姓名： 學號： 授課教師：蔡銘祝 報告日期：2012年04月11日

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1 姓名： 學號： 授課教師：蔡銘祝 報告日期：2012年04月11日
In vitro Antibacterial Activity of n-Hexane Fraction of Methanolic Extract of Alstonia scholaris L. R.Br. Stem Bark against Some Multidrug Resistant Human Pathogenic Bacteria 黑板樹皮的甲醇萃取之正己烷分層 對人體抗藥性致病菌抗菌活性試驗 姓名： 學號： 授課教師：蔡銘祝 報告日期：2012年04月11日

2 目錄 前言 Alstonia scholaris L. R.Br. 黑板樹 材料方法 結果討論 參考文獻 備註 -植物材料 -菌株 -萃取
-抗菌活性篩選 -藥敏試驗 -測定最低抑菌濃度測定（MIC）和最低殺菌濃度（MBC） -統計分析 結果討論 -黑板樹皮提取物的體外抗菌活性 -黑板樹樹皮對菌株活性試驗 -不同菌株的抑製作用的百分比 -結論 參考文獻 備註

3 前言 新的疾病出現使病原菌和現有微生物突變導致人類發病和死亡的可能，植物中的成份新的生物活性分子，針對病原體可作為自然療法，此外成本高昂的傳統抗菌療法，特別是在亞洲和非洲國家也必須使用以植物為基礎的自然醫學治療上。 黑板樹屬（夾竹桃科）為印度次大陸和東南亞國家的長綠喬木，植物不同部位已早被用來作為有效用的傳統藥用植物及藥材，替代藥用制度尤納尼，順勢醫療法和悉得海(泰米爾語)類型的藥用延誤保障系統的有力的植物藥。 在本研究證實了生物活性中黑板樹樹皮甲醇萃取之正己烷分層物可抑制對四種菌在對市面上抗生素的多重抗藥性之菌種。 開發抗藥性抗生素的是值得關注的議題。新的疾病出現使病原菌和現有微生物突變導致人類發病和死亡的可能，植物中的成份新的生物活性分子，針對病原體可作為自然療法，此外成本高昂的傳統抗菌療法，特別是在亞洲和非洲國家也必須使用以植物為基礎的自然醫學治療上。 黑板樹屬（夾竹桃科）為印度次大陸和東南亞國家的長綠喬木，植物不同部位已早被用來作為有效用的傳統藥用植物及藥材，替代藥用制度尤納尼，順勢醫療法和Sidhha(泰米爾)類型。 順勢醫療法和Sidhha/泰米爾類型的藥用延誤保障系統的有力的植物藥。 bronchovasodilatory，抗寄生蟲藥，止瀉，蚊，滅螺，piscicidal，antiplasmodial，antomalarial，antileishmanial，schizonticidal，抗寄生蟲藥和藥害（德伊，2011）。 由樹皮已分離出若干個植物的成分 藥理藥效的植物種類的樹皮被許多學者Gupta等人，2002年;，2009;Goyal（2010）報告。 植物粗提取物也顯示生物活性（庫卡尼和Juvekar2009年Shah等人，2010）。抗菌（，2003; Khyade Vaikos，2009年杜塔等，2010） 抗分枝桿菌（馬家婆等。，2008年），止瀉（Shahet人，2010）和抗真菌藥物（里亞茲等，2010）植物活動已報告。 本研究證實了在體外生物活性的微量正己烷甲醇提取物樹皮黑板樹可抑制對四種菌在對市面上抗生素的多重抗藥性之菌種。 研究結果贊成傳統藥材的使用的植物品種針對部分微生物 傳統的植物被用於對抗人類疾病，如哮喘，癲癇，發燒，瘧疾，腹瀉，痢疾，皮膚病，傷口，耳痛，麻風病，白帶，肝炎，毒蛇咬傷等  藥理藥效的植物品種進行了研究對於抗癌，抗炎，鎮痛藥，抗精神病藥物，傷口癒合，抗哮喘，祛痰，抗氧化，清除自由基，免疫，保肝，

4 Alstonia scholaris L. R.Br. 黑板樹
黑板樹原產於印度、馬來西亞、菲律賓、爪哇等地，也是臺灣常見的綠化樹種，然而因為它生長快速、材質鬆脆，颱風過後往往成為滿地折損的枝幹。黑板樹每年10到11月左右會開出白色的小花，葉片及汁液具有輕微的毒性。木材價格低廉，因此也被用來做為黑板或是木箱板等臨時性木材。 Kingdom Plantae 植物界 Phylum Magnoliophyta 木蘭植物門 Class Magnoliopsida 木蘭綱 　Order Gentianales 龍膽目 　　Family Apocynaceae 夾竹桃科 　　　Genus Alstonia 黑板樹屬 　　　　 Alstonia scholaris (L.) R.Br. 黑板樹

5 材料與方法 - 植物材料 (建議利用條列式或流程圖)
採用3.5歲 8 ft (2.44m)高黑板樹的莖部樹皮，2011年Sonarpur Subhashgram，於南24 Parganas，印度西孟加拉邦。

6 材料與方法 - 菌株 (建議利用條列式或流程圖)
本研究中使用四種常見的人類病原菌 　　　SN3b :大腸桿菌IK1_01 　　　SN8a :陰溝腸桿菌 　　　SN4a :志賀氏痢疾 　　　SN8b :粘質沙雷氏菌 試驗進行菌株鑑定 使用伯傑的決定性細菌學手冊(Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology )。 MR(甲基紅試驗）、 V.P. （博赫斯 - Proskauer測試）、 TSI（三糖鐵瓊脂試驗）、測試的明膠、降解澱粉、吲哚製作、 檸檬酸、氧化酶和蠕動試驗。 序列分析的16srDNA 進化分析確認試驗，確認菌種。

7 材料與方法 - 萃取 (建議利用條列式或流程圖)
先將樹皮切碎成片段後風乾在室溫（27-29°C）七天 ，在用使用研磨機粉碎到粉末。 細粉末(40目尺寸)(1公斤)浸泡置甲醇中並在室溫下（26℃）為7天三次。 過濾紙過濾(使用 Whatman No. 1 濾紙)，再以真空乾燥 40°C 成濃縮液。 天然黑板樹樹皮之甲醇萃取的準備: 懸浮於蒸餾水（100毫升）的原抽出物（125g）。 正己烷（3x100ml）產量分別為100g。 正己烷分層準備濃度為 0.05、0.1、0.25和0.5mg/ml 適量溶於殘留溶劑中。 乾燥的萃取物在 -4℃ 冷藏，以備將來使用。

8 材料與方法 – 藥敏試驗 (建議利用條列式或流程圖)
藥敏試驗於培養皿中進行 瓊脂擴散法 氨芐青黴素 ampicillin (10 μg) ; 氯黴素 chloramphenicol (30μg); 複方新諾明 co-trimoxazole (25μg); 紅黴素 erythromycin (15μg); 慶大霉素 gentamicin (10μg); 卡那黴素 kanamycin (30μg); 氟嗪酸 ofloxacin (5μg); 鏈黴素 streptomycin (10μg); 四環黴素 tetracycline (30μg); 萬古黴素 vancomycin (30μg).。 菌液在 37℃培養後獲得， 後再均勻塗抹 5 毫升 Mueller–Hinton 發酵液（MHB）（HIMEDIA） 擴散在Mueller-Hinton Agar（MHA）（HIMEDIA）4-5小時 。 在37ºC平板培養24小時，觀察抑制情形在對的抑制作用區測量直徑範圍。

9 材料與方法 – 抗菌活性篩選 (建議利用條列式或流程圖)
萃取物的抗菌活性測定瓊脂擴散法。 菌株生長在MHB震盪培養4小時，在經37℃狀態下的培養， 1 ml 培養液均塗抹在MHA培養基表面上，在使用無菌6mm的軟木螟 鑽洞接種置MHA。 以200μl的植物提取物（正己烷懸浮液）填滿了及對照組（正己烷）。 濃度使用 10、25、50和100 mg/ml。 四環素（150 μg /毫升，200μL）作為抑菌陽性對照組在ATCC(American Type Culture Collection)株大腸桿菌ATCC25922使用管制品。24小時後測量環直徑37℃培養 美國菌種保藏中心

10 材料與方法 – 最低抑菌、殺菌濃度測定 (建議利用條列式或流程圖)
測定最低抑菌濃度測定（MIC）和最低殺菌濃度（MBC） 取發酵液稀釋法對萃取物進行了MIC和MBC 準備從24小時 MHB 培養基中培養接菌後和懸浮液濁度等值作出調整 0.5 麥氏標準。 懸浮液稀釋 1:10 MHB(無菌環境下)來取得後接種 5×105 CFU/ml。 以 96 孔盤消毒準備後配藥 180 μL 接種到每孔中的發酵液。 加入20 μL的植物萃取物等分。 植物萃取物測定 濃度為0.05、0.1、0.25和0.5 mg/ml。 四環素稀釋液作為陽性對照組，同時與20 μL正己烷養液作為陰性對照。 平板覆蓋並24小時在37℃溫育培養後，辨識最低抑菌濃度（MIC） 所有孔接種置培養基中恆溫培養。 菌落形成單位（CFU，colony-forming unit） 最小殺菌濃度（MBC）定義在CFU降低99.9％

11 材料與方法 – 統計分析 值表示為平均值 ±S.D. 有統計學意義 測定用 學生 t-檢驗。 p值<0.05被認為意義。

12 結果與討論 -黑板樹皮提取物的體外抗菌活性
然而，黑板樹皮甲醇提取物微量正己烷顯示意義（P <0.05）（見表2） 瓊脂擴散法對所有菌株的抑製作用。 因此，在這項研究中的活性植物提取物對所有的多藥耐藥株的抗菌活性 ，所有這些都可以導致嚴重的臨床問題。

13 結果與討論 - 黑板樹樹皮對菌株活性試驗

14 結果與討論 - 黑板樹樹皮對菌株活性試驗 b) S. dysentery a) E. bacterium IK1_01
測定粗甲醇提取物正己烷分數對菌株的MIC和MBC，檢測濃度範圍從0.05至40毫克/毫升。 黑板樹樹皮天然萃取物正己烷分數顯示，的MIC為5.5毫克/毫升，5毫克/毫升， <5.5毫克/毫升並8毫克/毫升，致最高的85.7％，95.6％，增長89.3％和94.4％ ，對大腸桿菌的細菌IK1_01抑制、與痢疾、陰溝腸桿菌、粘質沙雷氏菌（圖1和2）， 最低殺菌濃度 提取物為12毫克/毫升，10毫克/毫升，11毫克/毫升並15毫克/毫升，分別。 c) E. cloacae d) S. marcescens

15 結果與討論 - 不同菌株的抑製作用的百分比

16 結果與討論 – 結論 在這個實驗中使用的4個菌株，在一系列人類疾病，如皮膚感染，傷口，胃腸道，尿道和呼吸道。
而這些多重抗藥治病菌均顯著被甲醇萃取之正己烷分層物抑制，因此這項研究結果，認同以植物傳統療法和替代使用對皮膚病，傷口，哮喘，腹瀉，痢疾等消化道疾病及尿路感染。 鼓勵使用天然產品，由於副作用較少或無副作用且成本低，並以合成抗生素抗性發展。 不同類型的萜類化合物， 脂肪酸和甾醇，已從植物藥正己烷提取物。 萜類化合物的抗菌活性脂肪酸（Skalicka Wozniak等人。，2010），揮發油（多爾曼和院長，2000年）和甾醇（Zhao等，2005）已展開調查。萜類化合物，脂肪酸和甾醇也已報告在A.燈檯（Wang等，2009，。Khyade和Vaikos，2009;杜塔等，2010）。

17 參考文獻 Ahmad, B., Azam, S., Bashir, S., Hussain, F., Chaudhary, M.I. (2011). Insecticidal, brine shrimp cytotoxicity, antifungal and nitric oxide free radical scavenging activities of the aerial parts of Myrsine africana L. Afr. J. Biotech., 10, Ahmad I., Aqil, F. (2007). In vitro efficacy of bioactive extracts of 15 medicinal plants against ESβL-producing multidrug-resistant enteric bacteria. Microbiol. Res., 162, Ahmad, I., Beg, A.Z. (2001). Antimicrobial and phytochemical studies on 45 Indian medicinal plants against multi-drug resistant human pathogens. J. Ethnopharmacol., 74, Akhtar, A., Rahman, M.S., Ahsan, M. (2008). Preliminary Antimicrobial and Cytotoxic Activities of n-Hexane Extract of Jatropha pandurifolia. Lat. Am. J. Pharm., 27, Etc.

18 -THE END - 謝謝指教

19 備註 - E. cloacae 腸桿菌 腸桿菌， 特別是陰溝腸桿菌是很重要的醫院病原體負責各種感染，其中包括菌血症， 下呼吸道感染， 皮膚及軟組織的感染， 尿路感染（UTIs）， 心內膜炎， 腹腔內感染， 化膿性關節炎， 骨髓炎，眼部感染。 這也導致各種區域性獲得感染，包括尿路感染，皮膚和軟組織感染，傷口感染，等等。 2012/04/11

20 備註 : S. Dysentery 志賀氏痢疾 志賀氏痢疾是革蘭氏陰性菌非孢子成形兼性厭氧，非主動行細菌，由污染的水與食物傳播，因為其強大的和致命的志賀毒素導致的最嚴重的細菌性痢疾。

21 備註 : S. Marcescens 粘質沙雷氏菌
粘質沙雷氏菌是革蘭氏陰性的物種，桿狀細菌在家族腸桿菌。 參與粘質沙雷氏菌院內感染，尤其是導管關聯的性菌血症，尿路感染和傷口感染。通常發現在住院的成人的呼吸道和泌尿道和在兒童的胃腸道系統。

22 備註 : 軟木螟 軟木螟，可切割了一個洞，在軟木或橡膠瓶塞插入玻璃管的金屬工具。軟木螟是一個空心管，錐形邊緣，一般在另一端的一些手柄。

23 備註：n-Hexane 正己烷 己烷，化學式C6H14，是烷烴中的第六個成員。 己烷是常用的非極性具汽油味的有機溶劑，被廣泛應用於色譜法中。
正己烷作為良好的有機溶劑，被廣泛使用在化工有機合成，機械設備表面清洗去污等環節。但其具有一定的毒性，會通過呼吸道、皮膚等途徑進入人體，長期接觸可導致人體出現頭痛、頭暈、乏力、四肢麻木等慢性中毒癥狀，嚴重的可導致暈倒、神志喪失、甚至死亡。

24 備註: 16S ribosomal rDNA 什麼是16S rRNA基因， 16S rRNA基因的部分是 所有的細菌和古細菌中發現原核生物的DNA。rRNA基因，並反過來這個rRNA基因編碼核糖體的一部分。在rRNA基因的第一個“R”代表核糖體。核糖體的兩個亞基，大亞基（路易斯安那州立大學）和小亞基（SSU）組成。這兩個亞基的mRNA的核糖體的翻譯，因為它通過飼料三明治。雖然也有幫助，以彌補一般核糖體的功能單位，相關蛋白，在細菌中，在SSU編碼的16S rRNA基因， 編碼和路易斯安那州立大學的23S rRNA基因和5S rRNA基因對於 s ，為什麼使用它？ 16S rRNA基因是一個常用的工具為以下幾個原因查明細菌。首先，傳統的特性取決於表型性狀喜歡的革蘭氏陽性或革蘭氏陰性桿菌或球菌等分類學家今天考慮的一個有機體的DNA分析比只對表型的分類更可靠。其次，研究人員數量的原因，要識別或分類只在一個特定的環境或醫學樣本細菌。雖然是在同源基因真核生物 18S rRNA基因，它是不同的，從而使16S rRNA基因的提取和識別為單獨的從植物，動物，真菌和原生動物DNA在同一樣品中的細菌的一個有用的工具。 第三，16S rRNA基因是相對較短，為1.5 kb的，使得它更快和更便宜，比其他許多獨特的細菌基因序列 ， 誰使用它？ 核糖體（以及相應的，他們的代碼的DNA）大多已隨著時間的推移保守，這意味著其結構變化不大，由於其重要的功能，隨著時間的推移，翻譯成蛋白質的基因。但即使在這種基因有部分已保守的比別人多。這是由於核糖體本身的結構。核糖體的褶皺，在一些地方債券本身（守恆地區）環和無粘結，而其他部分（高變區），該基因的任何部分在何種程度上是受基因突變的方式各不相同。

25 備註 : McFarland standard
麥氏標準作為參考來調整菌懸液的濁度，使細菌的數量將是一個給定的範圍內使用。 麥氏濁度儀標準 Original McFarland standards were mixing specified amounts of barium chloride and sulfuric acid together. Mixing the two compounds forms a barium sulfate precipitate, which causes turbidity in the solution. A 0.5 McFarland standard is prepared by mixing 0.05 mL of 1.175% barium chloride dihydrate (BaCl2•2H2O), with 9.95 mL of 1% sulfuric acid (H2SO4). Now there are McFarland standards prepared from suspensions of latex particles, which lengthens the shelf life and stability of the suspensions. The standard can be compared visually to a suspension of bacteria in sterile saline or nutrient broth. If the bacterial suspension is too turbid, it can be diluted with more diluent. If the suspension is not turbid enough, more bacteria can be added. 原麥氏標準氯化鋇和硫酸混合指定金額。這兩種化合物混合形成硫酸鋇沉澱，從而導致溶液中的濁度。 0.5麥氏標準由1.175％二水氯化鋇（BaCl2的•2H2O）0.05毫升，9.95毫升1％硫酸（H2SO4）混合準備。 現在有乳膠顆粒的懸浮液，延長保質期和穩定的懸浮準備麥氏標準。標準可以比較直觀的細菌懸浮在無菌生理鹽水或營養肉湯。如果太渾濁的菌懸液，它可以與更多的稀釋劑稀釋。如果中止不渾濁不夠，可以添加更多的細菌。