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蛋 白 质 含 量 的 测 定 —微量凯氏定氮法 王冬亮 讲师
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蛋白质的理论知识： 蛋白质组成： 必需AA，条件必需AA，非必需AA,限制AA,AA模式 蛋白质来源： 蛋白质功能： 蛋白质的评价：
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食物蛋白质的营养评价： 一 蛋白质的含量 1.真消化率 二蛋白质消化率 2.表观消化率 1.生物价 2.蛋白质净利用率 三蛋白质利用率
3.蛋白质功效比值 4.氨基酸评分 三蛋白质利用率
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蛋白质含量的测定方法: 定氮法 双缩尿法（Biuret法） Folin－酚试剂法（Lowry法） 紫外吸收法
考马斯亮蓝法（Bradford法） 红外线检测
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蛋白质测定方法的比较：
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微量凯氏定氮法
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一、实验目的： 1、掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理 和方法。 2、学会使用凯氏定氮仪。
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二、实验原理： 1. 氮元素： 蛋白质区别于糖和脂肪的特征，
1. 氮元素： 蛋白质区别于糖和脂肪的特征， 绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一 般恒定在15～17%，平均值为16%左右。 只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以相 应的蛋白质换算系数（均值为6.25、乳制品为 6.38），就可以计算出样品中的蛋白质含量。
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2. 含氮量的测定 反应方程式 再强碱高温水蒸气蒸馏出氨气 用硼酸吸收氨气 用标准盐酸进行滴定
先高温条件下强酸(浓H2SO4)把 样品中的蛋白质的有机氮全部 消化为无机氮形式 再强碱高温水蒸气蒸馏出氨气 用硼酸吸收氨气 用标准盐酸进行滴定 消化 蒸馏 吸收 滴定
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三、试剂(已制备) 1、消化液：硫酸 2、催化剂：硫酸铜、硫酸钾 3、碱溶液：40%氢氧化钠 4、吸收液：2%硼酸 5、混合指示剂：
0.1%甲基红乙醇溶液：0.1%甲基蓝乙醇溶液=（1：1） 6、标准滴定液：0.2M HCL
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四．实验步骤 步骤一 步骤二 步骤三 消化 蒸馏、吸收 滴定
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（一）消化 观察浓硫酸刚加入牛奶中的颜色？ 作用？ 1、标记消化瓶 2、将下列物质加入消化瓶：
牛奶1ml、浓硫酸5ml、催化剂（ K2SO4， CuSO4 ）、玻璃珠 3、将消化瓶放入智能数控消化炉进行消化，至 液体变为无色或淡蓝色 250℃ 1h左右 350℃ 40min左右 450℃ 2.5h左右 作用？
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（二）蒸馏、吸收 传统装置 微量凯氏定氮蒸馏装置 1：电炉 2：水蒸气发生器 3：螺旋夹 4：小玻杯及棒状玻塞 5：反应室 6：反应室外层
7：橡皮管及螺旋夹 8：冷凝管 9：蒸馏液接收瓶 传统装置
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半自动凯氏定氮仪 2、准备好吸收液（200ml 2%硼 酸 + 2ml 混合指示剂）并做 好标记
1、确保仪器运行正常、管道内 部干净、管道及其连接口密 封性好 2、准备好吸收液（200ml 2%硼 酸 + 2ml 混合指示剂）并做 好标记 3、将碱溶液及去离子水桶与仪 器连接好，放入盛装消化好 样品的消化瓶，放入盛装吸 收液的锥形瓶并保证管口插 入液面下。 4、设置并启动程序 半自动凯氏定氮仪
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程序设置： 步骤 加碱或加水 时间 蒸馏 C0（样品检测) E0（加碱） 5s E0 4min C1（样品间清洗） E1 0s 2min
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（三）滴定： 终点 至灰色或蓝紫色 至灰色或蓝紫色 至灰色或蓝紫色
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五、结果计算: X：样品蛋白质含量 （g/100g 或g/100mL） V1、V2：测定用样、试剂空白消耗盐酸标准溶液的体积 （mL）
C：盐酸标准液的摩尔浓度 （mol/L） 0.014：1mol/L盐酸标准液1mL相当于氮的克数 m：样品质量（g）或体积（mL） F：蛋白质换算系数6.25
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六、注意事项: 1、严禁酸碱污染吸收液、所用去离子水及管道等。 2、固体样品消化时防止挂壁且注意梯度升温。
3、硫酸钾提高反应温度，但不可过多，否则温度过多，引起生成 的铵盐分解产生氨，影响结果。 4、硫酸铜起催化剂作用并可指示消化终点。 5、注意标记。 6、取消化瓶时防止烫伤。 7、吸收前确保管口插入液面，吸收结束后使冷凝管下端离开液 面， 并用去离子水将管口冲洗干净并回收至接收瓶。 8、规范滴定操作，且终点判定要一致。
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定氮法优缺点 优点：灵敏（0.2mg-1mg）、稳定、 成本低廉 凯氏定氮法被定为食品中蛋白质含量测定的现行国家 标准及国际通行的测定方法
缺点：耗时长、特异性差
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三聚氰胺 化学式： C3N6H6 分子量：126 含氮量：66.6% 牛奶和奶粉添加三聚氰胺，就是因为它能冒充蛋白质
鲜牛奶的151倍，是奶粉的23倍。每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺，理论上就能提高0.625%蛋白质 牛奶和奶粉添加三聚氰胺，就是因为它能冒充蛋白质 三聚氰胺
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1.实验完成后记得清理台面。每组的小组长负责。
2.实验报告： 实验题目 实验目的 实验原理 实验步骤 实验结果 （空白滴定的结果可以共享） 实验讨论 （操作中现象的出现原因；结果的影响因素；与商标 上显示的结果对比等。） 结果每个小组可以相同，但是讨论不能相同！
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