免疫实验设计 演讲：刘文磊 资料：李亚妃 孙建超

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1 免疫实验设计 演讲：刘文磊5108001188 资料：李亚妃5108001165 孙建超5108001190
整理：郭丽萍 解会超 制作：李文静

2 IL-17,IL-10和IFN-γ在炎症性肠病中的表达
【摘要】 • 目的：检测IL-17，Th-17在炎症性肠病（inflammatory bowl disease，IBD）患者中的表达，探讨诸炎症因子及Th17在炎症性肠病的发病及治疗中的作用。 原理：Th17 细胞主要通过分泌白细胞介17( IL-17) , 诱导中性粒细胞向炎症局部迁移, 引起炎症反应, 在自身免疫性疾病和感染中发挥重要作用；IL-10可以保护对有炎性肠炎抑制作用的淋巴细胞, 且可以抑制由其介导的宿主自发免疫反应；h1细胞效应因子IFN-γ可以抑制Th17细胞增殖和分化，研究炎性肠炎患者血清中IL-17,IL-10和IFN-γ浓度可以进一步证明TH17细胞与炎性肠症的关系。

3 • 方法：流式细胞术（FACS）胞外染色的方法对IBD患者及正常人外周血中的T细胞亚群进行分析;胞内染色的方法对IL-10、IL-17、IFN-γ分泌细胞-比例进行检测,ELISA的方法检测患者及健康人（正常对照组）血清中IL-10,IL-17, IFN-γ水平，并用免疫组织化学法检测患者及正常对照组结肠黏膜局部IL-17的表达。

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5 结果：正常对照组结肠黏膜局部未检测到IL-17A的表达，而UC和CD组在结肠黏膜活组织中均检测到IL-17A的表达。同样UC和CD组血清中IL-17明显增高，而正常对照组血清未检出IL-17；UC和CD组患者血清IL-10水平均较对照组升高（P<0.05），且CD组明显高于UC组（P<0.05）；CD、UC组与正常对照组血清中IFN-γ的表达差异大（P>0.05）。 结论：IL-17A不仅在缓解期IBD患者结肠黏膜局部 达，同时在其血清中高表达，提示Th17及其分泌的 IL-17A在缓解期IBD患者的发病过程中起重要作用， 并伴随促炎因子和抑炎性因子失调。

6 【关键词】 溃疡性结肠炎·Crohn病·白细胞介素17·白细胞介素10 • γ干扰素
Thl7细胞是新近发现的一群以分泌IL-17A为特征的CD4+ T细胞亚群，具有促进免疫反应的效应，在以慢性炎症为损伤机制的自身免疫疾病中具有重要作用【1】。本实验主要从炎症性肠病患者外周血中的T细胞亚群及血清中IL-10、IL-17、IFN-γ的水平进行相关探讨。

7 资料与方法 1.1研究对象：收集溃疡性结肠炎(ulcerative colitis UC)患者50例，其中男28例，女22例,平均年龄40岁，最大相差不过20岁和克罗恩病(Crohn’S diseaseCD)患者36例，其中男20例，女16例，平均年龄38岁，最大相差不过20岁。正常人20例。排除标准：尚使用激素的缓解期IBD患者；诊断不明确的各种肠炎；患有严重心、肝、肺、肾疾病；不能耐受结肠镜检查者；拒绝取活组织检查者或采静脉血者。 1.2 主要试剂与仪器:流式细胞仪，沾染血管中膜，圆球，18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉，水浴锅,16% 甲醛，MeOH，PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液，0.5mol/L EDTA缓冲液，1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0），酶消化液，3%甲醇-H2O2溶液，封裱剂

8 1.3实验方法 1.31 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷 流式细胞术酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 1.32 (1)固定细胞－把 16% 甲醛直接地加入培养 基获得一个 1.5% 甲醛的最后一个浓度。 (2)在 RT 和圆球在定色料中泡 10 分钟。 (3)Permeabilize 细胞－每一 106个细胞在 500 ul 极冷的 MeOH 中有精力充沛的旋涡再 中止圆球。这是接近编号，或多或少 MeOH 如果蒸发不是重要， cna 被用。

9 (4)在 4℃泡至少 10 分钟。此时，细胞以信号的较小失败力量能在 -20℃ 被储存好几个星期。
(5)然后在每一 100 ul 在 .5-1 x 106个细胞沾染血管中膜方面再中止，在沾染血管中膜 （PBS 包含 1% 商业软件联盟）方面洗细胞两次。 (6)污染细胞－增加抗体的最佳浓度而且抱为 1530 分钟的在 RT。 (7)在沾染血管中膜和圆球的 15 volumesof 中的洗细胞。 (8)在 stainging 血管中膜中再中止样品而且分析。

10 1.33 (1)脱蜡、水化。 (2)PBS洗两次各5分钟。 (3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。 (4)抗原修复。 (5)PBS洗5分钟。 (6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。 (7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。 (8)PBS洗三次每次2分钟。

11 应用SPSS13.0统计软件包进行分析，数据以x±s表示，采用t检验对资料进行分析。以α=0.05作为检验水准。
(9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。 (10)PBC洗3次每次2分钟。 (11)滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。 (12)PBS洗4次每次5分钟。 (13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色 （镜下掌握显色程度）。 (14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。 (15)脱水、透明、封片、镜检。 1.4　统计学处理　 应用SPSS13.0统计软件包进行分析，数据以x±s表示，采用t检验对资料进行分析。以α=0.05作为检验水准。

12 2.2 血清IL-17A、IL-10、IFN-γ蛋白的检测结果
2　结果 2.1CD、UC组淋巴细胞胞质均出现IL-17A阳性染 色，UC组阳性细胞主要存在于上皮的固有层淋巴细胞中，呈棕黄色，分布于腺体的周围，CD组的阳性细胞肠壁全层可见，在各层中的分布未见明显区别。正常对照组肠黏膜全层均未见阳性染色。 2.2　血清IL-17A、IL-10、IFN-γ蛋白的检测结果　 2.2.1　IL-17A蛋白　正常对照组血清中未检测到IL-17A，UC和CD组血清IL-17A水平明显升高，CD组平均水平较UC组高，但差异不大（P>0.05）。 2.2.2　IL-10蛋白　CD组IL-10表达水平高于UC组及正常对照组P＜0.05，UC组与正常对照组相差不大P>0.05。 2.2.3　IFN-γ蛋白　CD组、UC组血清中IFN-γ的水平与正常对照组比微升高，较差异小（P>0.05）。

13 3　讨论 炎性肠病（IBD）是一类病因未明的胃肠道慢性复发性炎症性疾病，包括溃疡性 (ulcerative colitis UC)和克罗恩病(Crohn’S diseaseCD)。以再发的炎症或持续的慢性炎症为主要特征.在欧洲，其发病率为（100～150）/10万【2】，IBD发病高峰年龄在20～40岁【3】。

14 Th17细胞在IBD发生中的机制尚不十分清楚，但辅助性T 细胞传统上分为Th1 型和Th2 型, 然而近年人们又发现了一种具有与T h1 和Th2 细胞亚群完全不同分化机制和功能特性的新的CD4+ T 细胞亚群, 并将其正式命名为T h17 细胞( T helper 17 cell) 。研究显示, T h17 细胞主要通过分泌白细胞介17( IL-17) , 诱导中性粒细胞向炎症局部迁移, 引起炎症反应, 在自身免疫性疾病和感染中发挥重要作用【4】。众多研究显示，当抗原及病原体入侵肠道时，在局部抗原提呈细胞作用下使肠黏膜组织未致敏的T细胞活化，向Th17细胞增殖、分化，通过释放IL-17、IL-21、IL-22、IL-6、TNF-α等炎症介质调节炎症的发生，同时Th17细胞因子也可以诱导趋化因子如MCP-1、MIP-2等的表达，介导炎症细胞到局部的浸润，从而导致肠黏膜组织损伤。IL-17等还参与了中性粒细胞、DC细胞的增植、成熟及趋化过程【5】。

15 研究表明【6】，在CD患者血清和结肠组织活检中IL 17高水平表达,主要是Th17细胞产生的IL17F的异常。CD患者结肠炎症病变区IL 17F mRNA表达量是非炎症结肠区的4 4倍,UC患者中肠道IL 17F mRNA平均表达量高于CD患者,说明活动性的IBD患者Th17细胞上调。 本实验中可发现正常对照组结肠黏膜局部未检测到IL-17A的表达，而UC和CD组在结肠黏膜活组织中均检测到IL-17A的表达。同样UC和CD组血清中IL-17明显增高，而正常对照组血清未检出IL-17，说明了TH-17在炎症性肠炎的发病过程中确实有作用。

16 在正常状态下，体内的促炎因子与抑炎因子处于动态平衡，二者相互制约，从而维持机体内环境的稳定。IL-10可以保护对IBD有抑制作用的淋巴细胞, 且可以抑制由其介导的宿主自发免疫反应, 在中断致癌作用方面也有重要意义【7】。IL-10由BSE 细胞、5 细胞、单核细胞、巨噬细胞产生，定位于一号染色体，是一种抑制性的细胞因子，能抑制BS- 细胞反应和巨噬细胞因子的合成，具有抗炎、免疫抑制活性。研究发现，IL-1O缺陷可引起自发性结肠炎【8】，一般炎症反应时IL-10会出现不同程度的上调本实验中IL-10上调可能是机体对炎症的代偿作用。

17 Th17 与Th1、Th2 及Treg 之间相互制约。Th1和Th2细胞效应因子IFN-γ和IL-4可以抑制IL-23刺激的Th17细胞增殖。诱导Th1 类细胞的IL-12 和其产生的IFN-γ， 诱导Th2 类细胞的IL-4 和相关的转录因子， GATA-3 均可以抑制Th17 细胞的分化【9】。近年来的研究进一步证实，IFN-γ 抑制Smad3 磷酸化， 可以下调TGF-β 并抑制mad7， 阻断Smad3 与TGF-β 受体相互作用。Th1细胞激活后上调Smad7， 而Th17 负相调节Smad7的表达。

18 研究表明【10】。，IFN-γ和IL-12p35在CD中显著上调,IFN-γ或IL-12可以抑制人类LP-CD4+T细胞产生IL-17,因此可以推测,尽管CD患者中黏膜中也发现有Th17细胞,CD患者中Th1细胞产生过多的IFN-γ可能对Th17细胞产生IL-17有负性调节作用,所以该实验的结果CD患者血清中IFN-γ升高符合预期。 通过该实验我们发现，在慢性炎症性肠病时IL-17,IL-10和IFN-γ的浓度均有不同程度的升高，该实验证明了TH-17在炎症性肠病中浓度升高，说明TH-17与炎症性肠病关系密切为我们深入研究TH-17把握了方向。本实验设计是一个验证性实验，实验结果基本与理论相符，但经统计学分析发现结果还不完全可靠，可能还有其他机制在炎性肠病中起作用，其具体机制还需进一步研究。

19 参考文献 [1] Weaver C T,Harrington LE,Mangan PR,et al.Th17: an effector CD4+Tcell lineage with regulatory T cell ties[J].Immunity,2006,24（6）： [2] Albanesi C,Scarponi C,Cavani A,et al. Interleukin-17 is produced by both Th1 and Th2 lymphocytes, and modulates interferon-gamma and interleukin-4-induced activation of human keratinocytes[J].J Invest Dermatol,2000,115(1):81-87. [3] Loftus EV Jr, Clinical epidemiology of inflammatory bowel disease:Incidence, prevalence, and environmental influences[J]. Gastroen-terology,2004,126(6): [4] Miossec P. IL-17 an d T h17 cell s in hum an inf lam matorydiseases[ J] . Mi crobes Inf ect , 2009, 11( 5) : [5]周明欢,李学锋,卢放根.Th17细胞与炎症性肠病[J]实用医学杂志,2009,25（22）： [6] Seiderer J,E lben I,D iege ml ann J,e t a l R ole o f the nove lT h17 cytokine IL 17F in inflamm atory bow e l disease(IBD):upregu la ted co lon ic IL 17F expression in activ e C rohn?s disease and ana lysis o f the IL 17F p H is161A rg po lymo rph ismin IBD In flamm Bow e l D is,2008,14(4):

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