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第九章 维生素类药物的分析 维生素（vitamin）：维持人类机体正常代谢功能所必需的一类活性物质，主要用于机体的能量转移和代谢调节，体内不能自行合成，须从食物中摄取。 Ch.P收载：维生素A、B1、B2、B6、B12、C、D2、D3、E、K1、叶酸、烟酸、烟酰胺等原料及制剂共30多个品种
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按其溶解度分为： 维生素类药物的分析方法： 脂溶性维生素：如A、D、E、K等 水溶性维生素：如B1、B2、C、烟酸、泛酸、叶酸等 微生物法
化学法 物理化学法
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第一节 维生素A的分析 维生素A 包括 维生素A1（视黄醇，retinol） 去氢维生素A（dehydroretinol，维生素A2）
去水维生素A（anhydroretinol，维生素A3） 中国药典还收载了维生素A胶丸、维生素AD胶丸和维生素AD滴剂等。
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一、结构与性质 （一）结构 维生素A的结构为具有一个共轭多烯醇侧链的环己烯，因而具有许多立体异构体。
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（二）性质 1. 溶解性：与氯仿、乙醚、环己烷和石油醚能任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶。
2. 不稳定性：维生素A中有多个不饱和键，性质不稳定。 3. 紫外吸收特性：在325nm~328nm的范围内有最大吸收，可用于鉴别和含量测定。 4. 与三氯化锑呈色：在氯仿中反应产生不稳定的蓝色。
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二、鉴别试验 （一）三氯化锑反应 1. 原理 ：维生素A在饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液中即显蓝色，渐变成紫红色。其机制为形成了不稳定的蓝色碳正离子。 2. 注意事项 ：反应需在无水、无醇条件下进行。氯仿中必须无醇。
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（二）紫外吸收光谱法 维生素A的无水乙醇-盐酸溶液在326nm的波长处有单一的吸收峰。将此溶液置水浴上加热30s，迅速使冷却，照上法进行扫描，则应在348nm、367和389nm的波长处有三个尖锐的吸收峰，且在332nm波长处有较低的吸收峰或拐点。
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（三）薄层色谱法 1. 方法：以硅胶G为吸附剂，环己烷-乙醚（80:20）为流动相。展开后，置空气中挥干，以三氯化锑溶液显色，比较所显蓝色斑点位置，即可鉴别。 2. 讨论：维生素A醇及其醋酸酯、棕榈酸酯均显蓝绿色，其Rf值分别为0.1、0.45和0.7。
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三、含量测定 （一）紫外分光光度法 1. 三点校正法的建立：维生素A在325nm~328nm的波长范围内具有最大吸收，可用于含量测定。维生素A原料中常混有其他杂质，故采用“三点校正法”测定，即在三个波长处测得吸收度后，在规定的条件下以校正公式进行校正，再进行计算。这样可消除无关吸收的干扰，求得维生素A的真实含量。
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2. 测定原理 （1）杂质的无关吸收在310nm~340nm的波长范围内几乎呈一条直线，且随波长的增大吸收度下降。 （2）物质对光吸收呈加和性的原理。即在某一样品的吸收曲线上，各波长处的吸收度是维生素A与杂质吸收度的代数和，因而吸收曲线也是二者吸收的叠加。
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3. 波长选择 ：三点波长的选择原则为一点选择在维生素A的最大吸收波长处（1）；其他两点选择在1的两侧各选一点（2和3）。
（1）第一法（等波长差法） （2）第二法（等吸收比法）
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4 杂质的吸收 （1）维生素A2和维生素A3：维生素A2在345nm~350nm波长范围内有吸收。 （2）维生素A的氧化产物：环氧化物、维生素A醛和维生素A酸。 （3）维生素A在光照下产生的无活性的聚合物：鲸醇。 （4）维生素A的异构体等： 以上这些杂质在310nm~340nm的波长范围内有吸收，所以干扰维生素A的测定。
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5. 合成的维生素A和天然鱼肝油中的维生素A均为酯式维生素A，如供试品中干扰测定的杂质较少，能符合下列第一法测定的规定时，可用溶剂溶解供试品后直接进行测定，否则应按第二法，经皂化提取除去干扰后测定。
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6. 讨论 （1）维生素A醋酸酯的吸收度校正公式是用直线方程式法推导而来； （2）在应用三点校正法时，除其中一点在最大吸收波长处测定外，其余两点均在最大吸收峰的两侧进行测定。如果仪器波长精度不准确时，会产生较大的误差。 7. 应用示例 中国药典收载的维生素A胶丸、维生素AD胶丸和维生素AD滴剂等均采用本法测定含量
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（二）三氯化锑比色法 1. 原理 维生素A与三氯化锑的无水氯仿溶液作用，产生不稳定的蓝色，在618~620nm的波长处有最大吸收，符合Beer定律。 2. 注意事项 （1）本法产生的蓝色不稳定，要求操作迅速，一般规定加入三氯化锑后应在5s~10s内测定。 （2）反应介质需无水 （3）温度对呈色强度的影响很大 （4）本反应并非维生素A专属，在相同条件下，某些有关物质均与三氯化锑显蓝色，干扰测定，常使测定结果偏高。 （5）三氯化锑试剂有强的腐蚀性，易损坏皮肤和仪器，使用时应严加注意。
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（三）高效液相色谱法 采用RP-HPLC法同时测定人血清中维生素A和维生素E的含量。根据不同病理生理状态下人血清中维生素A、E的浓度，寻求弄清与某些疾病的关系，为临床治疗学、营养学等研究提供参考。 1. 仪器与色谱条件 色谱柱为C18；流动相为甲醇-水（96:4）；流速为1.2ml/min。内标物为维生素A醋酸酯。 2. 分析用样品液 对照品：维生素A，维生素E，维生素A醋酸酯
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3. 方法与结果 （1）测定峰高，用峰高比对浓度做图。
（2）维生素A的回归方程为：Y=1.6651 10-3X，r=0.9995(n=7)，维生素A在86.8g/L~972.2g/L的浓度范围内呈良好的线性关系。 （3）检测量 ng （4）回收率试验：取含已知维生素A和维生素E的正常人血清，加入含一定浓度内标液的无水乙醇，定量加入一定浓度的维生素A和维生素E，用正己烷提取，进样，测定峰高比，代入回归方程，计算结果。 （5）精密度试验 用正常人血清样品进行精密度试验，由回归方程计算实际浓度。维生素A和维生素E的日内、日间精密度的最大值分别为2.75%；5.40%和2.45%；4.87%。
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4. 讨论 （1）本法同时使用检测器波长与灵敏度变换程序，对吸收特性不同的物质采用不同的测定波长与灵敏度。 （2）使用维生素A醋酸酯作为内标 （3）样品处理方法简便、结果准确，样品经液-液萃取后便可进样。 （4）all-trans-retinol和-tocopherol是血清中维生素A和维生素E的主要形式和主要活性成分，分别约占血清中总量的95%和88%，而其他形式的维生素A和维生素E不干扰测定。 （5）血清样品中在制备与贮藏温度下，保存6个月未见发生变化。
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第二节 维生素B1的分析 维生素B1广泛存在于米糠、麦麸、酵母中，此外来源于人工合成。本品具有维持糖代谢及神经传导与消化的正常功能，主要用于治疗脚气病、多发性神经炎和胃肠道疾病。药典中收载维生素B1及其片剂和注射液。 制备或来源：可由2-甲基呋喃和丁烯腈等或由β-乙氧基丙酸乙酯和甲酸乙酯等合成。 备注：医药上常用的是其盐酸盐或硝酸盐制剂。天然存在于米糠、麦麸、瘦猪肉、花生、黄豆等食品中。
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一、结构与性质 （一） 结构 维生素B1(亦称盐酸硫胺)是由氨基嘧啶环和噻唑环通过亚甲基连接而成的季铵类化合物，噻唑环上季胺及嘧啶环上氨基，为两个碱性基团，可与酸成盐。 化学名称为氯化4-甲基-3[（2-甲基-4-氨基-5-嘧啶基）甲基]-5-（2-羟基乙基）噻唑翁离子盐酸盐。
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分子式：C12H18Cl N4OS 分子量：337.28
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（一） 性质 1 溶解性 白色晶体或结晶性粉末，在水中易溶，在乙醇中微溶，在乙醚中不溶。
（一） 性质 1 溶解性 白色晶体或结晶性粉末，在水中易溶，在乙醇中微溶，在乙醚中不溶。 2 硫色素反应 碱性介质中可开环，经铁氰化钾氧化成具有荧光的硫色素，溶于正丁醇中呈蓝色荧光。 3 紫外吸收特性 在246nm波长处吸收系数为421 4 与生物碱沉淀试剂反应 沉淀剂（如碘化汞钾、三硝基酚、碘溶液和硅钨酸等）反应成恒定的沉淀。 5 氯化物的特性 氯化物的鉴别反应。
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二、鉴别试验 （一） 硫色素反应 1 .原理 维生素B1在碱性溶液中，可被铁氰化钾氧化生成硫色素。硫色素溶于正丁醇中，显蓝色荧光。
（一） 硫色素反应 1 .原理 维生素B1在碱性溶液中，可被铁氰化钾氧化生成硫色素。硫色素溶于正丁醇中，显蓝色荧光。 （二）沉淀反应 1 .维生素B1与碘化汞钾生成淡黄色沉淀 2.维生素B1与碘生成红色沉淀 3 .维生素B1与硅钨酸生成白色沉淀 4 .维生素B1与苦酮酸生成扇形白色结晶。 （三）氯化物反应 （四）硝酸铅反应 与NaOH共热，分解产生硫化钠，可与硝酸铅反应生成黑色沉淀。
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二、含量测定 有非水滴定法，紫外分光光度法和硫色素荧光法，药典用非水溶液滴定法测定原料药，片剂和注射液则采用硫色素荧光法。
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（一） 非水滴定法 1 .原理 维生素B1分子结构中含有两个碱性的已成盐的伯胺和季胺基团，在非水溶液中，均可与高氯酸作用。根据消耗高氯酸的量即可计算维生素B1的含量。 2 .方法 加冰醋酸、醋酸汞、喹哪啶红-亚甲蓝混合指示液，高氯酸滴定液滴定至溶液显天蓝色，空白试验效正。每1ml高氯酸滴定相当于 3 .讨论 （1）有机碱的氢卤酸盐在用高氯酸滴定前，须加入醋酸汞试液，以消除氢卤酸盐对非水滴定法的干扰。 （2）维生素B1具有两个碱性基团，故与高氯酸反应的摩尔比为1：2 （3）本法可用于弱酸性特别是弱碱性药物及其盐类的含量测定
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（二）紫外分光光度法 1 .原理 维生素B1分子中具有共轭双键结构，在紫外区有吸收，测定其最大吸收波长处吸收度即可计算含量。药典收载维生素B1片剂和注射剂均用本法测定含量。 2 .维生素B1片的测定 （1）取本品20片，精密称定，研细，称取细粉适量，加盐酸，在246nm的波长处测定，E1cm1%已知 （2）计算 标示量%= 式中 A为供试品在246nm波长处测得的吸收度；D为供试品的稀释倍数；W为维生素B1的平均片重；W为称取维生素B1片粉的量。
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3 .维生素B1注射液的测定 计算：标示量%= 式中 A为供试品在246nm波长处测得的吸收度；D为供试品的稀释倍数。 4 .讨论 B1原料药采用非水滴定法，而片剂和注射液采用分光光度法。由于维生素B1的紫外吸收峰随溶液pH的变化而变化，pH=2时，最大吸收波长为246nm，吸收系数为421;可用差示分光光度法测定其含量，消除背景和辅料的干扰。
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原料采用非水滴定法，片剂和注射液采用分光光度法。 可采用差示分光光度法消除背景和辅料的干扰。
4.讨论： 原料采用非水滴定法，片剂和注射液采用分光光度法。 可采用差示分光光度法消除背景和辅料的干扰。 pH=2.0时，最大吸收波长为246nm， =421 pH=7.0时，最大吸收波长为 nm， =345 pH=7.0时，最大吸收波长为266nm， =255
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标准曲线绘制 精密称取干燥至恒重的维生素B1 100mg，置100ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液，精密量取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml贮备液各二份，分别置100ml量瓶中。一份用缓冲液稀释至刻度；另一份用盐酸液稀释至刻度，摇匀，取上述五组浓度相同、pH不同的溶液，在247nm处分别测定差示吸收值（ΔA）。以浓度C为横坐标，以差示吸收值ΔA为纵坐标绘制标准曲线。
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样品的测定 取本品20片，精密称定，研细。精密称取适量粉末，（约相当于维生素B150mg），置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，弃去初滤液。精密量取续滤液2.0ml二份，分别置100ml量瓶中，分别用缓冲液和盐酸液稀释至刻度，摇匀。将前者置参比池中，后者置样品池中。在247nm波长处测定差示吸收值。由标准曲线求得维生素B1浓度，计算维生素B1片含量（标示量的百分数）。
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（二） 硫色素荧光法 1. 原理 维生素B1在碱性溶液中被铁氰化钾氧化成硫色素，用异丁醇提取后，再紫外光照射下呈现兰色荧光，通过对照品比较荧光强度，即可测得供试品含量。 2. 方法 （1）氧化试剂的制备：取新鲜配制的铁氰化钾溶液 （2）对照品溶液制备 （3）供试品溶液的制备
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5ml供试品溶液中维生素B1的μg数 = 式中 A和S分别为供试品溶液和对照品溶液测得的平均荧光读数；b和d则分别为其相应的空白读数；0.2为对照品溶液的浓度（μg/ml）；为测定时对照品溶液的取样体积（ml）。
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3 讨论 （1）硫色素反应为维生素B1的专属性反应，虽非定量完成，但在一定条件下形成硫色素与维生素B1浓度成正比，可用于维生素B1及制剂的含量测定。 （2）本法以维生素B1特有的硫色素反应为原理，故不受氧化破坏产物的干扰，测定结果较为准确。 （3）本法中使用的氧化剂，除铁氰化钾外，尚可用氯化汞或溴化氰。溴化氰能将维生素B1完全定量的氧化为硫色素，在较宽的浓度范围内与荧光强度成正比。
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第三节 维生素C的分析 维生素C (Vitamin C)又称L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)，有天然维生素 C和合成维生素C。
药典收载有维生素C原料及其片剂、泡腾片、颗粒剂和注射液。（市场上如维生素C的饮品、艾兰得维生素C片、维生素C泡腾片、维生素C咀嚼片、维生素C银翘片等）
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补充内容 药理作用 维生素C制剂的适应症 需求量和来源 严重不良反应 与其他药物联用 储藏
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一、结构与性质 （一）结构 维生素C分子结构中具有二烯醇结构，具有内酯环，且有两个手性碳原子(C4、C5),不仅使维生素性质极为活泼，且具旋光性，有四个光学异构体。
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（二） 性质 1 溶解度： 水溶性 2 酸 性： 二烯醇基结构表现为一元强酸 3 还原性 ：二烯醇基结构表现为还原性
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4 旋 光 性： 两个手性碳原子，四个光学异构体，
其中L(+)-抗坏血酸活性最强。 5 水 解 性：在强碱中内酯环可水解，生成酮酸盐。
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6 糖类的性质： 有糖类的相似结构，具有糖类的性质
和反应。 7 UV吸收特性 ：在稀盐酸溶液在243nm波长处有最大 吸收， 为560。
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二、 鉴别试验 （一）与硝酸银反应 原理：维生素C分子中有二烯醇基，具有强还原性， 可被硝酸银氧化为去氢抗坏血酸，同时产 生黑色沉淀。
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（二）与2，6-二氯靛酚反应 原理：2，6-二氯靛酚为一染料，其氧化型在酸性 介质中为玫瑰红色，碱性介质中为蓝色。与维
生素作用后生成还原性的无色酚亚氨。
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（三）与其他氧化剂反应 （四） 糖类的反应 维生素C还可被亚甲蓝、高锰酸钾、碱性酒石酸铜试液、磷钼酸等氧化剂氧化为去氢抗坏血酸。
（四） 糖类的反应 维生素C可在三氯化醋酸或盐酸存在下水解、脱羧、生成戊糖，再失水，转化为糠醛，加入吡咯，加热产生蓝色。
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（五） 紫外分光光度法 维生素C在盐酸液中，在243nm波长处有唯一的最大吸收，并规定其吸收系数为 之间。
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三 、杂质检查 （一） 溶液的澄清度与颜色检查
（一） 溶液的澄清度与颜色检查 受pH、空气、光线和温度的影响，分子中内酯环可发生水解，并进一步脱羧反应生成生成糠醛聚合成色。 1、0.2g/mL VC原料 420nm波长处测定，A不得过0.03 2、50mg/mL VC注射液 420nm波长处测定，A不过0.06 3、0.05g/mL VC片剂 440nm波长处测定，A不过0.07
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（二）铁、铜离子的检验 1. 铁： 标准铁溶液（取硫酸铁铵）为对照，照原子分 光光度法在248.3nm的波长处分别测定
2. 铜：标准铜溶液为对照，照原子分光光度法， 在324.8nm的波长处分别测定。
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四、含量测定 维生素C的含量测定大多是基于其具有较强的还原性，可被不同的氧化剂定量氧化。 容量分析法：碘量法、2，6-二氯靛酚法等。
仪 器 法：比色法、 紫外分光光度法、高 效液相色谱法。
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（一）碘量法 1．原理：维生素C在醋酸酸性条件下，可被碘定量氧化。根据消耗碘滴定液的体积，即可计算维生素C的含量。 2．方法 ： T：每1ml碘滴定液（0.1mol/L）相当于8.806mg的C6H8O6。 3．注意事项 （1）操作中加入稀醋酸使滴定在酸性溶液中进行。 （2）加新沸过的冷水目的。 （3）适用于原料、片剂泡腾片、颗粒剂和注射液。
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（二）2，6-二氯靛酚滴定法 1．原理：2，6-二氯靛酚（2，6－二氯吲哚酚）即为一染料，其氧化型在酸性溶液中显红色，碱性溶液中为蓝色。 2．注意事项 （1）非维生素C的专一反应，其它还原性物质也有干扰。
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（2）由于2，6－二氯靛酚滴定液不够稳定，贮藏时易缓
缓分解，故需经常标定，贮备液不宜超过一周。 （3）本法的专属性较碘量法高，多用于含维生素C的制 剂及食品的分析。 （4）空白校正
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（三）HPLC法 示例：HPLC法测定多种维生素的含量
HPLC法分析脂溶性维生素制剂的报道很多，本法适用于多种维生素的含量测定。维生素具有脂溶性和水溶性两大类，在含水介质中，又受到光、空气、温度、pH的影响，使测定结果不理想。因而，提出用甲醇和水都能溶解的樟脑磺酸，作为离子对试剂，以二巯基丙烷磺酸钠（DMPS）作为抗氧剂。
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1. 色谱条件 （1）色谱柱：ODS柱 （2）流动相A：取樟脑磺酸，溶于水中，加甲醇。 流动相B：将甲醇经滤膜过滤、脱气（脂溶性维生素）。 （3）检测波长：水溶性和脂溶性维生素分别为272和280nm。 2. 各种溶液的制备 水溶性维生素内标液、水溶性和脂溶性维生素对照品、 水溶性和脂溶性维生素供试品、维生素供试品溶液的制备。 3. 测定方法 水溶性维生素以内标法计算，脂溶性维生素以外标法计算结果。
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示例：高效液相色谱法测定人血浆中维生素C浓度
（1）色谱条件：色谱柱为ODS；流动相为5mmol/L磷酸二氢钠溶液(磷酸调PH至2.5)；流速为1.0ml/min；检测波长245nm，柱温为20℃。 （2）标准系列溶液配制 （3）血浆样品处理 （4）专属性考察 （5）线性关系考察： 线性回归方程为：Y=1.57010X ，r=0.9995, 线性范围为1.0g/ml-50.0g/ml,最低定量限为1.0g/ml。
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（6）精密度与准确度考察：低、中、高浓度的标准系列溶
液浓度进行6样本分析，其日内RSD≤4.36%。 （7）回收率与稳定性考察： 前述低、中、高浓度的标准 系列溶液浓度进行6样本分析，考察样品回收率。三 种浓度下，回收率分别为90.1%、95.4%和97.5%。 （8）样品测定： 每天抽取的血样当日测定，每天建立一 条标准曲线，并随行测定高、中、低3个浓度的双样 本质控样品。
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例 题 1、维生素C含量测定方法如下：精密称取本品0.2198g，加新沸过的冷水100mL与稀醋酸10mL溶解后，加淀粉指示剂1mL，立即用碘液（0.1038mol/L）滴定至终点，消耗标准液23.83mL，已知：每1mL的碘液（0.1mol/L）相当于8.806mg维生素C。计算：维生素C的百分含量是多少？
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f= =1.038, S=0.2198g， V= 23.83mL, T=8.806mg 百分含量= = 百分含量=99.1%
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2、维生素C片（规格100mg）的含量测定：取20片，精密称定，重2. 1020g，研细，精密称取0
2、维生素C片（规格100mg）的含量测定：取20片，精密称定，重2.1020g，研细，精密称取0.4012g片粉，置100mL容量瓶中，加稀醋酸10mL与新沸过的冷水至刻度，振摇，使维生素C溶解，摇匀，用干燥滤纸迅速滤过，精密量取续滤液50mL，加淀粉指示液1mL，用碘滴定液（0.1008mol/L）滴定至溶液显蓝色并持续30s不褪，消耗碘滴定液21.36mL，每1mL的碘滴定液（0.1mol/L）相当于8.806mg的维生素C。求维生素C片中维生素C含量占标示量的百分率。
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C理=0.1008mol/L ,C实=0.1 mol/L, f= = =1.008, T=8.806mg, V=21.36mL, 标示量=100mg/片， S=0.4012g, D=2 = =0.1051g/片 标示量的百分率= 标示量的百分率=99.3%
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第四节 维生素D的分析 中国药典主要收载有维生素D2、D3原料药；维生素D2胶丸和注射剂；维生素D3注射剂。USP（24）收载有片剂、胶囊、口服液等剂型。BP（2000）收载的剂型有片剂、口服液、注射液以及钙与维生素D2、D3制成的复方片剂。
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一、结构与性质 （一）结构 维生素D2为9，10-开环麦角甾-5，7，10（19），22-四烯-3-醇，又名骨化醇或麦角骨化醇。
分子式：C28H44O 分子量：396.64
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分子式：C27H44O 分子量：384.64 维生素D3为9，10-开环胆甾-5，7，10（19）-三烯-3-醇， 又名胆骨化醇。
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（二）性质 1．性状： 维生素D2、D3均为无色针状结晶或白色结晶性粉末；无臭，无味；遇光或空气均易变质。 2．溶解性： 维生素D2在氯仿中极易溶解，在乙醇、丙酮或乙醚中易溶；维生素D3在乙醇、丙酮、氯仿或乙醚中极易溶解；二者均在植物油中略溶，在水中不溶。
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3．不稳定性： 维生素D2、D3因含有多个烯键，所以极为不稳定，遇光或空气及其他氧化剂均发生氧化而变质，使效价降低，毒性增强。本品对酸不稳定。
5．显色反应： 本品的氯仿溶液，加醋酐与硫酸，初显黄色，渐变红色，迅即变为紫色，最后变为绿色。 6．紫外吸收特性： 在265nm的波长处测定吸收度，维生素D2的吸收系数为460～490；维生素D3的吸收系数为465～495。
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二、鉴别试验 （一）显色反应 1．与醋酐-浓硫酸反应 加氯仿后，加醋酐与硫酸振摇，维生素D2初显黄色，渐变红色，迅即变为紫色，最后成绿色。维生素D3初显黄色，渐变红色，迅即变为紫色、蓝绿色，最后变为绿色。 2．与三氯化锑反应 3．其他显色反应 维生素D与三氯化铁反应呈橙黄色，与二氯丙醇和乙酰氯试剂反应显绿色，均可用于鉴别，但专属性不强。
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（二）比旋度鉴别 取维生素D2加无水乙醇比旋度为+102.5至+107.5；维生素D3比旋度为+105至+112（快速操作） 。 （三）其他鉴别方法 维生素D2、D3可用薄层色谱法、HPLC法和制备衍生物测熔点进行鉴别。 （四）维生素D2、D3的区别反应 取维生素D，溶于乙醇。取此液，加乙醇和硫酸。维生素D2显红色，在570nm波长处有最大吸收、维生素D3显黄色，在495nm波长处有最大吸收。
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三、杂质检查 （一）麦角甾醇的检查 中国药典规定维生素D2检查麦角甾醇，而维生素D3则不作要求。 （二）前维生素D的光照产物
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四、含量测定 （一）维生素Ｄ测定法 本法系用高效液相色谱法测定维生素Ｄ（包括维生素Ｄ２和维生素Ｄ３，下同）及其制剂、维生素AD制剂或鱼肝油中所含维生素D及前维生素D经折算成维生素D的含量，以单位表示，每单位相当于维生素D 0.025g。 无维生素A醇及其他杂质干扰的供试品可用第一法测定，否则应按第二法处理后测定；如果安第二法处理后，前维生素D峰仍受杂质干扰，仅有维生素D峰可以分离时，则应按第三法测定。
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1．第一法 （1）对照品贮备溶液的制备 （2）内标溶液的制备： （3）色谱条件与系统适用性试验：用硅胶为填充剂，正己烷-正戊醇（997:3）为流动相，检测波长为254nm。 取维生素D3对照品贮备溶液，加正己烷，使溶液中含有前维生素D3、反式维生素D3、维生素D3和速甾醇D3；测定维生素D3的峰值，先后进样5次，相对标准偏差应不大于2.0%；前维生素D3（与维生素D3的比保留时间约为0.5）与反式维生素D3（于维生素D3的比保留时间约为0.6）以及维生素D3与速甾醇D3（与维生素D3的比保留时间约为1:1）的峰分离度均应大于1.0。 （4）校正因子测定 （5）含量测定
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2．第二法 （1）皂化提取 （2）净化用色谱柱系统分离收集维生素D：量取供试品溶液，注入以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，以甲醇-水（50：50：2）为流动相进行分离，检测波长为254nm。 （3）含量测定 3．第三法
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（二）讨论 1．本法采用以硅胶为填充剂，以非极性溶剂正己烷-正戊醇（997：3）为流动相的正相高效液相色谱法测定，检测波长为254nm。 2．由于维生素D易受光照而发生变化，测定应在半暗室中及避免氧化的情况下进行，必要时可通惰性气体和使用棕色玻璃容器。 3．皂化及提取过程极为复杂，振摇不剧烈及水浴温度大于40℃时，则测定结果偏低。提取溶剂以苯为最好，但苯毒性较大，因此多采用己烷或戊烷。 4．净化后的维生素D，其测定溶液以甲苯-流动相B溶解，同时加入内标溶液。内标亦可选用邻苯二甲酸二甲酯。 5．分析用色谱系统适用性试验时的维生素D、前维生素D试验液的制备方法。
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6．中国药典规定，当样品经皂化提取及净化用色谱系统分离收集后，前维生素D峰仍受杂质干扰时，则将皂化提取及净化色谱系统收集的维生素D混合洗脱液，用氮气流挥干后，加异辛烷溶解，通氮赶除空气，迅速加正己烷，供试液与对照液交替精密进样，量取维生素D的峰值，按外标法计算含量。 7．若供试品中无维生素A醇及其它杂质干扰，则可直接进样，进行色谱测定。
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第五节 维生素E的分析 维生素E为-生育酚及其各种酯类，有天然品和合成品之分。天然品为右旋体，合成品为消旋体，右旋体与消旋体价比为1.4:10。一般药用品 为合成品，即消旋体。中国药典收载的维生素E是人工合成的消旋-生育酚醋酸酯，还收载维生素E粉剂、片剂、胶丸与注射液。USP（24）收载的是指右旋或外消旋-生育酚及其醋酸酯和琥珀酸酯。JP和BP收载的是外消旋-生育酚醋酸酯和-生育酚。
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（一）结构 维生素E为苯并二氢吡喃醇衍生物，苯环上有一个乙酰化的酚羟基，故又称为生育酚。化学名称为（±）-2，5，7，8-四甲基-2-（4，8，12-三甲基十三烷基）-6-苯并二氢吡喃醇醋酸酯。主要有、、和等多种异构体，其中以-异构体的生理活性最强。 分子式C6H4BrNO2 分子量202.00
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（二）性质 1．溶解性 维生素E为微黄色或黄色透明的粘稠液体，在无水乙醇、丙酮、乙醚、石油醚中易溶，在水中不溶。
4．紫外吸收特性 无水乙醇液在284nm的波长处有最大吸收，其吸收系数为 。
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二、鉴别试验 （一）硝酸反应 原理： 维生素E在硝酸酸性条件下，水解生成生育酚，生育酚被硝酸氧化为邻醌结构的生育酚而显橙红色。
（二）三氧化铁反应 原理： 维生素E在碱性条件下，水解生成游离的生育酚，生育酚经乙醚提取后，可被三氯化铁氧化成对-生育醌；同时三价铁离子被还原为二价铁离子，二价铁离子与联吡啶生成红色的配位离子。 讨论： 测定前必须将维生素E水解成-生育酚，操作麻烦，同时方法的专属性也不高。
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（三）紫外光谱法 （四）薄层色谱法 供试品点于硅胶G薄层板上，以环己烷-乙醚（4：1）为展开剂，喷以浓硫酸，在105℃加热5min，-生育酚、-生育酚醋酸酯和-生育醌的Rf值分别为0.5、0.7和0.9。 （五）其他方法 气相色谱法和红外光谱法均可用于维生素E的鉴别。中国药典采用气相色谱法鉴别维生素E胶丸和维生素E粉。
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三、杂质检查 （一）酸度 （二）生育酚 中国药典采用硫酸铈滴定法检查过程中未酯化的生育酚。
原理： 利用游离生育酚的还原性，可被硫酸铈定量氧化。故在一定条件下以消耗硫酸铈滴定液的体积来控制有利生育酚的限量。游离剩余酚被氧化成生育酚后失去两个电子，滴定反应的摩尔比为1:2，生育酚的分子量为430.7，即1mol的硫酸相当于1/2mol的生育酚。
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四、含量测定 维生素E的含量测定方法很多，主要是利用维生素E水解产物游离生育酚的易氧化性质，用硫酸铈滴定液直接滴定。近年来中国药典、USP、BP等国家药典多采用气相色谱法。该法专属性强，简便快速，特别适合于维生素E制剂的分析。
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（一）气相色谱法 1．方法特点： 该法具有高度选择性，可分离维生素E及其异构体，选择性地测定维生素E，目前该法为各国药典所采用。中国药典收载的维生素E原料及其制剂均采用本法测定，维生素E的沸点虽高达350℃，但仍可不经衍生化直接用气相色谱法测定含量，测定时均采用内标法，因内标法不受进样量和操作条件变化对结果的影响。
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2．测定方法 （1）色谱条件 载气为氮气，以硅酮为固定相，涂布于硅藻土或高分子多孔小球上，柱温为265℃，检测器为氢火焰离子化检测器（FID）。 （2）系统适用性试验：理论塔板数（n）按维生素E峰计算应不低于500。分离度R应大于2。 （3）校正因子测定 （4）样品测定
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（二）高效液相色谱法 1．色谱条件 十八烷基键合硅胶为固定相；流动相为甲醇-水（49:1）；紫外检测器，检测波长为292nm。
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（三）荧光分光光度法 维生素E在生物体内具有阻断自由基链锁反应的作用，从而保护细胞膜的稳定性。
方法： 取三支试管，标明U、S、B，分别加入血清、对照品和水，加无水乙醇，加入正己烷，混匀，吸取上清液于1cm石英比色池中，在荧光分光光度计上以发射、激发波长间隔为40nm，在220nm~400nm扫描其同步荧光光谱，测定同步荧光峰的荧光强度信号值。荧光分光光度计的工作条件为双狭缝10nm，响应时间2s，扫描速度600nm/min。
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结果： （1）维生素E的荧光光谱：维生素E的激发波长为295nm，荧光发射波长为325nm，维生素E荧光峰与溶剂的拉曼峰重叠，因而其常规荧光测定法受拉曼光谱的影响十分严重。 （2）在=40nm时维生素E同步荧光光谱；对照品管、测定管同步荧光光谱完全一致。 （3）不同对维生素E同步荧光光谱的影响：随着的增加，同步荧光峰的荧光强度逐步增强，在为40nm以后，同步荧光峰强度逐渐降低。
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（4）线性关系考察： （5）回收率试验：在两份维生素E含量不同的血清标本中分别加入一定量的维生素E对照品液，进行回收试验，结果回收率为99.0%～100.9%。 （6）精密度试验：两份混合血清标本分别进行批内（n=20）、批间（共测定10天）RSD测定，结果批内RSD为2.21%~2.41%；批间RSD为2.82%-2.96%。
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讨论： 在荧光分析中经常遇到溶剂的瑞利散射光、容器表面的散射光、胶粒的散射光以及溶剂的拉曼光的干扰。散射光和拉曼光通常对分析方法的灵敏度、准确度有显著影响。 同步荧光扫描技术与通常的荧光法比较具有以下优点：①使光谱简化；②使谱带窄化；③减小光谱的重叠现象；④减小散射光的影响。 同步荧光法测定血清维生素E，选择适当的，可有效地消除拉曼光的干扰，获得满意的效果。在测定血清维生素E时，选择为40nm进行同步荧光扫描，既兼顾测定方法的灵敏度，又消除了溶剂拉曼光的干扰，因而可以提高测定方法的灵敏度和准确度。
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．当用碘量法测定维生素C时，为何在醋酸酸性介质中滴定，且使用煮沸放冷的水为溶剂？测定维生素C注射剂时应注意什么？
2.下列药物请按规定方法含量，并说明测定原理（文字或表达式）及主要条件（溶剂、滴定剂、指示剂等）。 维生素C的碘量法
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