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阳性克隆的快速检测 一、实验目的 学习蓝白斑筛选试验中阳性克隆的快速检测方法 掌握蓝白斑筛选的原理和方法
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二、蓝白斑筛选的原理 重组质粒转化细菌后，蓝白斑筛选往往是基于抗生素筛选基础上的第二次筛选。
一般培养转化细菌的培养基中都要加入一定浓度的适宜抗生素，只有含有质粒载体的细菌才可以生长形成菌落，即抗生素完成对细菌是否含有质粒载体进行了初步筛选。 质粒载体上存在的LacZ基因片段当被外源DNA片段插入时，会产生白色的克隆，不含插入片段的质粒进入宿主细胞生成蓝色菌落。这就是蓝白斑筛选，即a-互补显色反应
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大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i P O lacZ β-半乳糖苷酶 调控蛋白P 分解乳糖
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β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15 a-互补显色反应（蓝白斑筛选） i P O lacZ - 调控蛋白P 产物呈现蓝色 分解X-gal
β-半乳糖苷酶- α-肽段 调控蛋白P 诱导剂IPTG 分解乳糖 分解X-gal 产物呈现蓝色
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三、实验材料、器具及药品 实验材料 LB固体培养基上生长的蓝白菌斑
三、实验材料、器具及药品 实验材料 LB固体培养基上生长的蓝白菌斑 实验器具 1.5ml Ep管，离心管架，微量取液器，台式高速离心机，恒温振荡摇床，电泳仪，紫外透射检测仪。
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实验药品 1. 溶液Ⅱ 0.4mol/L NaOH 2%SDS 临用前1:1混合贮存液即为II液. 2. 分离液 酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1 3. 1%琼脂糖凝胶
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四、实验步骤 分别挑取多个白色菌斑和一个蓝色对照菌斑到1.5ml含有80μg/ml Kan抗生素的LB 液体培养基
37℃摇培过夜（10~12h） 6000rpm, 3min 弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。 短暂离心，收集剩余上清，弹匀至没有明显菌块 加50μl II液，充分混匀 加100μl 酚-氯仿-异戊醇，涡旋振荡，使溶液呈现乳白色 12000rpm, 10min 取10μl 上清液，电泳检测。
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