，mL； 25----样品乙醚提取液的总体积，mL

32 说明及注意事项： 1.由测得苯甲酸的量乘以相对分子质量比1.18，即为样品中苯甲酸钠含量。 2.由测得山梨酸的量乘以相对分子质量比1.34，即为样品中山梨钾的含量。 3.通过无水硫酸钠层过滤后的乙醚提取液应达到去除水分的目的，否则5ml乙醚提取液在40 ℃挥去乙醚后仍残留少量水分会影响测定结果。当出现将残留水分挥干析出极少量白色氯化钠时，应搅松残留的无机盐后加入石油醚-乙醚（3:1）振摇，取上清液进样，否则氯化钠覆盖了部分山梨酸、苯甲酸，使定结果偏低。

33 具体方法同HPLC法测定糖精钠含量的测定 可同时用于苯甲酸、山梨酸、糖精钠等的测定。 以酱油等产品为样品老师讲解和指导，学生独立完成测定
7.3.3高效液相色谱法测定山梨酸、苯甲酸 具体方法同HPLC法测定糖精钠含量的测定 可同时用于苯甲酸、山梨酸、糖精钠等的测定。 以酱油等产品为样品老师讲解和指导，学生独立完成测定

34 7.3.4 酸碱滴定法测定苯甲酸及苯甲酸钠 原理： 试样中加入饱和氯化钠溶液，在碱性条件下进行萃取，分离出蛋白质、脂肪等，然后酸化，用乙醚提取试样中的苯甲酸，再将乙醚蒸去，溶于中性醚醇混合液中，最后以标准碱液滴定。 仪器和试剂： 中性醚醇混合液 0.05mol/L 氢氧化钠标准滴定溶液

35 操作步骤 ： (1)样品处理: 固体样品：称100g样于500ml容量瓶中→加200mL水→加NaCl直到不溶解为止（降低苯甲酸在水中溶解度，以减少在提取及水洗过程中的损失）→用10%NaOH调为碱性（这时苯甲酸生成苯甲酸钠）→用饱和NaCl定容500mL→静置2h→过滤→弃去初液→收集滤液 含酒精的样品：吸取250mL样液用10%NaOH调为碱性→水浴蒸发至100mL→用饱和NaCl定容250mL→过滤→弃去初液→收集滤液 含脂肪多的样品：乙醚除脂肪

36 (2)提取及滴定：吸滤液100mL于分液漏斗→加1︰1 HCl 5mL酸化→用150mL乙醚提取→合并醚层→回收乙醚（50℃水浴）→用10mL中性醚醇+10mL水溶解残渣→加2滴酚酞→用0.05mol/L NaOH滴出微红色（同时要求做空白实验） (3)结果计算：

37 说明： （1）预处理时用NaCl饱和，作用是除去蛋白质及其水解产物，及降低苯甲酸钠的溶解度降低苯甲酸在水中溶解度，以减少在提取及水洗过程中的损失 （2）方法的缺点：样品中有其它有机酸时，乙醚萃取时易带过来，所以此法测定误差较大。 （3）适用于样品中苯甲酸含量为0.1%以上的分析。

38 7.3.5紫外分光光度法测定苯甲酸含量 原理及步骤：
样品中苯甲酸在酸性溶液中随水蒸气蒸馏出来，与样品中非挥发性成分分离→用重铬酸钾和硫酸氧化除去苯甲酸以外的杂质→氧化后溶液再次蒸馏→碱液吸收苯甲酸→225nm比色定量 标准曲线定量

39 7.3.6 硫代巴比妥酸比色法测定山梨酸 原理：自样品提取的山梨酸及其盐类，在硫酸及重铬酸钾的氧化作用下产生丙二醛，丙二醛与硫代巴比妥酸作用产生红色化合物，其色深浅与丙二醛浓度成正比，并于波长530nm处有最大吸收，符合比尔定律，故可用比色法测定 。

40 7.4 发色剂的测定 7.4.1 概述 发色剂又名护色剂，是一些能够使肉与肉制品呈现良好色泽的物质。硝酸盐和亚硝酸盐是肉制品生产中最常使用的发色剂。

41 发色剂在食品中的作用：(1)发色作用；(2)抑菌作用；(3)产生风味
亚硝酸盐是致癌物质-----亚硝胺的前体，我国《食品添加剂使用卫生标准》对其使用范围和用量有明确规定

42 7.4.2亚硝酸盐的测定(盐酸萘乙二胺法) 以香肠为样品进行讲解和演示样品的处理、分光光度计的使用等。 原理：样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化，产生重氮盐，此重氮盐再与偶合试剂(盐酸萘乙二胺)偶合形成紫红色染料，染料的颜色深浅与亚硝酸根含量成正比，其最大吸收波长为538nm，测定其吸光度后，可与标准比较定量。

43

44 试剂： （1）亚铁氰化钾溶液、乙酸锌溶液：澄清剂 （2）饱和硼砂溶液 （3）0.4％对氨基苯磺酸盐酸溶液：避光保存。
（4）0.2％盐酸萘乙二胺溶液：避光保存。 （5）亚硝酸钠标准溶液：200 µg/mL （6）亚硝酸钠标准使用液： 5µg/mL , 临用时配制。

45 仪器 （1）小型绞肉机或组织捣碎机 （2）分光光度计 操作步骤 (1)样品的处理：取捣碎均匀的试样5g加入硼砂液12.5mL→沸水浴15min→加亚铁氰化钾和乙酸锌各5mL→定容，放置0.5h→撇去脂肪层→过滤→滤液待测 思考：加入饱和硼砂的作用是什么？

46 (2)测定：吸取40mL样品处理液于50mL比色管中，另吸取0. 00、0. 20、 0. 40、0. 60、0. 80、1. 00、1
(2)测定：吸取40mL样品处理液于50mL比色管中，另吸取0.00、0.20、 0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50mL亚硝酸钠标准使用液，分别置于50mL比色管中。于标准与样品管中分别加入2mL 对氨基苯磺酸溶液混匀，静置3～5min后各加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀。静置15min，用 2cm比色杯，以零管调零点，于波长538nm处测吸光度，绘制标准曲线比较定量。

47 结果计算： 式中： X-----样品中亚硝酸盐的含量，mg/Kg m-----样品质量，g m1-----测定用样液中亚硝酸盐的含量（即从标准 线上查得），µg V1-----样品处理液总体积，mL V 比色时取样品处理液的体积，mL

48 说明及注意事项 （1）实验中使用重蒸水可以减少试验误差。 （2）亚铁氰化钾和乙酸锌溶液作为蛋白质沉淀剂，是利用产生的亚铁氰化锌与蛋白质共沉淀； （3）亚硝酸盐容易氧化成硝酸盐，样品处理时，加热的温度和时间均要控制。 （4）饱和硼砂的作用有二：一是亚硝酸盐的提取剂，二是蛋白质沉淀剂。

49 （5）盐酸萘乙二胺有致癌作用，使用时应注意安全。
（6）当亚硝酸盐含量过高时，过量的亚硝酸盐可以使偶氮化合物氧化，生成黄色，而使红色消失，这时应将样品处理液稀释后再做，最好是样品的吸光度落在标准曲线的吸光度之内。 (7)GB 中第一法为离子色谱法，可以同时测定样品中亚硝酸盐和硝酸盐的含量。

50 7.4.3 硝酸盐的测定 原理 样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，将样品提取液通过镉柱，使其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子。在酸性条件下，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成红色染料，经比色测得亚硝酸盐总量，从还原前后亚硝酸盐量即可求得硝酸盐的含量。 在镉柱中，镉定量地将 NO3-还原成NO 2- Cd十N03- → CdO十N02- 注意镉柱的制备和使用

51 结果计算 X------硝酸盐含量，mg/kg； m2------经镉柱还原后测得的亚硝酸盐量，μg；
V------测定用经镉柱还原后样液体积，ml； 亚硝酸钠换算为硝酸钠的系数； m 样品的质量，g。

52 7.5 漂白剂的测定 7.5.1 概述 定义：漂白剂是指可使食品中的有色物质经化学作用分解转变为无色物质或使其褪色的一类食品添加剂。
7.5 漂白剂的测定 概述 定义：漂白剂是指可使食品中的有色物质经化学作用分解转变为无色物质或使其褪色的一类食品添加剂。 分类：漂白剂从作用机理分为两类：(1)还原型（SO2、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠等）； (2)氧化型（H2O2、次氯酸等） 我国使用的大都是以亚硫酸类化合物为主的还原型漂白剂，通过所产生的SO2的还原作用来抑制、破坏食品的变色因子，而使食品褪色或免于发生褐变。

53 测定意义：使用量过大，对人体的健康会带来一定的影响。当溶液SO2浓度为0

54

55 7.5.2漂白剂的测定 测定亚硫酸盐及二氧化硫的主要方法有： 盐酸副玫瑰苯胺比色法 蒸馏法

56 亚硫酸盐的测定(盐酸副玫瑰苯胺法) 原理：亚硫酸盐与四氯汞钠反应生成稳定的络合物，再与甲醛和盐酸副玫瑰苯胺作用，经分子重排，生成紫红色络合物，于550nm处有最大吸收，其颜色深浅与亚硫酸含量成正比，故通过测定吸光度，可与标准比较定量。 这种方法关键是把样品中SO2提取出来，常用四氯汞钠做萃取液（主要是在分析中为了避免SO2的损失，常以Na2HgCl4作吸收液）。

57 试剂 （1）盐酸副玫瑰苯胺溶液的准备： 副玫瑰苯胺溶液加入盐酸后颜色有什么变化？盐酸的用量对颜色的变化有哪些影响？如何判断盐酸用量已适合？

58 （2）二氧化硫标准溶液的配制与标定： 配制：称取0.5g亚硫酸氢钠，溶于200mL四氯汞钠吸收液中放置过夜，上清液用定量滤纸过滤。 标定：吸取10.0mL亚硫酸氢钠-四氯汞钠溶液于250mL碘量瓶中，加100mL水，准确加入20.00mL0.1mol/L的碘溶液，5mL冰乙酸，摇匀，放置于暗处2min后迅速以0.1000mol/L的硫代硫酸钠标准滴定溶液滴定至淡黄色，加0.5mL淀粉指示剂，继续滴定至无色。同时取100mL水做空白试验。

59 （3）二氧化硫标准使用溶液：临用前将二氧化硫标准溶液用四氯汞钠吸收液稀释成每毫升相当于2µg二氧化硫。

60 操作步骤 (1)样品的处理： 水溶性固体样品的处理（各种罐头类样品）： 称取捣碎均匀样10g→用少量水溶解后转移到100mL容量瓶中→加20g/L NaOH 4mL→摇匀→加H2SO4 (1+1)4mL→加Na2HgCl4 20mL→定容100mL→过滤 加碱是将食品中的二氧化硫释放出来，加硫酸是为了中和碱，这是因为总的显色反应是在微酸性条件下进行的。

61 淀粉类样品的处理（粉条、粉皮等）: 称取粉碎均匀样10g→少量水溶解转移到100mL容量瓶中→加Na2HgCl4 20mL→浸泡4h以上（若上层液不澄清，要加入亚铁氰化钾及乙酸锌溶液各2.5mL）→用水定容→过滤备用 液体样品处理: 吸取样液10mL→于100mL容量瓶中→加Na2HgCl4 20mL→定容→过滤备用

62 (2)测定 : 吸取0.50~5.0mL上述样品处理液于 25mL带塞比色管中。另吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00mL二氧化硫标准使用液分别置于25mL带塞比色管中。 于样品及标准管中各加入四氯汞钠吸收液至10mL，然后各加1mL 氨基磺酸铵溶液，1mL甲醛溶液及1mL盐酸副玫瑰苯胺溶液，摇匀，放置20min。用1cm比色杯，以零管调节零点，于波长550nm处测吸光度，绘制标准曲线比较。

63 结果计算： 式中： X----样品中二氧化硫的含量，g/kg； m1----测定用样品液中二氧化硫的含量， （即从标准曲线上查得）μg； V----测定用样液的体积，mL； 样品液总体积，mL； m----样品质量，g。

64 说明及注意事项： （1）盐酸副玫瑰苯胺中盐酸的用量影响显色，加入盐酸量多时色浅，量少色深。加盐酸调成黄色后，必须放置过夜后使用，使用时以空白管不显色为宜，否则需重新用盐酸调节。 （2）二氧化硫标准使用液的浓度随放置时间的延长逐渐降低，必须临用前用新标定的二氧化硫标准溶液稀释。

65 （3）亚硫酸和食品中的醛（乙醛等）、酮（酮戊二酸、丙酮酸）和糖（葡萄糖、果糖、甘露糖）相结合，以结合态的亚硫酸存在于食品中。加碱是将食品中的二氧化硫释放出来，加硫酸是为了中和碱，这是因为总的显色反应是在微酸性条件下进行的。 （4）亚硝酸对本法有干扰，加入氨基磺酸铵，是为了分解亚硝酸，减少干扰。

66 （5）显色反应最适宜的温度为20 ~25℃，温度低，灵敏度低，因此样品管和标准管应在相同温度下比色。
（6）颜色较深的样品，需用活性炭脱色。 （7）样品中加入四氯汞钠吸收液后，溶液中的二氧化硫含量在24h之内稳定，所以测定应在24h内进行。

67 1.在配制盐酸副玫瑰苯胺溶液时应注意哪些操作？
2.副玫瑰苯胺溶液加入盐酸后颜色有什么变化？盐酸的用量对颜色的变化有哪些影响？如何判断盐酸用量已适合？ 3.在实验前须标定二氧化硫，首先须要标定哪些溶液？如何标定？ 4.二氧化硫标准为什么要用四氯汞钠来配制？ 5.在配制二氧化硫使用液时为什么要先配制成浓度高的标准液后,再稀释成浓度低的使用液？ 6.样品处理后应在多长时间内测定,否则会怎样？ 7.样品处理中加入氢氧化钠的目的是什么？ 8.氨基磺酸铵不是显色剂,但在比色时为什么要加入氨基磺酸铵？

68 7.5.2.2 二氧化硫的测定—蒸馏法 以白砂糖为样品进行讲解和演示
二氧化硫的测定—蒸馏法 以白砂糖为样品进行讲解和演示 原理：亚硫酸盐在酸性条件下加热，蒸出二氧化硫，然后用乙酸铅溶液吸收, 用浓盐酸酸化，再用碘标准溶液滴定，根据消耗碘标准溶液计算出样品中SO2的含量。 SO2 +I2 + 2H2O →H2SO4 + 2HI 步骤：样品处理→蒸馏→滴定→计算

69 吊白块(甲醛合次亚硫酸氢钠)的定性检验 （1）A法 取一定量粉碎的样品于三角瓶中，加约与样品10倍量的蒸馏水，搅拌，再向三角瓶中加入1:1盐酸溶液，再加2g锌粒，在三角瓶口上迅速包上一张乙酸铅试纸，放置1h，观察。如果乙酸铅试纸变为棕~黑色，即证明试样中有吊白块存在。

70 （2）B法 1）试剂：变色酸溶液：0.1% 15mol/L硫酸溶液，临时现配，并用玻璃棉过滤。 2）操作方法：取粉碎样品20g于烧杯中，加蒸馏水20mL，浸泡30min（不断搅拌），过滤或用玻璃纸透析，取滤液或透析液1mL，加4mL变色酸溶液，置沸水浴上加热20~30min，取下冷却，如呈紫色为阳性反应，无色或淡黄色为阴性反应。同时作空白和10μg甲醛标准对照管。 馒头、腐竹、糖果、怡糖不易处理样品可用水蒸汽蒸馏，按定量方法中样品测定项目操作，取蒸馏液10~20mL即可。

71 7.6 抗氧化剂的测定 7.6.1概述 定义：抗氧化剂是指能阻止或推迟食品氧化变质，提高食品稳定性和延长储存期的食品添加剂。 分类：
7.6 抗氧化剂的测定 7.6.1概述 定义：抗氧化剂是指能阻止或推迟食品氧化变质，提高食品稳定性和延长储存期的食品添加剂。 分类： 按其溶解性: 油溶性抗氧化剂、水溶性抗氧化剂 按其作用: 天然抗氧化剂、人工合成抗氧化剂

72 应用：目前我国常用的抗氧化剂有叔丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、没食子酸丙酯(PG)、茶多酚(TP)等，主要用于油脂及高油脂类食品中。抗氧化性最强是混合使用，二种抗氧化剂混合使用效果最好。 BHA：对热稳定经常作为焙烤食品用的抗氧化剂，在日本是禁止使用的 BHT：在高温下不稳定，如与BHA合并使用可明显提高抗氧化效果，抗氧化性强于BHA，毒性大于BHA 测定方法：色谱法、薄层色谱法、比色法

73 7.6.2 GC法测定食品中 BHA与 BHT （GB/T 5009.30第一法） 原理：
样品中的叔丁基羟基茴香醚(BHA)和二丁基羟基甲苯(BHT)用石油醚提取，通过层析柱用二氯甲烷洗脱，使BHA与BHT净化，浓缩后，经气相色谱分离后用氢火焰离子化检测器检测，根据样品峰高与标准峰高比较定量。

74 操作步骤 （1）层析柱的制备（1×30cm玻璃柱，带活塞） 柱底部加少许玻璃棉、少量无水硫酸钠，称取硅胶6g和弗罗里硅土4g 混匀后，用石油醚混合装柱，柱顶部再加入少量无水硫酸钠

75 (2)试样的制备： 植物油样品：称取混匀植物油样品2.00g用30mL石油醚溶解转移到制备好的层析柱上，再用 10mL石油醚分数次洗涤烧杯并转移到层析柱上。用100mL二氯甲烷分5次淋洗，合并淋洗液，减压浓缩近干时，用二硫化碳定容至2mL，待测。 其它固体样品：根据样品中含油量的多少称取一定量的样品于具塞三角瓶中，加石油醚浸泡，放置过夜，迅速过滤，挥干石油醚得脂肪，然后准确称取脂肪 g按上述操作进行柱层析。(即先提取脂肪，再进行层析） BHA或BHT的含量是指样品脂肪中BHA或BHT的含量

76 同时取3.0µLBHA、BHT混合标准使用液和样品液注入气相色谱仪，分别记录标准液和样液的峰高或峰面积进行比较定量。
（3）仪器条件： 色谱柱：玻璃柱150mm×3mm， 柱温140℃，进样口、检测器温度200℃ 载气：氮气，流速：70mL/min （4）测定： 同时取3.0µLBHA、BHT混合标准使用液和样品液注入气相色谱仪，分别记录标准液和样液的峰高或峰面积进行比较定量。

77 计算公式： 式中： X----样品脂肪中BHA或BHT的含量，g/Kg h1----样品的峰高或峰面积 h2----标准的峰高或峰面积
ρ----标准溶液的浓度，mg/mL V----样品制备液的体积，mL m----称取的样品脂肪的质量，g

78 说明及注意事项： （1）抗氧化剂本身会被氧化，样品随着存放时间的延长含量会下降，所以样品进入实验室应尽快分析，避免结果偏低。 （2）BHT稳定性较差，易受阳光、热的影响，操作时应尽量避光。 （3）抗氧化剂在层析柱中停留的时间不宜太长，但淋洗速度也不能太快，控制在每分钟70滴左右为宜。 （4）样品先进行提取其中脂肪，再进行抗氧化剂测定，结果以脂肪中的抗氧化剂含量计。

79 7.6.3 比色法测定二丁基羟基甲苯(BHT)的含量 （GB/T 5009.30第三法）
原理 ：利用样品通过水蒸气蒸馏，使BHT分离，用甲醇吸收后，遇邻联二茴香胺与亚硝酸钠溶液生成橙红色化合物，再用三氯甲烷提取，于520nm处测定其吸光度并与标准比较定量。 操作步骤 (1)样品处理：甘油浴165℃蒸馏，甲醇接收。 (2)标准曲线的绘制 (3)样品测定

80 7.6.4 比色法测定没食子酸丙酯（PG） （GB/T 5009.32）
样品经石油醚溶解，用乙酸铵水溶液提取后，没食子酸丙酯(PG)与亚铁酒石酸盐起颜色反应，在波长540nm处测定吸光度，与标准比较定量。

81 7.6.5 特丁基对苯二酚(TBHQ)的检测 QB ：食品添加剂TBHQ的检测。样品用丙酮溶解，直接进气相色谱，用面积归一法定量 食品中BHA、BHT和 TBHQ 测定（GB/T ）：样品中的抗氧化剂用有机溶剂提取、凝胶渗透色谱净化系统（GPC）净化后，用气相色谱氢火焰离子化检测器检测，采用保留时间定性，外标法定量。

82 7.7 着色剂的测定 定义：以食品着色、改善食品色泽为目的 一类食品添加剂。 分类：天然色素和合成色素
7.7 着色剂的测定 定义：以食品着色、改善食品色泽为目的 一类食品添加剂。 分类：天然色素和合成色素 应用：天然色素是从一些动物、植物组织中提取出来， 安全性高，但稳定性和着色能力差，难以调出任意的色泽，且资源短缺，不能满足食品工业的需求。 合成色素是用有机物合成的，资源十分丰富（来自于煤焦油及其副产品），稳定性好、色泽鲜艳、着色力强、能调出任意颜色，因而得到广泛的应用。

83 食品中合成着色剂的种类很多，国际上允许使用的有30余种，我国允许使用的主要有苋菜红、胭脂红、赤藓红、新红、诱惑红、柠檬黄、日落黄、亮蓝、靛蓝等。
测定意义： 由于许多合成色素本身或其代谢产物具有一定的毒性、致泻性、致癌性，因此必须对合成色素的使用范围及用量加以限制，确保其安全性。

84 测定方法：目前，在食品行业中使用单一色素已经比较少，大多数使用复合色素方可达到比较满意色泽，因而给分析工作者带来一定困难。
目前合成色素的测定方法主要采用高效液相色谱法

85 7.7.2 高效液相色谱法测定合成着色剂 （GB/T 5009.35)
对合成色素在测定时采用的几大步骤如下： 样品前处理→吸附→解吸→鉴别（何种色素）→定量（此色素含量是否超标） 以饮料、糖果等为样品演示样品的预处理和样品的测定

86 原理：食品中的合成着色剂经聚酰胺吸附法或液-液分配法提取后，制成水溶液，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，根据保留时间定性和与峰面积比较进行定量。
仪器与试剂 高效液相色谱仪，带紫外检测器

87 操作步骤： (1)样品处理： ①饮料类：直接取样，含CO2的加热排除CO2 ②配制酒：加热排出乙醇，加热前放几片碎瓷片。 ③淀粉、软糖、硬糖、蜜饯类：称取粉碎样品5～10g加水30mL，加热溶解，用20％柠檬酸溶液调PH至6左右。

88 ④奶糖：称取样品 10g粉碎，加 30mL乙醇--氨溶液溶解，置水浴上浓缩到20mL左右，立即用1:10硫酸调至微酸性（用PH 试纸测定），再继续滴加 1mL1:10硫酸，再加 1mL10％钨酸钠溶液使蛋白质沉淀，过滤、用少量水洗涤，收集滤液备用。 ⑤蛋糕类：称取样品10g，加放少量海砂或无水硫酸钠混匀，用电吹风吹干，加入30mL石油醚搅拌静置片刻，倾出石油醚，如此重复2～3次以除去油脂，再吹干研细，用乙醇---氨溶液提取色素直至色素提取完全，以下按④自“置水浴上加热浓缩至20mL左右”起依法操作。

89 （2）色素提取： ①聚酰胺吸附法：样品溶液加 20%柠檬酸调pH为 6，加热至70 ℃ ，将1g聚酰胺粉加少许水调成糊状，倒入样品溶液中，搅拌片刻，抽滤，用70℃ PH4的水洗涤3～5次，然后用甲醇—甲酸混合液洗涤3～5次（含赤藓红的样品不能洗），再用水洗至中性，用乙醇---氨水---水混合液解吸3～5次，每次5mL，收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至5mL。 PH4-7吸附最强，碱性溶液中吸附最弱 目的：去除天然色素 属水溶性酸性色素

90 ②液---液分配法（适用于含赤藓红的样品）：将制备好的样品溶液放入分液漏斗中，加 2mL盐酸，三正辛胺+正丁醇溶液（5 + 95）10～20mL，振摇，重复提取至无机相无色，合并有机相，用饱和硫酸钠溶液洗2次，将有机相于水浴加热浓缩至10mL，转移到分液漏斗中，加 60mL正己烷，混匀，加氨水（2＋98）提取2～3次，每次5mL，合并氨水层（含水溶性酸性色素），用正己烷洗2次，氨水层加乙酸调成中性，水浴加热蒸发至近干，加水溶解，定容至5mL。

91 （3）高效液相色谱分析参考条件 ： 色谱柱：4.6mm×250mm 10µm，C18不锈钢柱。 流动相：甲醇、0.02mol/L乙酸铵溶液（pH4） 梯度洗脱： 开始：甲醇 ׃乙酸铵溶液为20 ׃ 80 5min后：甲醇 ׃乙酸铵溶液为35 ׃ 65 10min后：甲醇 ׃ 乙酸铵溶液为98 ׃ 2， 继 续7min 流速：1ml/min。 检测器：紫外检测器，波长254nm。 根据保留时间定性，外标峰面积法定量。

92 计算： A样----样品的峰面积 A标----标样的峰面积 C标----标样的浓度 V样----样品的定容体积 m样----样品的质量

93 说明及注意事项 （1）样品在加入聚酰胺粉吸附色素之前，要用20％柠檬酸调至PH至6左右，因为聚酰胺粉在偏酸性（PH4～7）条件下对色素吸附力较强，吸附较完全。 （2）如样品色素浓度太高，要用水适当稀释，因为在浓溶液中，色素钠盐的钠离子不容易解离，不利于聚酰胺粉吸附。 （3）样液中的色素被聚酰胺粉吸附后，当用热水洗涤聚酰胺粉以便除去可溶性杂质时，要求水偏酸性，防止吸附的色素被洗脱下来，使定量结果偏低。

94 （4）在提纯的样品溶液进行蒸发浓缩时，要控制水浴温度在70～ 80℃ ，使其缓慢蒸发，勿溅出皿外，另外，要经常摇动蒸发皿，防止色素干结在蒸发皿的壁上。
（5）用HPLC测定时，测定一个样品后，将流动相中的甲醇浓度恢复至20%，使之稳定20min后，再开始测定第二个样品。

95 7.7.3苏丹红的检测 苏丹红I号

96 苏丹红IV号

97 苏丹红的检测方法 GB/T19781—2005：样品经溶剂提取、固相萃取净化后，用反相高效液相色谱—紫外可见光检测器进行色谱分析，采用外标法定量。 欧盟方法：用乙腈浸泡样品， HPLC检测。 推荐条件: 色谱柱:C18 反相柱 流动相:乙腈+水(1‰乙酸)=90+10 检测波长:478 nm

98 固相萃取的一般操作

99 7.7.4 孔雀石绿的检测 欧盟于2002年6月颁布法令禁止在渔场中使用孔雀石绿。我国于2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》。 GB/T ：样品经提取、净化，用HPLC-荧光检测器检测 SN/T ：样品用快速检测前处理试剂盒中试剂提取、浓缩，用HPLC紫外可见光检测器检。

100 目前禁止使用的有毒添加剂 甲醛：酒类、肉制品、牛乳及其制品的防腐 硼砂：面条、棕子、年糕
β-萘酚：对丝状菌和酵母菌有抑制作用，掺伪者常用作酱油的防腐剂。 水杨酸：对各种微生物的生长发育有很强的抑制作用，用作防腐剂。 吊白块：甲醛合次亚硫酸氢钠，用作漂白剂。 硫酸铜：用硫酸铜于青豆、蔬菜、果汁的护绿中 黄樟素：用于食品调香中。 香豆素：香料，黑香豆酊和熏香豆浸膏主要成分为香豆素，均为禁用化学物质。

101 作 业 1.P222 第4、5、9、11、13、14、15、16题。 2.简述格里斯试剂比色法测定食品中亚硝酸盐的原理。
作 业 1.P222 第4、5、9、11、13、14、15、16题。 2.简述格里斯试剂比色法测定食品中亚硝酸盐的原理。 3.简述盐酸副玫瑰苯胺比色法测定食品中亚硫酸盐的原理。实验中有哪些注意事项？实验中用到的氢氧化钠、硫酸、氨基磺酸铵、四氯汞钠各有什么作用？ 4.重复训练亚硝酸盐、亚硫酸酸盐、防腐剂（山梨酸、苯甲酸）等项目的测定