Antibiotic drug tigecycline inhibited cell proliferation and induced autophagy in gastric cancer cells 作者：Chunling Tang, Liqun Yang , Xiaolan Jiang , Chuan.

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1 Antibiotic drug tigecycline inhibited cell proliferation and induced autophagy in gastric cancer cells 作者：Chunling Tang, Liqun Yang , Xiaolan Jiang , Chuan Xu , Mei Wang , Qinrui Wang,Zhansong Zhou, Zhonghuai Xiang , Hongjuan Cui 杂志：Biochemical and Biophysical Research Communications（ ） 年代：2014年 生命基地 梁材

2 抗生素药物替加环素能抑制胃癌细胞的增殖并且诱导其细胞自噬
Antibiotic drug tigecycline inhibited cell proliferation and induced autophagy in gastric cancer cells 抗生素药物替加环素能抑制胃癌细胞的增殖并且诱导其细胞自噬

3 实验背景 胃癌 虽然在过去的二十年间病例有所下降，但是仍然有比较高的致死率。目前的治疗方法包括胃切除手术、化学治疗或放射化学治疗等方法。但是目前这些方法对晚期病人来说都没有比较好的疗效。 替加环素 替加环素是二甲胺四环素的衍生物，已经被证实具有医疗抗细菌的作用，而且在结构和功能上和四环霉素类似。最近的报道表明替加环素能够阻止恶性血液瘤的线粒体的蛋白质的合成。在这个实验当中，替加环素能够抑制人类胃癌细胞增殖并且诱导胃癌细胞自噬。 细胞自噬 细胞自噬是一个细胞分解代谢途径，用来降解循环细胞内成分来应对细胞的紧张状态。当在紧张状态时，受到细胞能荷水平调节，AMPK/mTOR途径能够激活自噬启动相关激酶，引起细胞死亡。

4 实验内容 实验材料和处理方法 1.基本实验材料 2.癌细胞相关的处理： 实验组：替加环素（1μM、5μM、10μM）处理
Human primary gastric cancer specimens 人类原发性胃癌细胞样品（从患者身体收集） MKN-45 Cell line 人低分化胃癌细胞（来自细胞银行） Severe combined immune deficiency (SCID) mice 严重综合免疫缺陷小鼠 2.癌细胞相关的处理： 实验组：替加环素（1μM、5μM、10μM）处理 空白对照组：DMSO处理 肿瘤大小实验相关的处理： 实验组：小鼠每天注射替加环素（100mg/Kg），注射5天 空白对照组：小鼠每天注射相同剂量DMSO，注射5天

5 实验内容和实验结果

6 替加环素对癌细胞增殖的抑制作用 1.台盼兰染色计算细胞增殖率 实验结果：
和对照组相比，替加环素能够抑制人低分化胃癌细胞和人原发性胃癌细胞的增殖率，并且抑制的效率随着剂量的增加而增加。

7 替加环素对癌细胞增殖的抑制作用 2.MTT染色实验 实验结果：
和对照组相比，增加替加环素药物剂量和增加处理时间都能加强对细胞增殖的抑制，而且到达一定天数之后，细胞活性开始出现下降的趋势。

8 替加环素对癌细胞增殖的抑制作用 3. BrdU染色实验 实验结果：
和用DMSO处理72h相比，用10μM的替加环素处理样品72h明显减少了BrdU-阳性细胞的比例，说明细胞增殖率明显降低。

9 替加环素对人胃癌细胞的自噬以及凋亡的影响
1.凋亡检测试验 分别用DMSO和10μM替加环素处理两种不同的细胞系72h，然后用Annexin V-FITC试剂盒对样品进行细胞凋亡检测，然后采用流式细胞计数法计算凋亡比率。 实验结果： 替加环素对胃癌细胞没有诱导细胞凋亡的作用。

10 替加环素对人胃癌细胞的自噬以及凋亡的影响
2. MDC染色实验 实验结果： 替加环素能够诱导胃癌细胞产生细胞自噬，并且自噬程度随着时间增加而增长。

11 替加环素对人胃癌细胞的自噬以及凋亡的影响
3.免疫荧光染色 实验结果： 和DMSO组相比，替加环素能够增加胃癌细胞中LC3Ⅱ的含量，也就是诱导了细胞自噬。

12 替加环素对人胃癌细胞的自噬以及凋亡的影响
4. Western blot检测LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化 实验结果： 与control组相比可以看出，替加环素诱导LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化，而且随着时间增加，转化程度增加。

13 替加环素对AMP/mTOR/p70s6k通路的影响
1.和control组相比，AMPK磷酸化增加，表明AMPK被活化

14 替加环素对AMP/mTOR/p70s6k通路的影响
2.和control组相比，mTOR磷酸化水平降低，被抑制

15 替加环素对AMP/mTOR/p70s6k通路的影响
3.和control组相比，p70s6k磷酸化水平降低，被抑制

16 替加环素对人胃癌细胞移植瘤模型的抑制作用
1.将原发性胃癌细胞移植到严重联合免疫缺陷小鼠皮下，然后每天注射100㎎/Kg的替加环素，分离移植瘤，统计处理时间不同对肿瘤大小的影响。 实验结果： 和空白对照组相比，替加环素明显地抑制了肿瘤大小增加，并且对实验鼠的体重以及行为表现几乎没有影响。

17 替加环素对人胃癌细胞移植瘤模型的抑制作用
2.分析替加环素对移植瘤细胞自噬的诱导作用 实验结果： 替加环素能够诱导移植瘤细胞自噬相关蛋白的表达。

18 实验结果讨论 替加环素能抑制人胃癌细胞的增殖和肿瘤的增大。
替加环素能够诱导癌细胞自噬，AMPK可能是作为感知细胞紧张状态的通路的一部分，参与细胞自噬的过程。 替加环素可能能阻止线粒体蛋白质合成，使线粒体功能受损因此减少ATP产生，激活AMPK/mTOR通路，诱导细胞自噬。

19 我的想法 这个实验比较有意义。因为目前很多抗肿瘤的药物由于很难靶向治疗，因此对正常细胞的杀伤作用也很大，对患者有很强的副作用，而替加环素对人体的不良反应（恶心和呕吐）较弱，而且从当前实验来看可能对一般细胞没有杀伤作用（小鼠体重没有较大变化，而且行为基本没有影响）；另外，一般限制抗生素使用的两种抗药机制对替加环素的影响较小，使用替加环素不会因为使体内微生物抗药性增加而引起内感染。

20 二、对实验的结果分析。对AMPK的激活和对p70S6K的抑制可能对不同的通路产生影响。个人猜测，AMPK/mTOR通路可以诱导细胞自噬；而mTOR/p70S6K通路的抑制会导致蛋白质合成受阻，可能因此影响了线粒体蛋白质的合成。

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22 三、这个实验继续进行 1. 分析替加环素对各种细胞的特异性 2. 分析替加环素处理后，样品中蛋白含量变化，探索替加霉素参与的信号通路 3
三、这个实验继续进行 1.分析替加环素对各种细胞的特异性 2.分析替加环素处理后，样品中蛋白含量变化，探索替加霉素参与的信号通路 3.分析替加霉素和蛋白质之间的相互作用（基于上一个实验的基础）