半薄/超薄切片技术 董 凤 琴 2010-3.

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1 半薄/超薄切片技术 董 凤 琴 2010-3

2 背景： 肉眼 光学显微镜 透射电镜 0.2mm 0.2µm 0.2nm 可观察头发丝、双面刀刀刃的厚度 可观察细胞的结构
分辨率 0.2mm 0.2µm 0.2nm 应用范围 可观察头发丝、双面刀刀刃的厚度 可观察细胞的结构 (最大有效倍数:1000) 可观察细胞内的结构,分辨DNA、蛋白质等生物大分子、单个金属原子（放大倍数可达百万倍） 观察半薄切片 观察超薄切片

3 半薄切片 ？ 超薄切片

4 一、超薄切片技术介绍

5 超薄切片的基本要求: 固定地好 渗透包埋地好 切地好 载网膜做地好 染地好

6 超薄切片主要步骤 ★取材 ★固定 ★漂洗、脱水 ★渗透、包埋 ★超薄切片 ★超薄切片染色 每一步都是关键,任何环节的疏忽都会导致制片的失败

7 1 取材 1.1 取材的基本要求 (1)动作迅速，取材后快速放入固定液中；
1.1 取材的基本要求   (1)动作迅速，取材后快速放入固定液中； (2)体积要小，一般1㎜3，如果来不及，例如野外取材，也可将组织修成（1×1×2）mm大小长条形，之后再进行分割。 (3)减小损伤，切割器械锋利，操作轻，避免牵拉、挫伤与挤压组织。 (4)低温操作，最好在低温(0℃～4℃)下进行，降低酶的活性。所用器具和固定液都应预冷。 (5)取材部位要准确。 组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。――糖葫芦

8 1.2 取材方法 材料放在洁净的韧性较大的纸上 滴上预冷的固定液 用刀片将组织切下并修小 用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷的固定液的小瓶中。 植物材料的取材可以先切成薄片，经适当固定后再切成小方块继续固定。

9 2 固定 (抽气) 2.1 固定的目的 ︾ 采用物理、化学等方法迅速杀死细胞的过程称之为固定。
2 固定 (抽气) 2.1 固定的目的 ︾ 采用物理、化学等方法迅速杀死细胞的过程称之为固定。 ︾ 目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以及大分子结构保持生活状态，牢固地固定在它们原来所在的位置上，不发生位移。 ︾ 良好的固定是获得精细结构的形态学图象的关键。

10 2.2 常用固定剂 (1)四氧化锇 (OsO4)-- OSMIUM TETRAOXIDE
※强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，可较好的固定脂肪、蛋白质、磷酸脂蛋白； ※固定变性DNA及核蛋白，不能固定天然DNA、RNA及糖原； ※具有固定和电子染色双重作用，样品图象反差较好； ▼酶的钝化剂，不适合细胞化学的固定； ▼与乙醇/醛类反应生产沉淀－－漂洗 ●分子较大,渗透速度缓慢,但反应迅速,均匀固定深度0.25㎜； ●固定时间一般为1-2小时,时间太长易使组织变脆,切片困难； ●锇酸固定液常用浓度：1％－2％; 极易挥发，对粘膜、角膜毒性极大,操作要十分小心!

11 (2)戊二醛 (  C5H8O2)--glutaraldehyde
※有效保存组织细微结构,对蛋白质的固定效果好； ※渗透力强,渗透速度快,较好的固定糖原、核蛋白、微管、内质网和细胞基质、有丝分裂的纺锤丝及胞饮小泡等； ※保存某些酶的活力,较好保存抗原,适于细胞化学研究； ※对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强，均匀固定深度:0.5~1mm ,0－4℃可长时间固定(几周甚至1～2个月)不会使组织变脆，可用于远离实验室的取材; ▼缺点:不能保存脂肪，磷脂固定效果差，对细胞膜的显示较差，没有电子染色作用。

12 (3)甲醛-Formaldehyde ※渗透组织的能力比戊二醛强，对于致密组织（种子）固定作用好； ※细胞精细结构保存质量不如戊二醛，但酶活性的保存优于戊二醛； ▼缺点：不能较好的固定细胞基质，脱水后大部分细胞基质将丢失； ＊常用多聚甲醛－戊二醛的混合固定液。

13 (4)高锰酸钾 ※强氧化剂，较好固定脂蛋白; ※对神经髓鞘、叶绿体及其他各种膜结构的研究均可作为固定剂； ※只用于某些常用固定剂难以固定的植物和酵母样品，且一般不需要用锇酸后固定.

14 3漂洗、脱水 3.1漂洗 漂洗的目的: ☆组织固定后脱水前的漂洗:
清除残留固定剂,减小固定剂和脱水剂之间的反应，避免沉淀物干扰超微结构的观察. ☆双重固定中,在锇酸固定前的漂洗: 避免锇酸与戊二醛反应生成细小而致密的饿沉淀，破坏细胞结构.

15 常 用 缓冲液 优 点 缺 点 pH 磷酸盐缓冲液 对细胞无毒性作用,缓冲能力强 固定时易产生沉淀,易长细菌 植物材料一般6.8~7.2 二甲砷酸盐缓冲液 不易长细菌,与低浓度钙质1-3mM不发生沉淀反应 有毒(通风橱) 醋酸－巴比妥缓冲液 固定时不产生沉淀 易长细菌,只适于配锇酸固定液,不适合配醛类(缓冲失效)

16 3.2 脱水 目的 将组织内的游离水彻底清除,保证包埋介质完全渗入组织内部。 方法 用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水,常用的脱水剂是乙醇和丙酮。

17 注意事项 脱水梯度逐级进行, 急剧脱水会引起细胞收缩。（ 30% →50%→70%→80%→95%→100%→100%）;
更换溶液动作要快。长时间暴露空气中会在组织内外产生微小气泡，影响渗透； 脱水过程中应在70%脱水剂中4℃停留或过夜,过度脱水不仅引起更多物质的抽提，而且会使样品发脆，造成切片困难; 置换用脱水剂：环氧丙烷（Epon812）、二甲苯（石蜡）。

18 4 渗透和包埋、聚合 4.1渗透 渗透就是利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂的过程。
包埋剂在单体状态时(聚合前)为液体，能够渗入组织内，当加入某些催化剂，经加温或其他条件，能聚合成固体，以便进行超薄切片。

19 4.2 包埋、聚合 包埋操作： 将组织块包埋在多孔橡胶包埋模板中或胶囊中，一定条件下可聚合硬化，形成包埋块。 包埋管 胶囊 1 包埋板

20 常用的包埋剂

21 ◆环氧树脂(epoxy resin) 吸潮性很强，潮湿和炎热的环境下，树脂会变软 渗透效果好，切片的图像对比度强，电子束照射下稳定
Epon812 渗透效果好，切片的图像对比度强，电子束照射下稳定 吸潮性很强，潮湿和炎热的环境下，树脂会变软 Spurr 黏度低，可较好地渗透具有硬的木质化细胞壁的植物细胞、脂肪含量很高的内胚乳、高度液泡化的成熟果实,电子束照射下稳定 图像对比度较弱 Araldite 聚合均匀，收缩量很小，超薄切片可直接沾在没有支持膜的载网上，电子束照射下十分稳定，用重金属染色时易着色。

22 ◆水溶性树脂－丙烯酸类树脂 LR White、 Lowicryls、GMA、PEG 等，适于进行组织化学和细胞化学研究的样品制备。
适于低温包埋，通常用于免疫电镜样品的制备。

23 包埋操作中的注意事项 §所有试剂要防潮，最好存放在干燥器中； §所用器皿应烘干； §配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀； §包埋时动作要轻巧，防止产生气泡； §盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净. §皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；

24 5 超薄切片 5.1修块 削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水平面成45度的角度削去包埋剂，修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形，每边的长度为0.2mm～0.3mm。

25 5.2 超薄切片     超薄切片机：LEICA ULTRACUT R 超薄切片厚度: <100nm,一般 50-70nm

26 5.3 载网和支持膜 载网(超薄) 载网 铜网 (常用) 不锈钢网 镍网 (免疫电镜)

27 直径：2-3mm，厚度： mm

28 5.3 载网和支持膜 (2) 载网支持膜 膜的要求:透明无结构,并能承受电子束的轰击. 支持膜的种类: 火棉胶膜
聚乙烯醇缩甲醛膜(formvar膜) 碳膜 膜的厚度:10nm～20nm

29 6 超薄切片的染色 目的: 增强样品的反差,提高图象的清晰度. 常用染色剂: 重金属盐 各种染料

30 ▲超薄切片染色 常用的染色剂: 醋酸铀和柠檬酸铅。 染色方法： (1) 组织块染色
在脱水至70%乙醇时，将组织块放在用70%乙醇配制的饱和醋酸铀溶液中，染色时间2小时以上，或在冰箱中过夜。 

31 (2)超薄切片后染色 醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染 铀染:细胞核及结缔组织染色 铅染:提高细胞质成分的反差

32 1）前固定（固定液体积是固定材料的十倍以上，材料不堆积） 2）漂洗： 0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次
3%戊二醛 in 0.1M PBS ,ph7.2，室温5-6h，后4°C保存 2）漂洗： 0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次 3）后固定 1%锇酸固定 in 0.1M PBS，4°C overnight 4）漂洗： 0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次 5）系列脱水：30%-50%-70%（4°C, overnight,可以停下）-80%-95%-100%-100%） 用丙酮置换乙醇： 乙醇:丙酮=1:1，纯丙酮2次， 每级20-30分钟 6）渗透 丙酮:树脂=2:1， 1:1（可以停下了，overnight） ，1:2 2-3h/级 纯树脂12h， 换纯树脂12h （从进入树脂开始更要严格防潮！） 7）包埋聚合 °C 24hr 注意：免疫电镜时不用锇酸固定，树脂换成LRWhite等水溶性树脂，固定液可以是1.25%戊二醛+1.25%多聚甲醛 in 0.1M PBS Ph 7.2

33 超薄切片图片

34 二、半薄切片技术介绍

35 半薄切片主要步骤 ★取材 ★固定 ★漂洗、脱水 ★渗透、包埋 ★半薄切片 ★半薄切片染色 每一步都是关键,任何环节的疏忽都会导致制片的失败

36 ※一般固定根、茎、叶、花药、子房组 织切片。
FAA固定液 （福尔马林5-冰醋酸5-70%酒精90）半薄/石蜡切片 ※一般固定根、茎、叶、花药、子房组 织切片。 ※幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，防止材料收缩； ※加入5%甘油可防固定液蒸发和材料变硬。

37 卡诺固定液 1 2 纯酒精 15ml 30ml 氯仿 5ml 冰醋酸 1ml
渗透迅速，固定根尖和花药只需30-60分钟，但固定时间不能太久，一般不超过一天

38 半薄切片 切片厚度：0.5~5um 切片捞到载玻片上

39 ▲半薄切片染色 染色方法 现 象 番红－固绿对染法 木质化的细胞壁及细胞核－红 纤维素的细胞壁及细胞壁－绿 铁矾苏木精法
现 象 番红－固绿对染法 木质化的细胞壁及细胞核－红 纤维素的细胞壁及细胞壁－绿 铁矾苏木精法 细胞一般结构及细胞分裂时期的优良染剂，细胞分裂时期的染色体染成黑色 高碘酸－席夫反应法 （PAS法） 植物组织染成不同程度的红色，可将纤维素细胞壁及淀粉粒染成红色

40 染料介绍 细胞壁的染料 酸性品红 番红 固绿 甲苯胺蓝 苏木精 结晶紫 亮绿 苏丹IV 细胞核染料（碱性）
碱性品红 苏木精 洋红 番红 地衣红 结晶紫 细胞质染料（酸性） 酸性品红 甲苯胺蓝 曙红 固绿 苦味酸 各种荧光染料 染色原则：先用碱性染料染再用酸性染料染

41 半薄切片：免疫荧光 （LRWhite包埋）

42 半薄切片图片

43 三、刀具介绍 玻璃刀

44 钻石刀

45 超薄切片机 型号：LEICA ULTRACUT R

46 谢谢！