第十章 发酵产物的提取与精制方法.

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1 第十章 发酵产物的提取与精制方法

2 第一节 萃取 萃取：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质的得到纯化或浓缩的方法 根据参与溶质分配的两相不同分类：
第一节 萃取 萃取：利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质的得到纯化或浓缩的方法 根据参与溶质分配的两相不同分类： 液固萃取、溶媒萃取、双水相萃取、反胶团萃取、超临界萃取

3 一、溶媒萃取法 1、溶媒萃取的基本原理 利用该物质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的不同，使之从一种溶剂转入另一种溶剂，从而使杂质去除
萃取效率是以分配定律为基础的

4 Nernst 分配定律（1891）：在一定温度下，当某一溶质在两种互不相溶的溶剂中分配达到平衡时，则该溶质在两相中的浓度之比为一常数，称为分配系数。
对萃取操作来讲：萃取相和萃余相中溶质的浓度之比就是分配系数；用K表示。 在达到平衡时，设溶质在萃取相中浓度为CA ；在萃余相中为CB 。则：

5 2、常用溶媒萃取的工艺 （1）单级提炼法 混合器 溶剂 发酵液 分离器 提取液 残余液

6 （2）多次提炼法 混合器 溶剂 发酵液 分离器 提取液 残余液

7 （3）、多级对流萃取 第 一 混 合 器 分 离 二 三 最后提取液 提取液 残余液 最后残余液 溶剂 发酵液 一级 二级 三级 A 70%

8 3、影响溶媒萃取的主要因素 (1)乳化与去乳剂 乳化：液体分散在另一不相溶的液体中的分散体系 乳浊液的形式：水包油、油包水
常用的去乳化的方法：过滤和离心、加热、稀释法、加电解质、吸附法、顶替法、转型法 常用去乳剂：阳离子表面活性剂（溴代十五烷基吡啶） 阴离子表面活性剂（十二烷基硫酸钠）

9 带溶剂是指这样一种物质，能和被萃取物质形成复合物而易溶于溶媒中，形成的复合物在一定条件下又容易分解
（2）pH值 红霉素在pH9.8时，在乙酸戊酯与水相间的分配系数等于44.7，而在pH5.5时，红霉素在水相与乙酸戊酯间的分配系数等于14.4。 （3）温度 （4）盐析 （5）带溶剂 带溶剂是指这样一种物质，能和被萃取物质形成复合物而易溶于溶媒中，形成的复合物在一定条件下又容易分解 例如：链霉素在中性下能与二异辛基磷酸酯结合，从而在水相萃取到三氯乙烷中，然后在酸性下再萃取到水相

10 二、双水相萃取 1、发展历史 始于20 世纪60年代,从1956 年瑞典伦德大学Albertsson 发现双水相体系
1979 年德国GBF 的Kula 等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离 国内自20世纪80 年代起也开展了双水相萃取技术研究。

11 2、双水相的形成 将两种不同的水溶性聚合物（或盐溶液）的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值，体系会自然的分成互不相溶的两相，这就是双水相体系 形成原因：由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有差异，混合时就可发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离的倾向也就大。

12 3、常用的双水相体系 高聚物/高聚物体系：聚乙二醇(简称PEG) / 葡聚糖(简称Dextran) 和PEG/ Dextran

13 4、双水相相平衡关系

14 5、影响物质分配平衡的因素 （1）聚合物及其分子量的影响 不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水性，水溶液中聚合物的疏水性按下列次序递增:
葡萄糖硫酸盐< 甲基葡萄糖< 葡萄糖< 羟丙基葡聚糖< 甲基纤维素< 聚乙烯醇< 聚乙二醇< 聚丙三醇

15 同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加，其大小的选择依赖于萃取过程的目的和方向，在PEG/DEX系统中，蛋白质的分配系数随着DEX相对分子量的增加而增加。若想在上相获得较高的蛋白质收率，对于PEG聚合物，应降低它的平均分子量，相反，若想在下相获得较高的蛋白质收率，则平均分子量应增加。

16 （2） pH 值的影响 改变两相的电位差 如体系pH 值与蛋白质的等电点相差越大，则蛋白质在两相中分配越不均匀。

17 （3）离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响
在双水相聚合物系统中，加入电解质时，其阴阳离子在两相间会有不同的分配。同时，由于电中性的约束, 存在一穿过相界面的电势差(Donnan 电势) ,它是影响荷电大分子如蛋白质和核酸等分配的主要因素。同样，对于粒子迁移也有相似的影响，粒子因迁移而在界面上积累。故只要设法改变界面电势，就能控制蛋白质等电荷大分子转入某一相。

18 （4）温度的影响 分配系数对温度的变化不敏感
成相聚合物对蛋白质有稳定化作用,所以室温操作活性收率依然很高,而且室温时粘度较冷却时(4 ℃) 低,有助于相的分离并节省了能源开支。

19 5、双水相萃取技术的特点 (1) 系统含水量多达75 %～90 % ,两相界面张力极低(10 - 7～10 – 4 N·m - 1) ,有助于保持生物活性和强化相际间的质量传递 (2) 分相时间短(特别是聚合物/ 盐系统) ,自然分相时间一般只有5～15min。 (3) 双水相分配技术易于连续化操作。

20 (4) 目标产物的分配系数一般大于3 ,大多数情况下,目标产物有较高的收率。
(5) 大量杂质能够与所有固体物质一起去掉,与其它常用固液分离方法相比,双水相分配技术可省去1～2 个分离步骤,使整个分离过程更经济。 (6) 设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问题。

21 6、双水相萃取的工艺流程 双水相萃取技术的工艺流程主要由三部分构成:目的产物的萃取; PEG的循环; 无机盐的循环。

22 7、双水相的应用举例 分离和提纯各种蛋白质(酶） 用PEG/ -(NH4) 2SO4 双水相体系,经一次萃取从α- 淀粉酶发酵液中分离提取α - 淀粉酶和蛋白酶, 萃取最适宜条件为PEG1000 ( 15 %) -(NH4) 2SO4 (20 %) ,pH = 8 ,α- 淀粉酶收率为90 % ,分配系数为19. 6 ,蛋白酶的分离系数高达15. 1。比活率为原发酵液的1. 5 倍,蛋白酶在水相中的收率高于60 %。

23 提取抗生素和分离生物粒子 采用PEG/ Na2HPO4 体系提取丙酰螺旋霉素，最佳萃取条件是pH= 8. 0～8. 5 ， PEG2000 (14 %) / Na2HPO4 (18 %) ,小试收率达69. 2 % ,对照的乙酸丁酯萃取工艺的收率为53. 4 %

24 双水相和其他方法的集成 A、与温度诱导相分离的集成 B、磁场增强双水相 C、超声波加强的双水相 D、亲和沉淀的集成

25 三、反胶团（胶束）萃取 1、定义 反胶束或称逆胶束(Reversed micelle) 是指当有机溶剂中加入表面活性剂并令其浓度超过某临界值时，表面活性剂便会在有机溶剂中形成一种稳定的大小为毫微米级的聚集体。 在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核。此极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解水后，就形成了“水池” 。

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28 （4）其他（有机溶剂、助表面活性剂、温度）
2、 影响反胶团萃取的因素 （1）溶液的pH pH影响蛋白质的电荷数量和电荷性质 （2）溶液的离子强度 影响微胶团的静电状态 凡是对蛋白质所含电荷有影响的因素，如pH，以及对反胶束的静电状态有影响的因素，均能改变蛋白质的增溶作用。 （3）表面活性剂的浓度和种类 （4）其他（有机溶剂、助表面活性剂、温度）

29 3、应用举例 纯化和分离蛋白质　 如对于溶菌酶和肌红蛋白的混合溶液(两种蛋白质相对分子量相近,等电点分别为11. 1 和6. 8） ,用二烷基磷酸盐/ 异辛烷反胶束溶液萃取,并用缓冲液将混合液的pH 值调至9. 0 ,则溶菌酶完全进入有机相中,而肌红蛋白则留在水相.

30 四、超临界流体萃取 超临界流体是处于临界温度和临界压力以上，介于气体和液体之间的高密度流体。在临界温度以上压力不高时与气体性质相近，压力较高时则与液体性质更接近，由此形成的超临界流体的性质介于汽液两相之间，并易于随压力调节的特点。                                                                                                                                             

31 1、超临界流体（SCF）的特性 物质状态 密度（g/cm3） 粘度(g/cm/s) 扩散系数(cm2/s ) 气态 (0.6-2) ×10-3 (1-3) ×10-4 液态 (0.2-3) ×10-2 (0.2-2) ×10-5 SCF (1-9) ×10-4 (2-7) ×10-4 由以上特性可以看出，超临界流体兼有液体和气体的双重特性，扩散系数大，粘度小，渗透性好，与液体溶剂相比，可以更快地完成传质，达到平衡，促进高效分离过程的实现。

32 2、超临界流体萃取原理 超临界萃取是利用SCF作为萃取剂，从液体和固体中萃取出特定成分，以达到某种分离的目的。
一般说来，物质的溶解能力与其密度成正比关系。所以，在临界点附近，温度和压力的微小变化往往会导致溶质的溶解度发生几个数量级的变化。利用超临界流体的这个性质进行分离操作效果奇佳，而且过程无相变，能耗较低。因此，超临界流体已突破了一般流体的范畴。

33 常见的超临界流体 CO2、氨、乙烯、乙烷、丙烷、丙烯、乙醇、丁醇、水等 由于CO2的临界温度、临界压力较易达到，而且化学性质稳定，无毒、无臭、无色、无腐蚀性，容易得到较纯产品，因此是最常用的超临界流体。

34 3、某些常用流体的物理特征

35 4、超临界流体萃取设备 SFE的基本流程是：由钢瓶提供高纯液体（CO2）经高压泵系统，流入保持在一定温度（高于Tc）下的萃取池。在萃取池中可溶于SCF的溶质扩散分配溶解在SCF中，并随SCF一起流出萃取池，经阻尼器减压获升温后进入收集器，多余的SCF排空或循环使用。

36 5、超临界流体萃取的典型流程及应用 1. 超临界流体萃取的典型流程 (1) 等温法 (2) 等压法 T1=T2 P1>P2
(1) 等温法 (2) 等压法 1 3 P1 2 4 T1<T P1=P2 1—萃取槽； 2—加热器； 3—分离槽； 4—泵；5—冷却器 P2 T2 T1 5 溶质 1 3 P1 2 4 T1=T P1>P2 1—萃取槽； 2—膨胀阀； 3—分离槽； 4—压缩机 T1 T2 P2 溶质

37 超临界萃取的三种典型流程 (3) 吸附法 T1=T2 P1=P2 1—萃取槽； 2—吸附剂； 3—分离槽； 4—泵； P1 P2 T1 1

38 6、应用举例

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40 作业： 什么叫双水相萃取，影响双水相萃取的因素有哪些 什么是反胶团，影响反胶团萃取的因素有哪些 超临界流体萃取的原理是什么

41 第二节 吸 附 吸附的原理 吸附平衡 吸附剂的种类 吸附的操作方式

42 一、概述 吸附：一种物质从一相移动到另外一相的现象。 吸附法的特点： （1）处理能力较小 （2）对溶质的作用较小
（3）可直接从发酵液中分离所需的产物 （4）溶质和吸附剂之间的相互作用及吸附平衡关系通常为非线形关系

43 二、吸附的原理及目的 原理： 利用吸附剂与杂质、色素物质、有毒物质、抗生素之间的分子引力而吸附在吸附剂上
原理： 利用吸附剂与杂质、色素物质、有毒物质、抗生素之间的分子引力而吸附在吸附剂上 目的： 吸附发酵产品、除去发酵液中的杂质或色素物质、有毒物质等 优点：操作简单、原料易得，便于土法生产 缺点：吸附性能不稳定、选择性不高、吸附剂的容量有限、收率不稳定、不能连续操作，强度大

44 三、吸附平衡 吸附平衡是指在一定温度和压力下，气固或液固两相充分接触，最后吸附质在两相中达到动态平衡；也可以是含有一定量的吸附质的惰性流体通过吸附剂固定床层，吸附质流动相和固定相中反复分配，最后在动态下达到稳定的动态平衡

45 吸附等温线： 在一定T下，q（吸附质浓度）随平衡浓度C变化的曲线（q=f(C)）叫吸附等温线。用数学公式描述则叫吸附等温式。

46 四、吸附剂的种类 1、疏水或非极性吸附剂 （1）颗粒密度小，表面积大 （2）颗粒大小均匀 （3）吸附能力大，但要容易洗脱下来
吸附剂必须具备的条件： （1）颗粒密度小，表面积大 （2）颗粒大小均匀 （3）吸附能力大，但要容易洗脱下来 1、疏水或非极性吸附剂 活性炭是疏水性的物质、它最适宜从极性溶媒，尤其是水溶液中吸附非极性物质。吸附芳香族化合物的能力大于无环化合物。 由于活性炭作为吸附剂的选择件差。故应用抗生素的提取和精制时，单级吸附不能使抗生素纯度提高很多，只是用于抗生素的初步提炼，除去溶液中的色素。

47 2、亲水或极性吸附剂 适用于非极性或极性较小的溶媒。如硅胶、氧化铝，活性土皆属此类。
另外，吸附剂可以是中性、酸性或碱性。碳化钙、硫酸镁等属中性吸附剂。氧化铝、氧化镁等属碱性吸附剂。酸性硅胶、铝硅酸属酸性吸附剂。 碱性的吸附剂适宜于吸附酸性的物质，而酸性的吸附剂适宜干吸附碱性的物质。氧化铝及某些活性土为两性化合物，因为经酸或碱处理后很容易获得另外的性质。

48 各种有机离子交换树脂也是属于极性吸附剂，因为它是两性化合物，具有离子交换剂的性质。工业发酵中常用于发酵产品的脱色和分离杂质。
3、各种离子交换树脂吸附剂 各种有机离子交换树脂也是属于极性吸附剂，因为它是两性化合物，具有离子交换剂的性质。工业发酵中常用于发酵产品的脱色和分离杂质。

49 五、吸附操作方式 静态吸附 被处理液与吸附剂搅拌混合，而被处理液没有自上而下流过吸附剂的流动，这种吸附操作叫静态吸附。 动态吸附
被处理液通过吸附剂自上向下流动而进行吸附。

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53 第三节 离子交换法 一、基本原理 树脂的活性基团能与溶液中的相同电性基团相交换，该交换是经过一系列的物理、化学过程完成的，包括吸附、吸收、穿透、扩散、离子交换、离子亲和等过程，有关理论介绍如下。

54 1、物理吸附 物体表面具有表面自由能，其自由能变化的趋势是向减少方向进行的。当表面因吸附某些物质后，其表面自由能降低，体系趋于稳定状态。
树脂具有巨大的比表面积，其进行离子交换时，首先是吸附作用，将交换物吸附到树脂表面。

55 2、晶格理论

56 3、双电层理论

57 4、膜理论 可理解为分子筛，能对分子、离子进行大小分级。
离子交换树脂根据交联度大小不同，具有大小不同的孔隙，对进入树脂颗粒内部的离子起到从离子大小上进行限制的筛分作用。根据静电作用规律，能进入树脂内部的离子是能穿过树脂孔隙的带电与树脂可交换离子带同号电荷的离子。

58 二、离子交换树脂的结构 1、化学结构：不具活性的网络骨架和分布于这种网络骨架上的单分子活性基团构成 2、立体交联结构： 3、孔结构：
比如：苯乙烯形成网的直链，其上带有可离解的磺酸基，二乙烯苯将直链交联起来成网状

59 三、分类 1、阳离子交换剂 强酸型、中酸型、弱酸型 2、阴离子交换剂 强碱性、中强碱性、弱碱性 3、两性离子交换剂
4、选择性离子交换树脂（螯合型离子交换树脂） 5、吸附树脂 6、电子交换树脂（氧化还原树脂）

60 四、离子交换树脂的理化性能 1、颗粒度：颗粒小，交换速度大 2、含水量：树脂通常是亲水的 树脂交联度小，内部空隙率大，含水量大 3、密度
干真密度 ：即干燥状态下树脂合成材料本身的密度 湿真密度 ：树脂充分膨胀后，树脂颗粒本身的密度 湿真密度＝树脂湿重/树脂颗粒所占体积 视密度 ： 树脂充分吸水膨胀后的堆积密度 视密度 ＝树脂湿重/树脂层的体积

61 4、膨胀性 交联度小的树脂，膨胀性大 5、耐磨损强度：每年3%-7% 6、耐热性 7、交换容量 （1）理论交换容量 单位重量或单位体积树脂中所含有可交换离子的物质的量，mmoL/g干树脂 mmol/mL湿树脂表示 （2）工作交换量 在一定操作条件下，离子交换树脂所能利用的交换容量 工作交换量受柱长度、树脂颗粒度、离子性质、浓度、流速及交换基团等影响

62 五、离子交换树脂的选择性 1、晶体解离的难易决定了组成晶体的离子间引力的大小 2、取代交换剂中离子的难易又取决于溶液中可交换离子的浓度
3、离子和树脂间亲和力越大，就越容易被吸附 电性越大越容易交换：Na＋<Ca2＋<Al3+ 在常温、常压下低浓度溶液中的离子、原子价相同，则交换量随交换离子的原子序数的增加而增大

63 4、在低温和普通温度时，离子的化合价越高，就越易吸附
二价金属离子比一价金属离子容易吸附、三价的又比二价的容易 5、溶液的pH值对各种树脂的影响是不同的

64 六、影响离子交换速度的主要因素 （1）树脂颗粒：越小，交换速度越快 （2）树脂的交联度：越低，扩散越容易，速度越快
（3）溶液中离子浓度：在一定范围内增加能加快交换速度 （4）温度：提高温度加快交换速度 （5）离子的大小：小离子的交换速度快 （6）离子价 ：离子价大的比离子价小的吸附速度慢 （7）树脂的强弱：强的比弱的快 （8）树脂层装填的松紧度：疏松利于扩散，提高交换速度

65 七、离子交换操作方式 1、静态法 2、动态法 考察上样量、pH、速度、洗脱剂的种类、流速等的影响 八、应用举例 谷氨酸的提取

66 第四节 膜分离

67 膜分离的分类及原理 膜的种类 膜分离设备 影响膜分离的因素 膜分离在发酵工程中的应用

68 膜分离法实际上是一般过滤法的发展和延续。一般过滤法不是分子级水平的，它是利用相的不同将固体从液体或气体中分离出来；而膜分离是分子级水平的分离方法，该法关键在于过程中使用的过滤介质：膜。

69 一、膜分离法的分类及原理 透析、超滤及反渗透、微滤、电渗析、液膜技术、气体渗透、渗透蒸发

70 分离范围

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72 1、透析 利用具有一定孔径大小、高分子溶质不能透过的亲水膜将含有高分子溶质和其他小分子溶质的溶液（左侧）与纯水或缓冲液（右侧）分隔，由于膜两侧的溶质浓度不同，在浓差的作用下，左侧高分子溶液中的小分子溶质透向右侧，右侧中的水透向左侧，这就是透析 透析膜 小分子 水 大分子 透析原理

73 2、超滤和微滤： 超滤和微滤都是利用膜的筛分性质，以压差微传质推动力，用于截留高分子溶质或固体微粒。

74 超滤：处理不含固形成分的料液，它是根据高分子溶质间或高分子与小分子溶质之间相对分子质量的差别机械分离的方法
微滤：用于悬浮粒的过滤，主要用于菌体的分离和浓缩 德阳某生化公司纳滤膜设备

75 3、反渗透 促使水分子透过的推动力称为渗透压 操作压力：几十个大气压 适用于1nm以下小分子的浓缩

76 莱特莱德9吨/H反渗透纯净水处理设备 10T/H工业反渗透设备

77 广东某皮革厂反渗透设备 上海某化工厂纯水设备

78 4、电渗析 利用分子的荷电性质荷分子大小的差别进行分离的膜分离法，可用于小分子电解质（例如氨基酸、有机酸）的分离和溶液的脱盐

79 5、渗透气化 疏水膜的一侧通入料液，另一侧抽真空或通入惰性气体，使膜两侧产生溶质分压差。在分压差的作用下，料液中的溶质溶于膜内，扩散通过膜，在透过侧发生气化，气化的溶质被膜装置外设置的冷凝器冷凝回收。 发生了相变 适用于：高浓度混合物的分离，特别适用于共沸物和挥发度相差较小的双组分溶液的分离

80 6、液膜分离技术 液膜通常由膜溶剂、表面活性剂、流动载体、膜增强添加剂组成。 膜溶剂：成膜的基体物质、一般为水或有机溶剂 表面活性剂：降低液膜的表面张力，对液膜的稳定性、渗透速度、分离效率和膜的重复使用有直接影响 流动载体：选择性迁移指定溶质或离子，常为某种萃取剂

81 乳化液膜和支撑液膜 分离机理： 单纯迁移：溶解度和扩散度不同 促进迁移：和溶质发生反应

82 二、膜的种类及特性 1、膜的种类 选择膜应考虑的因素：分离能力；分离速度；抵抗化学、细菌和机械力的稳定性；膜材料的成本 （1）均质膜或致密膜
（2）微孔膜：孔径（0.02~10μm ）包括多孔膜和核孔膜 （3）非对称膜：由表面活性层（0.1~1.5 μm）和支撑层组成（50~250 μm ） （4）复合膜：一种以上的膜材料制备而成 （5）离子交换膜：阳离子和阴离子交换膜，多为均质膜

83 2、膜的结构特性 （1）孔道结构：不对称膜（表面活性层和惰性层） （2）膜的孔道特性：孔径、孔径分布、孔隙率
（3）水通量:在一定条件下（一般压力为0.1MPa，温度为20℃）通过测量透过一定量纯水所需的时间来测定

84 三、膜分离设备

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86 四、影响膜分离速度的因素 1、操作形式 2、流速 3、压力 4、料液浓度

87 五、膜的污染与清洗 1、膜污染的原因 （1）凝胶极化引起的凝胶层 （2）溶质在膜表面的吸附层 （3）膜孔堵塞 （4）膜孔内的溶质吸附
2、常用的清洗剂 水、盐溶液、稀酸、稀碱、表面活性剂、络合剂、氧化剂、酶液

88 六、应用举例 超滤用于除去葡萄酒中热变性蛋白质、 微滤除去葡萄汁中的细菌和各种固体颗粒

89 【实例一、膜－生物反应器在食品废水处理中的应用】沈阳统一集团食品废水处理（1000T/D） 1、处理工艺：废水→细筛机→除油池→调节池→兼氧池→膜生物反应器→消毒池→回收水池

90 2、运行条件 ※ 膜生物反应池水利停留时间：8～9小时 ※系统气水比：40～50 : 1 ※膜生物反应池溶解氧：3～4mg/L ※膜生物反应池MLVSS：8000～11000mg/L

91 ★ 组件形态：外压式 ★ 膜材料：改性聚砜 ★ 截留分子量：6000 ★ 允许温度：0--45℃ ★ PH值范围：1---14
【实例二、凯洁超滤膜在酶试剂浓缩分离中的应用】　　四川彭州某生物公司根据实际生产情况，每天60吨发酵液需要在10小时内处理完成，单套超滤系统总处理量为6吨/小时共2套，根据所需分离料液的分子量(6000)，确定使用2台超滤主机，每台主机配备30根KJ-UF6040W-PS超滤膜柱。 　　 ★ 组件形态：外压式 　　★ 膜材料：改性聚砜　　 　　★ 截留分子量：6000　　 　　★ 允许温度：0--45℃ 　　★ PH值范围： 　　　

92 工艺流程

93 又叫 凝胶过滤、凝胶层析、凝胶渗透层析、排阻渗透层析、分子筛过滤等
第五节 凝胶 层析法 又叫 凝胶过滤、凝胶层析、凝胶渗透层析、排阻渗透层析、分子筛过滤等

94 一、凝胶层析的原理 将具有分子大小网状结构（孔隙）的凝胶粒子浸渍于某种溶液中时，溶液中的溶质分子凡是比网络孔隙小的都能自由进入凝胶粒子内，大的分子由于不能潜入网格便残留在溶液中，所以将分子大小不同的溶液（如蛋白质和硫酸铵）加入到分离柱中，只有小分子物质（硫酸铵）完全能进入凝胶粒子内，而大分子（蛋白质）则被排阻于粒子外，彼此互相筛分，加入洗液后，溶液在分离柱内向下移动，先流出的洗液中，全部含有大分子物质（蛋白质），后流出的洗液中含有小分子物质（硫酸铵），从而达到分离和提纯的目的。

95 二、 凝胶层析法常用的凝胶 1、天然凝胶 琼脂和琼脂糖凝胶 （Sepharose）：能分离较大相对分子质量的物质，但它带有大量的电荷，层析时需使用较高离子强度的洗脱液 2、人工合成凝胶 （1）聚丙稀酰胺凝胶（Bio－Gel P） （2）交联葡聚糖凝胶（Sephedex）

96 三、凝胶层离技术 1、凝胶柱的制备 （1）凝胶的预处理 （2）凝胶的装填 （3）层析床的检查 （4）柱的平衡 2、样品和洗脱剂的准备
洗脱剂：试剂是分析纯、水是纯水 固体样品溶于洗脱剂中，无颗粒

97 3、加样 4、洗脱技术 （1）加样量的选择 脱盐、缓冲液交换等组分分离时加样体积为床体积的30％，如果要求较高的回收率，则为15％～20％。
（2）加样方法和注意事项 进样器或注射器 排干法 液面下加样 4、洗脱技术 洗脱流速 高速 涡流扩散严重，导致区带变宽

98 5、样品的检测、收集和处理 6、凝胶过滤介质的再生、清洗和储存 再生：用1.5～2个柱体积的洗脱剂完成洗脱过程
清洗：碱液清洗（0.1～0.5moL/L的NaOH）、乙醇、非离子型去污剂 保存： 浸泡在抑菌剂的溶液中，比如：20％乙醇、0.02％～0.05％的叠氮化钠、0.01moL/L的NaOH，0.05％的三氯丁醇，0.01～0.02％的可乐酮

99 四、层离设备 1.分离柱 2.恒压储液瓶 3.恒流泵 4.洗脱液收集器 5.恒温设备 不锈钢层析柱

100 五、凝胶层析法在发酵中的应用 1、脱盐 2、凝胶层析法去除热源物质 3、凝胶浓缩高分子溶液 4、测定高分子物质的相对分子质量 5、分析

101 第六节 浓 缩 浓缩：将低浓度溶液通过出去溶剂变为高浓度溶液 常用的浓缩的方法：蒸发浓缩法、冰冻浓缩法、吸收浓缩法、超滤浓缩法

102 一、蒸发浓缩法 （一）蒸发机理： 将溶液加热沸腾，使溶剂气化除去，从而提高溶液中溶质的浓度
溶液表面的溶剂分子获得的动能超过了溶液内溶剂分子间的吸引力脱粒液面逸向空间的过程 影响蒸发的因素： 温度、蒸发面积、蒸汽压大小

103 （二）蒸发浓缩的分类 常压蒸发浓缩、真空蒸发浓缩 （三）蒸发浓缩过程的选择和要求 要更加溶液的性质来选择： 溶液的粘度、热敏性、发泡性、腐蚀性、是否结垢 （四）工业发酵中常用的蒸发浓缩过程 1、强制循环蒸发浓缩过程 2、薄膜式蒸发浓缩过程：管式薄膜蒸发器、回转式薄膜蒸发器、旋风式薄膜蒸发器、离心式薄膜蒸发器、板式蒸发器

104 二、冰冻浓缩法 将待浓缩的溶液冷却变成固体，然后缓慢融化，利用溶剂与溶液融点的差别而达到除去大部分溶剂 主要用于浓缩生物大分子和具有生理活性的发酵产品

105 三、吸收浓缩法 通过吸收剂直接吸收除去溶剂中溶剂分子达到浓缩的方法 常用的吸收剂：聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、蔗糖、凝胶 四、超滤浓缩法

106 第 六 节 沉 淀 法 一、沉淀法概述 利用某些发酵产品能与某些酸、碱或盐类形成不溶性的盐或复合物而从发酵滤液或浓缩滤液中沉淀下来或结晶析出的一种提取方法 1、氨基酸沉淀法： 等电点法 盐酸盐法 金属盐法 有机溶剂沉淀法； 2、酶制剂沉淀法： 盐析法 有机溶剂沉淀法； 3、抗生素沉淀法：如四环素与钙形成沉淀；

107 二、等电点法 两性电解质在溶液中可解离为阳离子和阴离子，在一定pH条件下，两种离子浓度相等时，溶液静电荷为零，此时电解质溶解度最小而发生沉淀。 三、盐析法 中性盐沉淀法。添加中性盐析剂，破坏酶蛋白的胶体性质，消除微粒周围的水化膜和微粒上的电荷，促使酶蛋白沉淀。

108 （一）盐析原理 （二）影响酶制剂盐析的主要因素 （1）破坏水膜层 （2）中和电荷 1、盐析剂的种类 不同的盐，盐析效果不同
MgSO4>Na2SO4>(NH4)2SO4、NaH2PO4

109 2、盐析剂的用量 3、盐析的温度 4、盐析的pH值 5、酶液中的杂质

110 四、有机溶剂沉淀法 1、有机溶剂沉淀法的原理 破坏蛋白质的水化层 2、有机溶剂沉淀法提取酶制剂的影响因素 （1）有机溶剂的种类和用量
（2）温度 （3）pH （4）时间 （5）溶液中的盐等杂质

111 五、热沉淀 六、其他沉淀法 非离子型聚合物：聚乙二醇 聚电解质：酸性多糖、羧甲基纤维素、海藻酸钠、果胶酸盐、卡拉胶
多价金属离子：Ca 2＋、Mg2+

112 思考题： 试设计一个分离方案来分离用细菌发酵液中的透明质酸产品（分子量为50万？分子量为500万？）