PCR & Kary B. Mullis PCR & Kary B. Mullis 2010级化学基地班 张为宁.

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1 PCR & Kary B. Mullis PCR & Kary B. Mullis 2010级化学基地班 张为宁

2 PCR & Kary B. Mullis

3 前 言 关于为什么想讲接下来的内容： 1.PCR是分子生物学的关键技术，又是常规技术。PCR技术的出现极大的推动了分子生物学的发展，旋即被推广和应用到生命科学的其他领域。广泛的应用带动了PCR技术的发展，PCR技术的发展又产生了新的应用。如此螺旋上升，使PCR技术在20年的时间里，从无到有，从只能单纯扩增已知两端序列之间的DNA片段，发展到应用于各个领域的几十种PCR方法，而且这种发展还在继续。 PCR最新技术原理、方法及应用（第二版），2011 关于为什么想讲接下来的内容： 2.鉴定DNA的方法“PCR法”已经成为从遗传学到分子生物学，甚至到医疗领域最前沿的现代科学的基本手段。这个技术的开发者，美国的凯利·穆利斯是个狂热的冲浪爱好者，曾结过四次婚，是一位对科学的“主流”置之不理的具有自由思想的生化学家，他曾主张艾滋病的致病原因不是HIV，并声称二氧化碳致使地球变暖的学说是错误的，但鉴于他对现代社会的绝对性贡献，诺贝尔奖委员会在1993年还是决定授予他诺贝尔化学奖。 诺贝尔奖中的科学：化学奖卷，2012

4 具体内容包括 Part 1. Something about PCR Part 2. Something about Mullis

5 目 录 Contents 1 发展简史 2 基本原理 基本原理 3 主要应用 4 Kary简介 5 一点感想

6 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）一个非常简单，然而却是很有用的体外DNA聚合反应。PCR技术在生命科学中掀起了一场革命，它可以使人们通过几个小时的试管内的DNA聚合反应，就可将DNA扩增109倍。通过PCR技术不仅可以扩增存在于样品中的DNA，也可以富集混合DNA分子中的任一种。PCR的重要价值在于扩增存在微量而特殊的DNA序列。

7 1971年，Khorana曾提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。
PCR技术的创建 Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。

8 PCR的发展史 Mullis做的有关工作 1983年春，Mullis发展出PCR的概念；
1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环； 1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断； 1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒； 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），这回Mullis是第一发明人。 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法； 1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是85年春天Mullis建议做的； 1988年，第一台PCR仪问世； 1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。

9 PCR的基本原理 PCR（聚合酶链式反应，polymerase chain reaction）的基本工作原理是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。不断重复这一过程，可以目的DNA片段得到扩增。因为新合成的DNA也可以作为模板，因为PCR可以使DNA的合成量呈指数增长。

10 PCR基本反应体系 反应体系 1.模板 7.PCR促进剂 2.特异性引物 6.耐热DNA聚合酶 3.反应缓冲系统 5.三磷酸脱氧核苷酸
4.二价阳离子

11 简单介绍： 1.模板 PCR模板可以是DNA，也可以是RNA（需先经过反转录生成cDNA） 要求：
纯化的模板，单链或双链，线性DNA，小片段（扩增效率高），适宜模板量（eg：哺乳动物基因组1μg，酵母10ng，细菌1ng，质粒基因组1pg） 2.引物 PCR扩增产物的大小及扩增靶序列在基因组中的位置是由引物限定的→引物的选择关系到PCR的特异性。通常体系中有一对引物，即5’端引物和3’端引物。扩增时，5’端引物与位于待增片段5’ 端上游的一小段DNA序列相同，引导信息链的合成；3’端引物与位于待增片段3’端下游的一小段序列互补，引导互补链的合成，PCR扩增产物为一对引物之间的双链DNA片段。 要求： 高质量的引物且需要纯化，精心设计：长度、基本成分、引物自身、引物之间、3’末端、5’末端、熔解温度、特异性、简并性等（计算机软件），用量及计算（一般要求0.1~0.5μmol）

12 简单介绍： 3.反应缓冲系统 提供PCR所必需的、合适的酸碱度和某些离子。
最常用：10~50mmol/L Tris-HCl（pH8.3~8.8,20℃），72℃（通常 PCR延长阶段的温度）pH7.2；实际反应体系中，pH6.8~7.8 还含有KCl，50mmol/L以内有利于引物退火。 还可加入Taq聚合酶保护剂 4.二价阳离子——Mg2+ 所有耐热的DNA聚合酶的活性都需要二价阳离子（通常是Mg2+），此外Mg2+浓度影响引物退火、模板与PCR产物解链温度、产物特异性、引物二聚体生成等（Mg2+总量应比dNTP浓度高0.2~2.5mmol/L） 5.三磷酸脱氧核苷酸（dNTP） 四种dNTPs为PCR的合成原料。 在标准的PCR中各种dNTP的浓度应相等，若浓度有明显差异时，会诱发聚合酶的错误掺入而降低链合成的速度。dNTP的浓度直接影响PCR的速度和特异性，应严格控制。

13 简单介绍： 6.耐热DNA聚合酶 能经受95℃以上的高温而不失活，因而无需再每轮循环中添加新酶；同时催化的聚合反应的最适温度为70~80℃，此时引物与模板结合的特异性好，故产物纯度高。 现已发现多种耐热DNA聚合酶，性能尚有差别。应用最多Taq pol（Taq DNA聚合酶，台籍科学家钱嘉韵分离得到）：高热稳定性、高催化活性、忠实性、反转录活性、非模板依赖的聚合活性。 其他：修饰Taq DNA聚合酶、Th DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶 Sac DNA聚合酶 Pfu DNA聚合酶 7.PCR促进剂 据报道通过系那个PCR体系中加入助溶剂和添加剂，可以降低碱基错配水平，提高富含GC模板的扩增效率。 常见：DMSO、甘油、TMAC 大多数PCR促进剂在浓度较高时对PCR的反应起抑制作用 PCR理论与技术（第二版），2009

14 操作步骤 1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0
操作步骤 1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。         10×PCR buffer                5 μl         dNTP mix （2mM）              4 μl     　  引物1（10pM）                 2 μl       　引物2（10pM）                 2 μl         Taq酶 （2U/μl）              1 μl         DNA模板（50ng-1μg/μl）　    1 μl         加ddH2O至                     50 μl     视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。 2． 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，最后在72℃ 保温7min。 3． 结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。 4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。 dH2O 蒸馏水；ddH2O 重蒸水，即经过两次蒸馏的水，一般应用于比较精密的实验，如分子生物学实验中试剂的配制。

15 PCR的基本原理 1 2 3 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度
（℃） 高温变性 1 低温退火 2 适温延伸 3 重复1~3步 25~30轮 形成2条单链 DNA变性 目的DNA片段 扩增100万倍以上 子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性 DNA双螺旋

16 PCR循环（三个阶段） 变性 退火(复性） 延伸 能否成功的使模板DNA和PCR产物变性是反应成败的关键。
延伸即寡核苷酸引物的延长。延伸的温度和时间影响结果。

17 变性 ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃1min后，模板DNA双链即解离成为单链，以便之后引物结合，为下轮反应作准备

18 退火 ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至54℃ 45s，以便使引物与模板DNA单链的互补序列配对结合

19 延伸 ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，DNA序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链

20 PCR 动画 过 程 变 性 引 物 退 火 DNA 复制 1st cycle 2nd cycle 3rd cycle

21 PCR产物的检测 1.凝胶电泳检测（最常用、最简便） 琼脂糖凝胶电泳；聚丙烯酰胺凝胶电泳 2.核酸探针杂交检测 放射性标记和非放射性标记、
3.酶谱分析法 4.DNA酶免疫试验法 5.PCR-酶联免疫试验法 6.颜色互补分析法 7.序列分析法（最精确、最繁琐） 8.PCR-HLPC法，等。

22 PCR技术的特点：高特异性 引物的特异性。 引物延伸时，碱基配对的正确性。 Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性。
靶基因的特异性与保守性。选择扩增特异性和保守性高的靶基因区域，扩增产物的特异性程度就更高。 作为临床测定的PCR方法，还有一个影响特异性的决定性因素是寡核苷酸杂交探针。

23 PCR技术的特点：高灵敏度 从理论上，其能在2~3小时内，将1个分子靶DNA，扩增至10亿个分子。

24 PCR技术的特点：简便快速 整个PCR的扩增在一个小小的离心管中完成，过程也只是简单的温度变化，耐高温的Taq DNA聚合酶的应用，避免了DNA聚合酶的反复加入。 整个扩增反应可在2～4 小时完成。

25 特定的低纯度标本也可使用 某些靶基因含量高的标本，如人的组织、细胞、毛发、血液、培养后的细菌和病毒等病原体等，DNA粗制品及总RNA即可作为扩增模板，但在具体的扩增时，可对标本进行适当的稀释，在不影响靶基因模板的扩增浓度下，降低标本中PCR抑制物的浓度，以利于靶基因的扩增。

26 PCR的主要应用 基础研究方面的应用 临床上的应用 法医学中的应用 在其他方面的研究：流行病学研究、动物检疫和环境微生物检测等
亲子鉴定 个体识别 1、扩增目的基因和检定重组子 2、克隆基因 3、基因功能的和表达调控研究 4、基因组测序 5、致突变 1、在遗传性疾病诊断上的应用 2、在肿瘤研究中的应用 3、检测病原体 4、在基因分型中的应用 在其他方面的研究：流行病学研究、动物检疫和环境微生物检测等

27 在遗传与分子生物学中的应用 1制备与筛选CDNA文库 2直接测定DNA序列 3克隆染色体上特异性片段 4介导与检测基因突变 5克隆未知序列
6寻找新基因 7构建连锁图谱

28 PCR技术在医学上的应用 病原体核酸的检测：定量（抗病毒药物治疗疗效监测）；定性（耐药突变、基因分型、血液筛查等）。 遗传病 肿瘤 个体鉴定
其他（SNP及涉及核酸的科研等）

29 在感染性疾病病原体检测中的应用 定性(耐药突变、基因分型、血液筛查等） 难培养菌 耐药基因 病毒的检测
定量(感染状况判断、抗病毒药物治疗疗效监测） 定性(耐药突变、基因分型、血液筛查等） 细菌及其它微生物的检测 难培养菌 耐药基因 寄生虫的检测

30 在遗传病及其它基因相关疾病诊断中的应用 α地中海贫血
α地贫的发生是由于α珠蛋白链基因突变的结果，α珠蛋白基因定位于第16染色体短臂，每条染色体上均有两个α珠蛋白基因，该基因总长30Kb，共包含七个连锁的α类基因或假基因。 在α-基因的突变中，以缺失型突变最为常见。α-基因的另一突变即为点突变，目前已发现的突变有18种以上，它包括错义突变、无意突变、剪接部位突变及起始信号突变。 α地贫的产前诊断目前一般采用PCR-探针杂交或限制性长度多态性（RFLP）方法进行。 30

31 β地中海贫血 β地中海贫血（简称β地贫）:β地贫由β珠蛋白链基因突变所引起，该基因定位于第11染色体短臂，总长度约60Kb，其中有许多胚胎性基因及假基因，而β珠蛋白基因有两个内含子和3个外显子，总长约为1.126Kb. β-基因的突变以点突变为主，亦有碱基的插入和缺失。目前在世界范围内发现的点突变达160余种，其中在中国发现的有21种。 β地贫的产前诊断目前一般采用PCR-探针杂交或限制性长度多态性（RFLP）或等位基因特异的PCR方法进行。 31

32 血友病 血友病是一种X连锁隐性遗传病，分为血友病甲和血友病乙，几乎全部发生在男性身上。血友病甲是由于凝血因子Ⅷ的缺乏所致，而血友病乙则是因为缺乏凝血因子Ⅸ。控制产生凝血因子Ⅷ和Ⅸ的基因位于X性染色体上。 32

33 血友病的分子诊断 大多数血友病突变的大量变异和近代起源使遗传筛选过程错综复杂。目前基本上使用PCR方法检测。
诊断携带者的最佳途径是检测其家庭成员的特异基因缺陷。 策略：根据全国性可信基因突变和谱系数据库进行筛选，鉴定并记录每一个家庭中的病人或携带者的突变。这样，根据个人所属家庭，只有小部分血友病基因需要检查，所以可以迅速而准确地筛选每一个家庭成员并降低成本。 英国和瑞典完全使用这种策略，它代表了利用各种遗传缺陷谱系鉴定遗传性疾病的筛选模式。 33

34 药物性耳聋 氨基糖甙类抗生素所致的耳聋可分为两类：一类因接受了中毒剂量而致聋；另一类是有遗传背景，即带有线粒体125rRNA基因AI555G均质性点突变基因。由细胞线粒体的遗传基因发生变异之故。即家族的变异基因可能通过母亲遗传给她的子孙，使之具有潜在的过敏性，此称母系遗传。 该突变使原有的BsmAI酶切位点消失 34

35 药物性耳聋 检测方法主要是运用 PCR技术，结合限制性内切酶进行分析，其更新的技术包括变性高效液相色谱分析等。 35

36 在亲子鉴定中的应用 每个人的遗传物质一半来自父亲，另一半则来自母亲。根据孟德尔遗传分离和自由组合定律，亲代基因型决定子代基因型，在没有基因突变和分型错误的前提下，孩子不可能带有双亲均没有的等位基因。 父系遗传的Y染色体的标记，子代的分型必定与父亲的相同，而且同一父系的所有个体的分型一致。母系遗传的线粒体DNA，子代的分型与母亲的分型一致，并且同一母系的所有个体的分型一致。 36

37 在亲子鉴定中的应用 父与子之间仅有一个遗传标志不符合遗传规律尚不能排除亲子关系，因为有可能是突变所致。必须有2个以上不同基因座同时不符才能否定其亲子关系。 亲子鉴定的手段主要有两大类: (1)血液中各种抗原成分的遗传多态性标志物检验,如人类白细胞抗原分型、红细胞抗原分型、红细胞酶型及血清型；（2）DNA多态性检验。主要包括有单基因座探针限制性片段长度多态性（DNA指纹）和单基因座扩增片段长度多态性（包括用多聚酶链反应(PCR) 检测的可变数目串联重复多态性(VNTR)和短串联重复多态性(STR)）。 37

38 在亲子鉴定中的应用 DNA多态性检验是目前亲子鉴定中最准确的一种方法。
如果孩子和被测试男子的DNA模式在两个或多个DNA探针上不吻合,那么被测试男子便被100%排除,即他是亲生父亲的可能性是0%。反之，如果孩子和被测试父亲的DNA模式完全吻合,则在理论上不能100%肯定其为亲生父亲，只能计算出99.95%或更大的概率。 事实上也发生过DNA模式完全吻合但实际并非为生父的情况，但这种情况的可能性极低。 38

39 在个体鉴别中的应用 基因指纹又称DNA指纹，指的单基因座探针限制性片段长度多态性。DNA所含有的遗传信息是由遗传密码字母A、C、G和T的序列决定的。人类含有总数约30亿个这种字母，它们在人体每个细胞的染色体上都以一定的次序排列，排列次序的不同使得一个个体与另一个个体完全不同。个体间的亲缘关系相距越远，基因组的核苷酸字母排列差异就越大。相反，遗传上相关的个体（如同胞、父子）相应地在其字母序列上有很大的相似性。 39

40 在个体鉴别中的应用 DNA指纹就是通过分析这种差异来确定个体。
DNA指纹是最可靠的个体确认方法，现已在司法实践中广泛应用，有很多案例的唯一证据就是留在现场的这些藏在细胞内的DNA。 40

41 在个体化治疗中的应用 细胞色素氧化酶P450（CYP450基因的多态性
细胞色素P450 2D6（Cytochrome P450 2D6，CYP2D6）是细胞色素药物代谢酶中较为重要的一种，由497个氨基酸组成。主要参与多种重要药物的代谢，包括多种抗心律失常药、β1受体阻滞药、抗高血压及三环类抗抑郁药等。CYP2D6参与代谢的药物占总P450代谢药物的30%。 CYP2D6的基因多态性会导致患者代谢药物能力的很大差别。当患者的基因型是CYP2D6*1/*1时，属于强代谢型（EM）；当患者的基因型是CYP2D6*1/*10时，属于中等代谢型（IM）；当患者的基因型是CYP2D6*10/*10时，属于弱代谢型（PM）。同样是美托洛尔用药的常规剂量为25mg/次，2次/d，对于EM者，推荐剂量为常规剂量的140%；对于IM者，推荐剂量为常规剂量的60%；对于PM者，推荐剂量为常规剂量的30%。 可常规地应用不同的P450基因型来评价新药在临床试验中的疗效。 41

42 在血液筛检中的应用 HCV和HIV感染“窗口期” HBV DNA PCR检测筛检血液的意义 42

43 临床PCR检验应用的发展趋势 核酸提取方法的简便化和自动化 项目的多样化：从病原体、到基因疾病的诊断、多标志物同时检测、疾病基因指纹
不同原理的实时核酸扩增仪的普遍应用 扩增试剂的改进：标准化、防污染、有内标阴性质控 临床PCR实验室质量理念不断增强 43

44 1993年诺贝尔化学奖 凯利·穆利斯 让DNA研究飞跃发展的PCR法
冲浪狂的凯利·穆利斯 刊登在自然杂志上的生化学者的不成熟的宇宙论 尝试合成麻药LSD 探索DNA解读方法的思考试验 开车兜风时想到的PCR法 拒绝刊登此文的自然和科学杂志 价值三亿美元的专利和一万美元的奖金 垂死挣扎的PCR法 对科学家们的误解的指责

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53 很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖， Mullis是其中之一
Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。使DNA扩增的方法早就存在，他曾经想过不少改进办法，但最终的改革是使酶变得耐热。更确切地说，就是同时使用两个寡聚核苷酸引物，然后酶就变得耐热了。这种改革的本身独创性较少，但我认为他的独创性不在改革技术上，而在于想到了改革。独创性较少，却大大提高了旧方法的用途，给人类生活带来了巨大的影响，使革新后的技术面貌一新，赢得了诺贝尔奖。 “如果你的研究能力一般，那么，改革本研究领域中大家习以为常的最基本的技术，你就有可能获诺贝尔奖。” Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4)

54 部分资料来自网络 主要参考书目： 诺贝尔奖中的科学：化学奖 PCR理论与技术 PCR最新技术原理、方法及应用 单击添加段落文字

55 Kary’s Words “如果你的研究能力一般，那么，改革本研究领域中大家习以为常的最基本的技术，你就有可能获诺贝尔奖。

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57 Q & A 应该没有问题吧。我下去了。

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59 19世纪50年代，Khorana合成了寡聚核苷酸，同时，他利用合成的寡聚核苷酸DNA合成酶以及DNA，开发出了使DNA扩增的方法。当时，这一领域的研究人员通常都使用Khorana的DNA扩增技术。可以说，这是一个司空见惯的基本技术，谁也没有去想过这种方法的不便之处。

60 1971年，Khorana曾提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。

61 因此，30年来没有人去改革这个方法，人人都满足于这个方法。就连Mullis本人在大学做基础研究时，也没有想到要去开发一种更简便的方法，以取代Khorana的方法。

62 1979年，穆利斯进入Cetus公司，从事合成寡聚核苷酸的工作。1981年他担任DNA合成实验室主任，主要任务是加速和优化寡聚核苷酸的合成。80年代初DNA合成仪进入实验室，他对这台原型机提出了许多改进的意见，还试着编写新的程序。由于DNA合成仪的应用使寡核苷酸的合成效率提高10倍。这样，穆利斯能把更多的时间用于计算机上。PCR的点子，也就是在这样的情况下诞生的。

63 1983年4月一个周末的晚上，他驾车与一位同事去乡村别墅在蜿蜒的乡间公路上开着车，，他思绪不断，一段DNA反复复制的景像，在他的脑海里冒了出来。他萌发了PCR的构想。

64 整个周末他都在思考着PCR问题，他想DNA合成起始于DNA解链，在一段寡核苷酸作为引物下，聚合酶沿着模板从引物的末端开始进行DNA的扩增，这需要人工加入核苷酸，这一过程在实验室可以实施。他还反复思考能否用两个引物来代替现行的单引物法？如果两个引物的大小不同，结果两条链的序列将同时被测定，而且互为印证；其次，他想能否分两次加入聚合酶，以防止新合成DNA的核苷酸易于脱落和被聚合酶错搭到新生链中的现象。

65 再有，经常使用计算机使他注意到了“循环”，他也想到DNA呈指数增长的趋势；最后他还想到扩增是否具有专一性的问题，因为在合成第一次反应中，人们无法终止聚合酶对引物的扩延。但穆利斯注意到在第二次及后续的链反应中，由第一次反应得到的那些“长反应产物”只能被扩延到另一引物与模板DNA相结合的部位，过了那个位点，扩延反应就无法进行了（没有模板）。所以PCR产物的长度是确定的。

66 他开始用人类神经生长因子作为目标序列进行扩增，没有结果。转而他选择PBR322质粒作为模板，实验中通过缩小反应体积来增加各成分的浓度，并将复性温度降低到32℃，减少每次加入的聚合酶的量，在10次循环后停止，结果他看到一条浅的带。接着，他又对方法进行了改进，增加几次循环，得到的带还是较浅。他又尝试用50kb碱基对的λ噬菌体做模板，用限制酶将模板降解为2000碱基对左右，扩增没有成功。他再次更换模板改用实验室合成的100碱基对的寡核苷酸作模板，对ß珠蛋白基因进行扩增，结果得到扩增产物。这期间Cetus公司成立了PCR小组，经全体成员的共同努力，1984年11月，终于得到与预期分子完全符合的扩增量，首次取得可信的结果，证明了PCR的可行。

67 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。

68 这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的重视。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年,Cetus公司的Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌（thermus aquaticus）中提取到一种耐热DNA聚合酶，此酶最大特点是耐高温，不需每次加入，大大提高了扩增片段特异性和扩增效率。此酶被命名为TaqDNA聚合酶。此酶的发现使PCR广泛的被应用。

69 原理简介： PCR 技术的基本原理是DNA的半保留复制。由于DNA复制是半保留的，两条链都可以作为模板。在体内，DNA复制是周期性的，所以基因扩增的数量有限；PCR技术在体外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，使DNA不断位于变性、复性和合成的循环中，达到扩增DNA的目的。