第三章 细胞生物学研究方法 本章主要介绍了细胞形态结构的观察方法、细胞组分的分析方法、以及细胞培养和细胞工程方面的技术与研究。

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1 第三章 细胞生物学研究方法 本章主要介绍了细胞形态结构的观察方法、细胞组分的分析方法、以及细胞培养和细胞工程方面的技术与研究。

2 重点：各种显微镜的最基本的工作原理和主要应用领域；细胞组分的分离与纯化方法要点和应用领域；细胞培养和细胞工程等实验技术的基础知识
难点：几种显微镜(光镜与电镜)的工作原理；电镜制样技术；几种新的细胞组分分析方法

3 考点分析 本章主要考查各类方法技术的原理及用途,考查形式多样。
光学显微镜技术主要考查分辨率及其影响因素,各种特殊显微镜的基本特点及应用范围. 电子显微镜技术则在设计原理及类型、样品制备技术(超薄切片、负染色、冰冻蚀刻、免疫电镜技术)的原理及应用方面以简答题形式为主.

4 考点分析 细胞内各种化学成分的定性、定位和定量分析技术、细胞化学与组织化学法、免疫细胞化学法、各种分光光度术、放射自显影和分子杂交技术等,考查的形式多以实验设计为主进行考查.

5 目录 第一节 细胞形态结构的观察方法 第二节 细胞组分的分析方法 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术
第一节 细胞形态结构的观察方法 第二节 细胞组分的分析方法 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 第四节 用于细胞生物学研究的模式生物

6 第一节 细胞形态结构的观察方法 本节主要内容： 一、光学显微镜技术 二、电子显微镜技术 三、扫描隧道显微镜

7 细胞形态结构的观察方法 形态观察 紫外光显微镜 普通光镜 暗视野显微镜 光学显微镜 相差显微镜 特殊光镜 微分干涉差显微镜 荧光显微镜
激光共聚焦显微镜 透射式电子显微镜 扫描式电子显微镜 电子显微镜 扫描隧道电子显微镜 冰冻蚀刻技术

8 一、光学显微镜技术（light microscopy)
(一)普通复式光学显微镜技术 (二)相差显微镜（phase-contrast microscope） (二)微分干涉显微镜 （differential interference contrast microscope, DIC） (二)录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy） (三)荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） (四)激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy） (五)荧光共振能量转移技术(36)  (六)荧光漂白恢复技术

9 (一)普通复式光学显微镜 1. 普通复式光学显微镜组成 2. 普通光镜的成像原理 3. 普通光镜的应用优缺点

10 普通复式光学显微镜 第一节 细胞形态结构 的观察方法 目镜 物镜 集光器 载物台 光源 （一）普通光学显微镜 1. 普通光镜的结构:

11 1.普通复式光学显微镜组成 目镜 物镜 光学放大系统 光源 折光镜 聚光镜 照明系统 镜臂 底座 载物台 机械和 支架系统
其他(镜筒、物镜转换器、调焦装置) 机械和 支架系统

12 2. 普通光镜的成像原理 光学显微镜的光路图  图像 样品 光线 聚光器 物镜

13 D: 分辨率(指显微镜或人眼在25cm的明视距离处，能区分开两个质点之间的距离)；
：光源波长 ：物镜镜口角(标本在光轴的一点对物镜镜口的张角) N: 介质的折射率 计算可知，介质为空气时 N=1, D0.3m; 介质为香柏油时 N=1.5, D0.2m 普通光镜的最大分辨率为0.2 m=200nm

14 判断题：在使用光学显微镜时，如果物镜不变，用10倍的目镜时的分辨率比用5倍的目镜高1倍。（ ）
比较放大率和分辨率的含义。 总结:物镜已经分辨清楚地细微结构，假如没有经过目镜的再放大，达不到人眼所能分辨的大小，那就看不清楚。但物镜所不能分辨的细微结构，虽然经过高倍目镜的再放大，也还是看不清楚。所以目镜只能起放大作用，不会提高显微镜的分辨率。

15 3.普通光镜的应用优缺点 优点：操作简便、样品制备简便、成本低 缺点：分辨率较低，图像反差小
应用：应用领域极为广泛，主要用于观察被检物的细微结构。 返回

16 (三)荧光显微镜技术 1.技术原理 2.结构性能 3.应用

17 1.技术原理 强光源发出紫外光和蓝紫光， 经过滤光系统， 照射到样品， 激发样品中的荧光物质发出可见荧光， 通过物镜和目镜放大成像， 观察和摄像

18 荧光显微镜的成象原理 3阻断滤光片 2分色镜[二相色镜] 1激发滤光片

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20 2.结构性能 (1)荧光光源---------高压汞灯、氙灯 (2)滤色系统 a.激发滤光片----选择激发光的波长
b.阻断滤光片----吸收或阻挡激发光进入目镜，防止成像干扰和保护眼睛 (3)光路系统 由光源、滤色系统、集光镜、反光镜、物镜和目镜等组成

21 3.应用 观察物质结构，应用 于地质、医学、生物 学等。是目前对特异 蛋白质等生物大分子定性定位研究的最有力工具。
荧光显微镜技术包括:荧光素直接标记技术 和间接免疫荧光标记技术 优点：图像清晰，灵敏度高，细胞内物质可做特异性观察与分析

22 不同荧光染料 标记 抗 体 特异性结合 抗原 (细胞的蛋白质成分) 分裂细胞的 免疫荧光图像 返回

23 (四)激光扫描共焦显微镜技术 (Laser Scanning Confocal Microscopy、LCM)
1.原理：激光源经过双色镜反射，经物镜后汇聚到样品(预先经免疫荧光标记)的某一焦点，从焦点发出的荧光经过透镜汇聚成像并被检测器检出,而非焦点区的荧光不能汇聚成像。 逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。 系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。

24 激光扫描共焦显微镜技术 原理小结: Confocal 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像 。

25 2.应用：观察亚细胞结构如内质网膜系统和细胞骨架系统等细胞内的复杂网络。
激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。 3.优点：A.通过共聚焦可进行光学切片，观察较厚样品内部结构，排除焦平面以外光的干扰，增强 图像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，获得样品三维结构； B.对固相、液相物体均可进行观察

26 激光扫描共焦显微镜原理图

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28 牛肺动脉的内皮细胞 Mitose - Tubulin (FITC), DNA (PJ) 返回

29 (二)相差显微镜(PCM) 1.原理:光线通过样品时，产生直射光和衍射光，相差板使两种光的光程差(相位差)[肉眼不可识别]增加，通过透镜后，二者互相干涉，所形成的合成光与背景光[直射光]的振幅差表现为肉眼可见的明暗反差。总之，相差显微镜把光线通过样品后形成的相位差(光程差)转化为振幅差(明暗图像)

30 相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。

31 在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处： 1
在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处：     1.环形光阑（annular  diaphragm） 位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。     2.相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种：    a.A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。    b.B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。

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33 2.应用 广泛应用于医学、生物学尤其细胞生物学。 优点：观察活体细胞，并且不需染色 返回

34 （二）微分干涉显微镜(DIC) 1.原理 平面偏振光经棱镜折射后分成两束在不同时间经过样品相邻部位后，再经另外一个棱镜使两束光汇合，从而把样品厚度上的微小差别转化为明暗区别。

35 2.应用 观察样品结构，测量样品内部一定区域的相位差和厚度，测量样品中干物质重量。 优点。显示样品三维立体结构
DIC显微镜使细胞的细微结构立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植等生物工程的显微操作常在这种显微镜下进行。

36 DIC显微镜下观察到的硅藻

37 DIC显微镜 暗视野显微镜 相差显微镜 普通显微镜 返回

38 (二)录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy）
计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动。

39 录像增差显微镜中的颗粒及细胞器的运动 中的颗粒及细胞器的运动 返回

40 （五）荧光共振能量转移技术（fluorescence resonance energy transfer, FERT)
1．应用 该技术是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。

41 2．原理 490 430 430 530

42 （六）荧光漂白恢复技术 ( fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)

43 2 ． 应用 ： FARP可以用于解决活细胞内包括蛋白质定位、动力学以及其他成分相互作用等问题。

44 其他光学显微镜 暗视野显微镜 倒置显微镜：物镜和聚光镜的工作距离较长，可以直接研究观察备检物结构，观察培养物细胞形态特征，细胞分裂分化等。
这种显微镜使照明光线不能直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜。 倒置显微镜：物镜和聚光镜的工作距离较长，可以直接研究观察备检物结构，观察培养物细胞形态特征，细胞分裂分化等。

45 二、电子显微镜 （一）电子显微镜的基本知识 （二）主要电镜制样技术 上一页

46 （一）电子显微镜的基本知识 1.电镜与光镜的比较 2.电镜与光镜光路图比较 3.电子显微镜的基本构造 上一页

47 利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化
1.电镜与光镜的比较 显微镜 分辨本领 光源 透镜 真空 成像原理 LM TEM 200nm 100nm 0.1nm 可见光（ ） 紫外光 （约200nm) 电子束 （ ） 玻璃透镜 电磁透镜 不要求真空 要求真空 1.33x10-5～1.33x10-3Pa 利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化 利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差

48 2.电镜与光镜光路图比较

49 3.电子显微镜的基本构造

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51 电镜优点 分辨率高，成像清晰；透射电镜观察细胞内部亚显微结构，扫描电镜观察下拨表面结构生成三维立体图像。

52 （二）主要电镜制样技术 1. 超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备示意图 2.负染色技术（Negative staining）与金属投影
染色背景，衬托出样品的精细结构 3.冰冻蚀刻技术（Freeze etching） （技术示意图） 冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。 快速冷冻深度蚀刻技术（quick freeze deep etching） 4.电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的 具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前构生物学（Structural Biology） ——主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。

53 通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度20~50nm，切片采用重金属盐染色，以增大反差
超薄切片

54 超薄切片机

55 电镜观察的样本制备 返回

56 负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸出的地方则没有染料沉积，从而出现负染效果
负染色背景，衬托出样品的精细结构 返回

57 3、冰冻蚀刻（freeze-etching）
亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。步骤如下： (1)标本置于-100˚C的干冰或-196˚C的液氮中，进行冰冻。 (2)然后用冷刀骤然将标本断开， (3)升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）。 (4)蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。---(复型) (5)然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构

58 冰冻蚀刻

59 冰冻蚀刻电镜照片 返回

60 快速冷冻深度蚀刻 返回

61 电镜三维重构 返回i

62 5.扫描电镜 电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。
它是将标本表面上发射出的次级电子(二次电子)，被探测器(带样电荷的栅极)收集后，即向电子显象管发送信号，在荧光屏上显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本表面的真实结构。

63 扫描电镜

64 第一节 形态观察技术

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67 三、 扫描遂道显微镜 Scanning Probe Microscope,SPM (80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器)
包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等 原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离(100nm)时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。

68 装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。
特点：（1）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。（侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.01nm）； （2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息； （3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测量。 （4）可连续成像，进行动态观察。

69 用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构,直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。

70 扫描隧道电子显微镜下金原子的晶格排列图像
第一节 细胞形态结构的观察方法 扫描隧道电子显微镜下金原子的晶格排列图像

71 问答题：根据光镜与电镜的特点，观察下列结构采用哪种显微镜好？如果用光镜（暗视野、相差、免疫荧光显微镜）哪种最有效？为什么？
A.植物细胞中叶绿体的运动 B.病毒颗粒 C.细菌的运动 D.某组织中含一种特异蛋白质的细胞

72 答：A观察植物细胞中叶绿体的运动，应采用光镜，因为电镜要杀死细胞。光镜中采用相差显微镜最好，因为该显微镜可观察不经染色的活细胞及其动态变化，以叶绿体的大小可以很容易分辨清楚，有较好反差。用荧光显微镜也可，因为叶绿体可自发红色荧光。 B观察病毒颗粒，应采用电镜，因为太小，光镜无法分辨。

73 C观察细菌的运动，应采用光镜。暗视野显微镜，因为其可以观察活的未染色的细胞，尤其适合观察整体细胞及其运动，反差好。相差显微镜也可。
D观察某组织中含一种特异蛋白的细胞，应采用光镜，因为对于电镜来说组织太大。免疫荧光显微镜，它是大分子定位中唯一的光镜方法，可以用带有荧光标记的特异蛋白的抗体在细胞中对特异蛋白进行定位，再进行荧光观察。

74 根据光镜与电镜的特点，观察下列结构采用哪种显微技术最好，作出连线。
未染色活体细胞 扫描电镜显微技术 病毒颗粒 超薄切片显微技术 高尔基体结构 负染色电镜技术 细菌的移动 冷冻蚀刻电镜技术 细胞中某蛋白的分布 电镜三维重构技术 GFP融合蛋白在花粉管生长 暗视野显微技术 过程中的变化 细胞膜中的蛋白颗粒 普通复式光镜技术 果蝇口器的立体结构 相差显微技术 蛋白质二维晶体结构 荧光显微技术 考染后的植物细胞骨架 confocal 显微技术

75 第二节 细胞组分的分析方法 一、 离心分离技术 二、 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂质等的显示方法 三、特异蛋白抗原的定位与定性
第二节 细胞组分的分析方法 本节主要内容： 一、 离心分离技术 二、 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂质等的显示方法 三、特异蛋白抗原的定位与定性 四、细胞内特异核酸序列的定位与定性 五、放射自显影技术 六、定量细胞化学分析技术 next next next next next next

76 一、 离心分离技术 用途：用于分离细胞器与生物大分子及其复合物
差速离心：即利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。 密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离纯化。

77 差速离心（differential centrifugation）
在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。 在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体、最后为核蛋白体。g=1.11×10－5R(rpm)2 R为中轴到离心管远端半径 rpm每分钟转速 差速离心用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再进行分离纯化。

78 差速离心 up 细胞匀浆 低速离心（1000g，10min) 细胞核（完整） 细胞骨架 中速离心 （20000g，20min
高速离心 （80000g，1h 超高速离心 （150000g，3h 细胞匀浆 细胞核（完整） 细胞骨架 大细胞器：线粒体、溶酶体、过氧化物体 小细胞器：微粒体、小泡 核糖体、病毒、 大分子复合物 up

79 密度梯度离心（density gradient centrifugation）
用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。 密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。 速度沉降（velocity sedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 等密度沉降（isopycnic sedimentation）适用于分离密度不等的颗粒。

80 蔗糖密度梯度离心 离心 样品 蔗糖的稳定梯度 慢速沉降成分 快速沉降成分 分画 蔗糖的不连续梯度 低浮力密度成分 高浮力密度 成分

81 二、 细胞内核酸、蛋白质、 酶、糖与脂类等的显示方法
原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征，通过显 色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来 判断某种物质在细胞中的分布和含量。 例如: Feulgen Staining----DNA在细胞内的定位. 下一页

82 大分子物质显色反应 孚尔根反应（显示核酸）---紫红色 PAS反应(过碘酸-希夫试剂反应，显示多糖和糖蛋白)----紫红色
四氧化锇染色（不饱和脂肪酸）----黑色 苏丹Ⅲ（脂肪酸）----深红色 苏丹黑（脂肪酸）----黑色 米伦反应（蛋白质）-----红色 格莫瑞反应（碱性磷酸酶）----灰或者黑色 up

83 第二节 细胞组分的分析方法 Feulgen反应显示法 最典型的组织化学显示法是Feulgen反应显示法(Feulgen reaction)。此法由Feulgen和Rossenbeck (1924)发明，对DNA的反应具有高度专一性。 其原理是: 标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红与醛基反应，形成含有醌基的化合物，醌基为发色团，呈现出紫红色。

84 up

85 三、特异蛋白抗原的定位与定性 根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原结合， 对抗原进行专一定位测定的技术。如果将抗体 结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应， 即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织 中的部位。

86 第二节 细胞组分的分析方法 常用的标记物有荧光素和酶： 标记荧光素的称为免疫荧光技术(immunofluorescent technique)，常用的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、罗 丹明(rhodamine)等。 标记酶的称为酶标免疫法(enzyme-labelled antibody method)，常用的酶有辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase)等，酶与底物发生反应后形成 不透明的沉积物或有色物，从而显示出抗原的存在部位。

87 特异蛋白抗原的定位与定性技术 （一）免疫荧光技术：快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 （图） 免疫荧光技术就是将免疫学方法与荧光标记技术相结合用来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法.此技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。

88 在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

89 用荧光素标记抗体所显示出的细胞中几种蛋白质的分布状态
IRS-1 IRS-1+Bcl-2 Bcl-2 用荧光素标记抗体所显示出的细胞中几种蛋白质的分布状态

90 （二）免疫电镜技术 免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。
可以分为下列技术： 免疫铁蛋白技术 免疫酶标技术 免疫胶体金技术 应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等

91 小知识：免疫电镜中样品的固定 固定是免疫电镜较关键的一步，与一般超薄切片中的固定的不同之点在于既考虑保存细胞的超微结构,又要考虑到抗原的失活性问题。 固定剂的要求：①不损害细胞内抗原的活性；②固定速度快、效果好；③分子量小，易于渗透；④固定后,不引起交联，造成空间的阻碍，影响标记抗体进入抗原位。

92 小知识：免疫铁蛋白技术 铁蛋白是一种含铁约占23%的蛋白质。抗体与铁蛋白结合为双分子复合物，保留抗体的免疫活性，同时因为铁蛋白含有致密的铁离子核心，具有很高的电子密度，便于电镜观察。 商品铁蛋白主要是从马脾脏中提取的。 在已知对照样品成立的前提下，凡是出现黑色的铁分子颗粒即表示抗原的存在，判定阳性(＋)，否则判为阴性(－)。

93 小知识：免疫胶体金技术 更多内容参见试验指导书161页
是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，而且不影响蛋白质的生物特性。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒 更多内容参见试验指导书161页

94 免疫胶体金标记 黑褐色颗粒 up

95 四、细胞内特异核酸的定位与定性 光镜水平的原位杂交技术 （用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法称为原位杂交. 放射性同位素标记的探针与样品中的核酸杂交后，用显微放射自显影的方法显示杂交物的存在部位或荧光素标记的核酸探针,与样品中的待测核酸杂交后，其侧链可被带有荧光标记的抗体所识别，在荧光显微镜下直接显示与探针杂交的核酸的位置 ） 电镜水平的原位杂交技术 （生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）　　　　　　 下一页

96 例题：假设已有质粒中含有rRNA基因克隆的大肠杆菌菌株，如何显示rRNA基因存在于小鼠的哪些染色体上？
①DNA探针的制备：从菌株中分离rDNA，并用放射性同位素标记； ②小鼠骨髓染色体制备：用秋水仙素处理小鼠，分离骨髓细胞、固定、制片； ③原位杂交：将染色体制片中的DNA进行变性处理，并与rDNA探针杂交； ④放射自显影 ⑤显微镜观察：根据银粒的出现部位确定rRNA基因存在于小鼠的哪些染色体上。 返回

97 电镜原位杂交示意图

98 补充内容 Southern bloting (DNA印迹法）：用凝胶电泳把DNA限制性片段的混合物分散开以后，通过扩散或电泳转移到硝酸纤维素膜上，做成一个凝胶复制品。在滤膜上加放射性DNA探针与之杂交，通过放射自显影就可确定与DNA探针互补的特异核苷酸序列。

99 Northern bloting (RNA印迹法）
又称N orthern杂交，是检测或分析RNA样品的一种方法。 RNA印迹的过程与Southern 印迹相似，只是此时转移的核酸是RNA，而不是DNA。单链RNA按其大小在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳上分开，然后通过毛细作用转移到硝基纤维素膜上，经烘干，被牢固吸附的RNA与放射性标记的单链核酸（通常是单链DNA）探针杂交，接着可用放射自显术来检测杂交情况。 up

100 Western bloting (RNA印迹法）
是一种类似Southern 印迹的技术，用于检测混合物中的特异蛋白质。样品经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分散开以后，通过扩散或电泳转移到硝酸纤维素膜上，然后用与标记物标记的抗体与之反应，在特异抗原抗体反应的条带处出现标记物，从而检测出某一特异蛋白质的存在。

101 Eastern blotting (伊斯特尔印迹法）
用凝胶进行抗原抗体反应，再进行印迹的方法。

102 五、放射自显影技术 利用放射性同位素的电离辐射对乳胶(含溴化银或卤化银)的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；
原理及应用： 利用放射性同位素的电离辐射对乳胶(含溴化银或卤化银)的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究； 实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。 步骤： 标记 制片 涂胶 曝光 显影 定影 观察

103 例如:以细胞内DNA合成的标记实验 一﹑3H-标记体外培养细胞 1.培养细胞 2.放射性同位素掺入细胞DNA
3.洗涤(Hank液洗10min ) 4.固定(卡诺固定液固定10~20min) 5.洗涤(90%乙醇-70%乙醇各洗5min),盖玻片干燥. 6.贴片 7.制备保护膜(1%的明胶液)覆盖在标本与载玻片上,然后干燥.

104 二﹑制备乳胶膜 1. 蒸馏水2ml+核乳胶2ml.(暗室进行)→40℃水浴中保温15min→乳胶溶化. 2.用浸蘸法或滴胶法涂布乳胶. 三﹑曝光(一周时间,将暗盒放在4℃冰箱) 四﹑显影(5~8min) 五﹑定影(15min) 六﹑染色:Giemsa染色液染色10~15分钟. 七﹑观察与结果分析

105 常用同位素标记前体p64页 DNA 3H-TdR RNA 3H-U 含s的Pr 35S-Met; 35S-Cys
Pr H-Met\Ile; 14C- Met\Ile

106

107 常用3H胸腺嘧啶脱氧核苷显示DNA的放射自显影图像

108 例题：某种抗癌药物的作用机制是阻止肿瘤细胞的DNA复制还是阻止蛋白质合成，用（ ）证明。
A.电镜负染色技术 B.放射自显影技术 C.免疫荧光技术 D.免疫电镜技术

109 放射自显影技术与电镜技术结合，也可进行电镜自显影（electron-microscopic autoradiography）。
电镜自显影照片 up

110 六．定量细胞化学分析技术 (一)细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry）
利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括： 紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法 (二)流式细胞仪（Flow Cytometry） 主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。

111 (fluorescence-associated cell sorting, FACS)
流式细胞分选术 (fluorescence-associated cell sorting, FACS) 激光 细胞悬液 鞘液 液滴加电信号 干涉探测器 超声波振摇器 加负电的液滴 加正电的液滴 细胞收集容器 废液容器（未探测细胞） 荧光检测器 up

112 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 一、细胞培养 1、含义 、意义与应用 3、内容 二、细胞工程

113 一、1、细胞培养的含义 对从生物有机体中取出的组织或细胞分散成的单个细胞以及单细胞生物给予必要培养条件，使其在培养环境中继续生长与增殖。

114 一、 2、细胞培养的意义与应用 它为植物育种、疫苗生产、药物研制、肿瘤防治提供全新手段，为基因工程等现代生物工程提供必要条件。
它是当前细胞生物学及整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。近年来，细胞生物学系列进展都与之紧密相关。 它为植物育种、疫苗生产、药物研制、肿瘤防治提供全新手段，为基因工程等现代生物工程提供必要条件。

115 ３、内容 （一）原核生物的培养 （二）真核单细胞生物的培养 （三）动物细胞的培养 （四）植物细胞的培养
（五）非细胞体系在细胞生物学研究中 的应用 返回

116 它是较为简单、较为基础的细胞培养方式。现代基因工程仍然进行大量的原核生物培养。
（一）原核生物的培养 它是较为简单、较为基础的细胞培养方式。现代基因工程仍然进行大量的原核生物培养。 原核生物培养简便、快速、周期短，培养过程中注意防止杂菌污染。 上一页

117 它对揭示细胞基本生命活动的规律具有重要意义。现代基因工程需要大量培养真核单细胞生物。
（二）真核单细胞生物的培养 它对揭示细胞基本生命活动的规律具有重要意义。现代基因工程需要大量培养真核单细胞生物。 真核单细胞生物培养简便、快速、周期短，培养过程中注意防止杂菌污染。 上一页

118 （三）动物细胞的培养 1、培养类型（1）原代细胞培养 （2）传代细胞培养
2、培养方法：动物体→组织块→剪碎 →酶液处理（胰酶或胶原酶）（目的：消化分散细胞） →营养液培养（适宜温度、pH值、无菌）（营养液加入小牛血清，目的：适宜细胞贴壁生长与分裂）

119 3、动物培养基的种类和组成 天然、合成和无血清培养基。 ① 、天然培养基： 血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。
② 、合成培养基： 优点:成分明确、组分稳定、可大量生产供应。 目前采用的有: BME 、 MEM 、 DMEM 、 HAM F12 、 RPM11640 、 ISOCOV 、 199和McCoy5A等.

120 成分 (1)氨基酸 作用:是细胞合成蛋白质、维持细胞生命不可缺少的物质.
种类:Arg 、Val、His 、Ile 、 Leu 、 Lys 、 Met 、 Phe 、 Thr 、 Trp 、 Tyr 和胱氨酸. 此外还有谷氨酰胺.它几乎是所有细胞的重要的 碳源和能源. 例如199培养基含21种氨基酸.Eagle MEM含13种氨基酸.

121 (2)维生素 作用:维持细胞生命活动的低分子活性物质,多数是形成酶的辅基或辅酶. 例如:VA对细胞的贴壁有重要作用; VC有抗氧化作用;
胆碱对细胞膜的完整性有重要作用,缺少时细胞变圆,以致死亡.

122 分类: ①脂溶性维生素:A 、D 、E 、K ②水溶性维生素 :B1(硫胺素) 、B2(核黄素) 、烟酸、烟酰胺、吡多醇、吡多醛、偏多酸钙、生物素、叶酸、B12(氢钴胺素) 、抗坏血酸、对氨基苯甲酸、胆碱和肌醇等.

123 (3)糖类 作用:细胞的生长需依赖于碳源,它是维持细胞生命活动的能量来源.
种类:主要是G和Gln,当使用G时,常需补充丙酮酸钠.有的培养基内还有核糖和脱氧核糖,以及醋酸钠等.

124 (4)无机盐 作用:保持细胞的渗透压、缓冲pH的变化,并积极参与细胞的代谢.
种类:氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、磷酸氢二钠、NaHCO3 、FeSO4 、CuSO4等.

125 (5)其他成分 核酸的前体:腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷和胸苷等. 氧化还原剂:谷胱甘肽
动物血清:小牛血清(5%-10%)、胎牛血清(10%-20%).

126 牛血清的作用机制: ①提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素 生长因子包括有胰岛素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生的生长因子等. 激素有:皮质醇、雌二醇、睾酮、黄体酮和甲状腺素等. ②提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子.如:纤维结合蛋白、软骨素、昆布氨酸和胶原.

127 ③提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白 如白蛋白可与激素、维生素和脂类结合,并将它们带入细胞.
④提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素 脂肪酸中磷脂质、胆固醇和前列腺素E 微量元素:铜、锌、钴、钼和硒 ⑤血清可提供良好的pH缓冲系统.

128 ③、无血清培养基 无血清培养基在天然或合成培养基的基础上添加激素、生长因子、结合蛋白、贴附和伸展因子及其他元素。 优点：
提高了细胞培养的可重复性，避免了血清差异所带来的细胞差异； 减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险； 供应充足、稳定； 细胞产品易于纯化； 避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性； 减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于结果分析。

129 动物细胞的培养 4、细胞培养特点:(1)细胞贴壁生长；(2)形成单层细胞；(3)接触抑制；(4)形成细胞株及细胞系；（5）细胞形态改变（呈成纤维样细胞和上皮样细胞） 意义作用：为细胞融合，体细胞杂交，病毒培养创造条件。 上一页

130 动物细胞培养方法 返回

131 接触抑制：培养瓶中的贴壁单层细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞停止生长；
传代细胞：在体外培养并能持续传代的细胞： 原代细胞：从机体取出立即培养的细胞； 细胞贴壁：分散的细胞悬液中的细胞很快粘附在培养瓶的瓶壁上； 单层细胞：培养瓶中的贴壁细胞进行细胞分裂，形成单层。 接触抑制：培养瓶中的贴壁单层细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞停止生长；

132 细胞株（cell strain） ： 细胞培养中，少数传代细胞可持续增殖40-50代，并 保持染色体的二倍性和接触抑制现象，这类细胞叫细胞株。（正常二倍体，接触抑制,有限的增殖能力,无致瘤性。 ）
细胞系（cell line） ： 细胞培养中，少数细胞可无限制地传代，且染色体数量改变，失去接触抑制，这类细胞叫细胞系。（亚二倍体，接触抑制丧失）

133 Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养
HeLa细胞系是1951年从名叫Henrietta Lacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。此细胞系一直延用至今。 CHO:中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary,)细胞株 返回

134 （四）植物细胞的培养 1、单倍体细胞的培养 用花药在人工培养基上进行培养。 花药 小孢子 胚状体 单倍体植株 愈伤组织 单倍体植株
花药 小孢子 胚状体 单倍体植株 愈伤组织 单倍体植株 2、原生质体的培养 （1）二倍体体细胞 原生质体 胚状体 植株 （2）二倍体体细胞杂交 杂交细胞 植株 培养基 纤维素酶 分解细胞壁 诱导分化

135

136 愈伤组织长出的小苗 上一页

137 （五）非细胞体系在细胞生物学 研究中的作用
（五）非细胞体系在细胞生物学 研究中的作用 非细胞体系：来源于细胞，不具有完整的细胞结构，但包含了进行生物学反应所需的物质所组成的体系。 非细胞体系在研究DNA复制、RNA转录、Pr合成、高尔基体膜泡运输及细胞核装配等方面显示重要作用。

138 二、细胞工程 （一）.细胞工程含义 以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖，或人为地使细胞的某些生物学特性按人们的意志发生改变，以改良生物品种，加速繁育生物个体的过程。

139 （二）.细胞工程的意义和作用 利用细胞工程，培养各种细胞和组织，甚至用单细胞克隆出完整的动植物，改良生物品种，加速繁育生物个体。

140 （三）.细胞工程（内容） 1、细胞融合与杂交技术 2、单克隆抗体技术 3、细胞拆合与显微操作技术 返回

141 2、单克隆抗体技术 单克隆抗体技术意义 单克隆抗体技术制备过程
可以用不纯的抗原分子制备出纯化的单克隆抗体，单克隆抗体技术与基因克隆技术相结合为分离和鉴定蛋白质、细胞器和特殊细胞开辟新途径。 单克隆抗体技术制备过程

142 多克隆抗体与单克隆抗体 多克隆抗体 一个抗原通常有几个不同的抗原决定簇，因此每个免疫淋巴细胞都可能产生针对某一抗原决定簇的抗体，这些由同一抗原而产生的不同抗体统称为多克隆抗体 单克隆:将制造一种专一抗体的浆细胞进行培养,可得到由单细胞经分裂增殖而形成的细胞群. 单克隆抗体 是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的抗体。由于这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是由单一的B淋巴细胞克隆产生的，所以称为单克隆抗体。 杂交瘤细胞： 骨髓瘤细胞 --- 无限增殖； 免疫B细胞 --- 合成、分泌特异性抗体。 (如：B淋巴细胞能产生抗体，但每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体)。 next

143 抗原决定簇 返回

144 单克隆抗体制备过程

145 单克隆抗体制备流程: 1、选择亲本细胞株 第一种亲本细胞---骨髓瘤细胞 第二种亲本细胞---B淋巴细胞 用一定的抗原免疫动物
免疫动物品系和骨髓瘤细胞 ,采用与骨髓瘤供体同一品系的动物进行免疫。常用的骨髓瘤品系来自BALB/c小鼠和Lou大鼠，免疫动物也采用相应的品系。

146 2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 用于细胞融合的骨髓瘤细胞应具备：融合率高、自身不分泌抗体、所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定。 融合方法：将脾细胞（1×108）与骨髓瘤细胞（2×107-3×107）进行混合，在聚乙二醇作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内.

147 融合结果：产生了脾-脾、瘤-瘤、脾-瘤融合细胞。
为获得目的细胞将融合后的细胞立即转入选择性培养基中，常用HAT培养基,是用次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶配成。 氨基喋呤能阻断DNA合成的主要途径，瘤-瘤融合细胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾-脾融合细胞在培养几天后也会死亡，而杂交瘤细胞则可以存活。

148 培养方法： ①将融合的细胞悬浮于HAT培养基中，加入到96孔板内，根据情况2-3天换液一次，每次吸去二分之一到三分之二培养液，再加入等量新鲜培养液。 ② 7-14天改用HT培养液，14天以后用普通的RPMI1640完全培养液。 因为杂交瘤数量很少，多半不易存活，所以通常要加入饲养细胞才能使其繁殖，常用小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞。 作用:能释放某些生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。

149 3、筛选阳性克隆与克隆化 常用方法： 免疫酶技术 免疫荧光技术 放射免疫技术。

150 辣根过氧化物酶-底物-颜色 邻苯二胺 -橘红色 四甲替联苯胺-黄色 氨基水杨酸-棕色 邻联苯甲胺-兰色
2,2'-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐-蓝绿色

151 4、杂交瘤细胞与抗体性状的检定 正常鼠脾细胞的染色体数是40，小鼠骨髓瘤细胞的染色体数大于40，如54-64，62-68。
杂交瘤细胞染色体在数目上接近两种亲本细胞染色体数目的总和. 染色体数目较多又比较集中的杂交瘤细胞能分泌高效价的抗体。

152 5、单克隆抗体的大量制备 体外培养法和体内诱生法.目前多用后者。
体内诱生方法：在接种前1-2周，先给小鼠腹腔注射0.5毫升的降植烷（或液体石蜡），然后接种1*106杂交瘤细胞，待生成腹水后再抽取，离心去细胞沉淀，取上清夜冻存。

153 单克隆抗体制备流程小结 动物免疫: 细胞融合： 杂交瘤细胞的筛选 抗体检测 杂交瘤细胞克隆化培养[有限稀释法] 提取单克隆抗体 返回

154 1、细胞融合与杂交技术 细胞融合的含义 两个或者多个细胞融合成一个双核或者多核细胞的过程。 细胞融合 质膜融合 同核融合细胞 异核融合细胞
胞质融合 核融合 融合核细胞

155 （1）细胞融合途径 植物细胞：a、化学诱导融合（聚乙二醇(PEG)） b、电激融合（低压交流电场） 动物细胞：a、化学诱导融合；b、电激融合 c、病毒诱导融合（灭活仙台病毒）

156 植物体细胞杂交示意图

157 病毒诱导融合 返回

158 （2）细胞融合与杂交的意义 培育新物种或对现有物种改良，为基础生物学研究提供有效的研究手段，单克隆抗体生产，核质杂交和细胞核移植，微生物品种改良。 例题：试述细胞融合有哪些主要的方法？有何应用价值？（上海交通大学1999）

159 3.细胞拆合 将细胞的核与质分离,然后把不同来源的细胞质和细胞核相互融合,形成核质杂交过程.

160 细胞拆合技术 （1）核移植 物理法：A细胞 A细胞质 B细胞 B细胞核 化学法： 杂交新细胞 细胞 核、质分离 与其他细
细胞 核、质分离 与其他细 胞的核、质结合 杂交新细胞 物理法去核 杂交新细胞 物理法去质 细胞松弛素B 匀浆离心

161 （2）染色体移植 A、微细胞介导法： 供体细胞 秋水仙素处理 细胞松弛素处理 收集微细胞 植物凝集素 悬浮微细胞
供体细胞 秋水仙素处理 细胞松弛素处理 收集微细胞 植物凝集素 悬浮微细胞 与受体细胞混合 凝集 加聚乙二醇 融合 洗涤 筛选 B、直接转移法 供体细胞 秋水仙素处理 低温处理 细胞破碎 收集染色体 染色体导入受体细胞 返回

162 显微操作技术 主要有：显微镜下进行细胞解剖手术和微量物质注射。

163 第四节 用于细胞生物学研究的模式生物 细胞生物学乃至整个生命科学的研究中常用的模式生物有:病毒、细菌、酵母、原生动物、黏菌、海胆、线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等.

164 把模式生物跟细胞生物学联系来，具有一种象征意义，它表明了一种态度，代表着一种理念。表面上看，模式生物只是细胞生物学研究的一类实验材料，但是，从本质上说，模式生物把生命科学的3个重要学科紧密地联系了起来：细胞生物学、遗传学与发育生物学。探讨模式生物与细胞生物学研究的关系，实际上就是要探讨这3门学科之间的相互关系。细胞生物学无疑可以视为其中的核心学科，”一切生命的关键问题都要到细胞中去寻找“但是，遗传是根本，离开了基因，细胞就成了无源之水，失去存在的基础；发育是目的，没有发育，细胞就失去了存在的意义。

165 Zebrafish (Danio rerio)
基本的生物学特征 *胚胎透明，发育快： －－适合胚胎学研究 *后代数量大 (雌鱼每周能产几百枚卵): －－适合遗传学分析 *个体小： －－易于大规模饲养，养殖成本低 50条染色体 基因组：1.7GB，测序即将完成。 斑马鱼： 理想的模式脊椎动物 Movie

166 第一次作业 名词： 超薄切片；负染色；冷冻蚀刻；差速离心；
密度梯度离心；原位杂交；原代细胞；传代细胞；单层细胞；细胞贴壁；接触抑制；细胞株；细胞系；细胞工程；细胞融合；细胞拆合；单克隆抗体

167 简答题: 1、冷冻蚀刻技术的方法步骤; 2、超薄切片的制备过程; 3、比较电子显微镜和光学显微镜的区别; 4、假设已有质粒中含有rRNA基因克隆的大肠杆菌菌株,如何显示rRNA基因存在于小鼠的哪些染色体上?

168 根据光镜与电镜的特点，观察下列结构采用哪种显微技术最好，作出连线。
未染色活体细胞 扫描电镜显微技术 病毒颗粒 超薄切片显微技术 高尔基体结构 负染色电镜技术 细菌的移动 冷冻蚀刻电镜技术 细胞中某蛋白的分布 电镜三维重构技术 GFP融合蛋白在花粉管生长 暗视野显微技术 过程中的变化 细胞膜中的蛋白颗粒 普通复式光镜技术 果蝇口器的立体结构 相差显微技术 蛋白质二维晶体结构 荧光显微技术 考染后的植物细胞骨架 confocal 显微技术