High performance liquid chromatography HPLC

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1 High performance liquid chromatography HPLC
第18章 高效液相色谱法 High performance liquid chromatography HPLC

2 高效液相色谱仪示意图

3 第一节 HPLC的主要类型和原理 LLC LGC 分配、吸附、离子交换、空间排阻色谱法 化学键合相色谱法 离子抑制色谱法、离子对色谱法

4 二、化学键合相色谱法（BPC） （bonded phase chromatography）
化学键合相：用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体的表面上而形成的填料。

5 二、化学键合相色谱法（BPC） （bonded phase chromatography）
优点：均一性和稳定性好、不易流失、使用周期长、柱效高、重现性好、选择性高 正相：流动相的极性＜固定相的极性反相：流动相的极性＞固定相的极性 分类： 注意事项：pH 2～8

6 （一）正相键合相色谱法 固定相：氰基与氨基化学键合相 流动相：烷烃（正己烷）加适量极性调整剂 分别将氰乙硅烷基 [-Si(CH2)2CN]、
氨丙硅烷基 [-Si(CH2)2NH2]键合在硅胶上而制成 流动相：烷烃（正己烷）加适量极性调整剂

7 （一）正相键合相色谱法 正相键合相色谱主要用于分离极性至中等极性的分子型化合物 分离的一般规律： 极性强的组分的容量因子k大，后洗脱出柱。
流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分的k减小，tR减小。

8 （二）反相键合相色谱法 1. 非极性键合相 固定相：十八烷基（ODS，C18） 流动相：甲醇-水、乙腈-水

9 （二）反相键合相色谱法 2. 保留行为的主要影响因素 （1）溶质的分子结构： 溶质的极性越弱，k越大，tR越大
A k与tR均变大 B k与tR均变小 C k变大，tR变小 D k变小，tR变大

10 （三）反相离子对色谱法 概念及意义 离子对试剂 paired ion chromatography （PIC IPC）
分离可离子化或离子型的化合物 离子对试剂 分析碱类——烷基磺酸盐 分析酸类——四丁基季铵盐

11 （三）反相离子对色谱法 paired ion chromatography （PIC IPC） 分离机制

12 （三）反相离子对色谱法 paired ion chromatography （PIC IPC）

13 三、离子抑制色谱法 概念及意义 ion suppression chromatography （ISC）
ISC适用于分离3≤pKa≤7的弱酸或7≤pKa≤8的弱碱。 若pH控制不合适，溶质以离子态和分子态共存，则可能使峰变宽和拖尾。 一般，对于弱酸，降低流动相的pH值；对于弱碱，提高pH值

14 在分离阿司匹林和去甲麻黄碱时选用的固定相是C18柱，流动相为甲醇/水=50:50系统，加入正己烷磺酸，调节pH约3
在分离阿司匹林和去甲麻黄碱时选用的固定相是C18柱，流动相为甲醇/水=50:50系统，加入正己烷磺酸，调节pH约3.5；而4-氨基苯甲酸的分析同样采用C18柱，但是流动相却用四丁基氢氧化铵加入甲醇/水=50:50系统中，pH约7.5。 对于阿司匹林的pKa约为3.5，去甲麻黄碱pKa约为9.0，因此在pH约3.5时，弱酸阿司匹林不能解离以分子状态存在，即对阿司匹林为离子抑制机制；而去甲麻黄碱因接受质子而成为阳离子，因此加入正己烷磺酸与去甲麻黄碱阳离子构成离子对使其在C18柱上的保留值增加，从而得以分离。 在4-氨基苯甲酸的分析中，由于化合物中既有氨基，又有羧基，在pH约7.5时，氨基不能结合质子，而羧基却可以解离产生阴离子，因此加入四丁基氢氧化铵，使四丁基铵阳离子与羧基负离子形成离子对，增强其在柱上的保留。

15 二、化学键合相色谱法的流动相（p354） HPLC对流动相的基本要求： 化学稳定性好 对样品有适宜的溶解度，要求k在1～10（2～5）
必须与检测器相适应 纯度高、粘度小 流动相在使用之前需用微孔滤膜过滤并需进行脱气

16 b a 经试验获得试样在不同HPLC色谱条件下的色谱图如下（a-c） 1. 如果被测组分是1和4，应该选用a-c中哪个色谱条件？

17 三、分离条件的选择（p357） Van Deemter方程式 气-液色谱填充柱： 毛细管开口柱： H=A+B/u+Cu H=B/u+Cu
H=A+Cu 高效液相色谱法：

18 （一）高效液相色谱速率理论 1. 涡流扩散项A A= 2λdp 颗粒大小均匀、粒度小 3－10μm 1.7μm，超高效液相色谱法 UPLC

19 2. 纵向扩散项 B / u B = 2γDm Dm与流动相的粘度成反比，与温度成正比 B/u 可以忽略

20 3. 传质阻抗项 Cu

21 3. 传质阻抗项 Cu Dm∝T/u （1）固定相传质阻抗 Cm＝wmdp2/Dm （2）流动相传质阻抗 （3）静态流动相传质阻抗
选用低黏度的流动相

22 H=A+B/u+Cu H=A+Cu 流动相流速1mL/min

23 三、分离条件的选择（p358） （1）小粒度、均匀的球形化学键合相 （2）低黏度流动相，流速不宜快 （3）柱温适当

24 第三节 高效液相色谱仪 a. 恒组成溶剂洗脱 b. 梯度洗脱：在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的浓度配比。

25 检测器 紫外检测器的工作原理是Lambert-Beer定律，即当一束单色光透过光径长度一定的流通池时，若流动相不吸收光，则吸光度与被测组分的浓度成正比。 光电二极管阵列检测器

26 荧光检测器 蒸发光散射检测器 HPLC-MS 检测器

27 第四节 高效液相色谱分析方法 （1）定性分析：已知物对照法、HPLC－MS （2）定量分析：归一化法、外标法、内标法

28 一市售镇痛药片的包装上标明含有325mg阿司匹林和50mg的咖啡因。现取2片与0
一市售镇痛药片的包装上标明含有325mg阿司匹林和50mg的咖啡因。现取2片与0.0773g非那西丁，加入10ml乙醇，振摇10分钟，然后加入10ml0.5mol/L的甲酸铵最后稀释定容至100ml。药片中含有不溶性辅料，因此先过滤，然后取1μl滤液注入HPLC仪，记录色谱图结果如下：已知阿司匹林和咖啡因相对于非那西丁的校正因子分别为9.014和4.609。 编号 峰面积 阿司匹林 非那西丁 咖啡因 1 157595 170804 50693 2 153541 164174 48478 内标法 1. 该例中采用的定量方法是内标法还是外标法？ 2. 药片中的阿司匹林和咖啡因的含量是多少？ 3. 如果药片中阿司匹林和咖啡因的含量应为标示量的95%-105%和90%-110%，那么该药片含量符合规格吗？ 322mg， 53mg 99％， 106％， 合格

29 HPLC与经典液相色谱法对比： HPLC与GC对比 （1）应用了颗粒极细、规则均匀的固定相 （2）采用高压输液泵输送流动相
（3）在线检测器：紫外、荧光、质谱 HPLC与GC对比 （1）不受试样的挥发性和热稳定性的影响 （2）流动相的选择范围宽 （3）室温条件下分离

30 2 HPLC法和GC法的区别是：（ ） A 基本理论 B 流动相 C 适用性 D 操作条件 E.（B）（C）（D）
1 在高效液相色谱中，下述哪种操作，不能改变色谱柱的选择性？（ ） A 改变固定相的种类 B 改变流动相的种类 C 改变填料的粒度和柱长 D 改变流动相的配比 2 HPLC法和GC法的区别是：（ ） A 基本理论 B 流动相 C 适用性 D 操作条件 E.（B）（C）（D）

31 3. 在液相色谱中，为了改变柱子的选择性，可以进行如下哪些操作？
A 改变流动相的种类或柱长 B 改变固定相的种类或柱长 C 改变流动相和固定相的种类 D 改变柱长 E 改变填料的粒度 4. 所谓反相液相色谱是： A流动相的极性大于固定相的极性 B 流动相的极性小于固定相的极性 C 流动相不动，移动固定相 D组份与流动相分子间有相互作用力，与固定相分子间无相互作用

32 5. 用反相色谱法分离弱极性混合物，以甲醇－水为流动相，若增加甲醇的比例，则组分容量因子k与保留时间tR将会：
A k与tR均变大 B k与tR均变小 C k变大，tR变小 D k变小，tR变大 6. 选择梯度洗脱方法进行分离的样品主要是： A 同分异构体 B 同系物 C 沸点差异大的混合物 D 极性差异大的混合物

33 酸碱滴定法—间接滴定法 凯氏定氮法 NH4＋的测定 （Ka＝5.6×10－9） NH4＋＋OH- H＋ H3BO3