第十四章 维生素类药物的分析.

Presentation on theme: "第十四章 维生素类药物的分析."— Presentation transcript:

1 第十四章 维生素类药物的分析

2 概 述 维生素： 是维持人体正常代谢机能所必需的 微量营养物资。 人体不能合成维生素。

3 本章仅对维生素(A、B1、C、E)进行学习讨论
按溶解度分 分类 脂溶性 VitA、D2、D3、 E、K1 等 水溶性 VitB族(B1、B2、B6、B12) VitC、叶酸、烟酸、泛酸等。 本章仅对维生素(A、B1、C、E)进行学习讨论

4 第一节 维生素A -H 维生素A醇 -COCH 维生素A醋酸酯 -COC15H 维生素A棕榈酸酯 R :

5 结构与性质 一、 为一个具有共轭多烯醇侧链的 环己烯 （一） 具有UV吸收 存在多种立体异构化合物 天然维生素A主要是反式

6 易发生脱氢生成去氢维生素A2 易脱水生成去水维生素A3 易聚合反应生成无活性维生素A

7 共轭多烯侧链 易被氧化 （二） △或有金属离子存在时更易氧化

8 环氧化物 VitA醛 VitA酸

9 （三） 、与三氯化锑发生呈色反应 CHCl3 （四） 、溶解性 不溶于水 易溶于有机溶剂和植物油等

10 鉴别试验 二、 三氯化锑反应 （一） CHCl3 条件 无水无醇

11 蓝色 紫红

12 UV法 （二） nm扫描 λmax为326nm 一个吸收峰 nm扫描 384、367、389nm 三个吸收峰

13 VitA ↓ 去水VitA（VitA3）

14

15 TLC法 （三） BP 对照品法 显色剂 三氯化锑

16 目前各国药典均采用紫外分光光度法替代三氯化锑比色法
三、含量测定 目前各国药典均采用紫外分光光度法替代三氯化锑比色法 （一）、紫外分光光度法 利用维生素A醇和其醋酸酯分子中具多烯共轭体系结构，在325～328nm处有选择性吸收峰，故可进行含量测定。

17 立体异构体 氧化产物及光照产物 合成中间体 去氢维生素A（ VitA2） 去水维生素A（ VitA3） 均对测定有干扰，故采用三点校正法

18 1：测定原理，三个波长的吸收度，公式计算校正吸收度，再计算含量。故得名。该法的依据：
① 杂质的吸收在310~340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小； ② 物质对光的吸收具有加和性。

19 2 波长的选择：最大吸收波长，及两侧各选一波长
① 第一法（等波长差法） 1 =328nm， 2 =316nm， 3 =340nm，△ =12nm VitA的max（328nm） Ch.P用于测定维生素A醋酸酯

20 第二法（等吸收比法） 分别在1的两侧各选一点 A 2 = A3 =6/7A 1 Ch.P用于测定维生素A醇
1= 325nm， 2=310nm， 3 =334nm Ch.P用于测定维生素A醇

21 3. 杂质的吸收 对V.A有影响的杂质主要有以下几种： (1) V.A2 和V.A3 (2)维生素A的氧化产物 (3) 维生素A在光照下产生的无活性的聚合物 (4)维生素A的异构体等。 以上这些杂质在310nm-340nm的波长范围内有吸收，干扰维生素A的测定。

22 4.测定方法 （1）第一法（直接测定法，适用于纯度高的维生素A醋酸酯环己烷溶解）
1）方法 在300、316、328、340、 360nm测吸收度 2）计算 a.吸光系数E1%1cm b.求效价（IU/g）：效价指每g供试品所含维生素的A的国际单位数。IU/g= c.求维生素A醋酸酯占标示量的百分含量

23 3）换算因子： 4）A值的选择： a.计算吸收度比值：与中国药典的吸收度比值相比较，判断每个差值的绝对值是否超过0.02。 b.判断法 最大吸收波长在 nm之间，且5个波长下的绝对值差值均不超过0.02时，可直接用328nm波长处的测得的吸收度值求得吸收系数。

24 最大吸收波长在326-329nm之间，计算5个波长下的绝对差值，如果有一个或几个超过0.02，应按以下的方法进行判断：
若（A328校正-A328）*100%/A328 所得的数值在±3.0%，则仍不用校正公式计算吸收度。可直接用A328代入E=A/C.L 若（A328校正-A328）*100%/A328 所得的数值 在-15.0%到-3.0%，则应用A328校正代入E=A/C.L 若（A328校正-A328）*100%/A328 所得的数值在小于-15%或大于+3%，则不能用本法测定，应使用第二法。

25 如果最大吸收波长不在326-329nm之间，也不能用本法测定。采用第二法
第一法的校正公式为： A328校正=3.52（2 A328 –A316-A340）

26 （2）第二法（皂化法，适用于维生素A醇） 1）方法 精密称取一定量的供试品，加KOH乙醇溶液后煮沸回流，得到的皂化液再经过提取、洗涤、滤过、浓缩和干燥等处理，最后用异丙醇溶解残渣并稀释成每1ml中含维生素A为9-15个国际单位数的溶液，在300、310、325、334nm波长处测定吸收度，并确定最大吸收波长（应为325nm）。 2）计算 同第一法。见书p

27 3）A值的选择 如果最大吸收波长在323-327nm之间， 且A300 /A325比值≤0.73，按下法判断：
a. 若（A325校正-A325）*100%/A325 所得的数值的绝 对值在3%，可直接用A325 代入E=A/C.L b.若（A325校正-A325）*100%/A325 所得的数值的绝 对值超过3%，则用应用A325校正代入E=A/C.L 如果最大吸收波长不在 nm之间， 或A300/A325比值>0.73，表示供试品中杂质含量太高，应采用色谱法将未皂化部分纯化再进行测定。

28 第二法的校正公式： A325校正=6.815 A325 –2.555A A334 6.讨论 1）.吸收度校正方法： 维生素A醋酸酯：直线方程法（代数法） 维生素A醇：相似三角形法（几何法或6/7定位法） 2）.在应用三点校正法时，除其中一点是在最大

29 吸收波长处测定外，其余两点均在最大吸收峰的两侧进行测定。如果仪器波长精度不准确时，会产生较大误差。因此，在测定之前务必要校正波长，并可用全反式维生素A进行测定，比较测定结果和比值是否与对照品相符合，以进一步核对波长是否准确。测定的样品不得少于两份。 7.应用示例 维生素A胶丸、维生素AD胶丸和维生素AD滴剂等均可采用本法测定。

30 第一法与第二法的区别 第一法 第二法 测定对象 维生素A醋酸酯 维生素A醇 方法 直接取样，测定 皂化提取，测定 溶剂 环己烷 异丙醇
第一法 第二法 测定对象 维生素A醋酸酯 维生素A醇 方法 直接取样，测定 皂化提取，测定 溶剂 环己烷 异丙醇 max nm nm 测定波长 个 个 换算因数

31 （二） （二） 三氯化锑比色法 标准曲线法 蓝色 + SbCl VitA 优点 简便 快速 λmax 618nm～620nm
3 SbCl VitA λmax 618nm～620nm 优点 简便 快速 缺点 呈色不稳定 （5 ~ 10s内） 水分干扰 与标准曲线温差≤1℃ 专属性差 三氯化锑有腐蚀性

32 RP-HPLC同时测定人血清中VitA和VitE的含量
（三）高效液相色谱法 RP-HPLC同时测定人血清中VitA和VitE的含量 1、仪器与分析条件：HPLC-UV、C18 (300×3.9 mm）、甲醇－水（96：4）、流速：1.2 ml/min、检测波长：0～8min (330 nm), 8 min后(292 nm） 内标：维生素A醋酸酯

33 维生素B1广泛分布于米糠、麦麸和酵母中，具有维持糖代谢及神经传导与消化的正常功能。主要用于治疗维生素B1缺乏症、多发性神经炎及胃肠疾病。

34 HCl Cl- 氨基嘧啶环－CH2－噻唑环(季铵碱)

35 嘧啶环的氨基、噻唑环的季铵 为两个碱性集团
嘧啶环的氨基、噻唑环的季铵 为两个碱性集团

36 结构与性质 一、 （一） 溶解性 1、易溶于水，乙醇微溶， 乙醚不溶 2、水溶液呈酸性 （二） UV 共轭双键 λmax = 246nm

37 （三） 硫色素反应

38 （四）生物碱沉淀反应 嘧啶环 —— 噻唑环 —— 与生物碱沉淀剂 （碘化汞钾等）↓ （五）氯化物特性 本品为盐酸盐，呈氯化物的反应。

39 鉴别试验 二、 （一） 硫色素反应 ChP

40

41 ＋2H 硫色素

42 （二） 沉淀反应 VitB1 H+ H+ H+ H+

43 （三） 氯化物反应 （四） 硫元素反应 （五） 红外分光光度法

44 三、 含量测定 （一） 非水溶液滴定法 喹那啶红－亚甲蓝（紫红→天蓝）

45 反应摩尔比为1：2

46 （二） UV法

47 g/100ml ChP 片剂、注射剂 = 421 A = ECL （每片）相当于标示量的%= 规格 g/片 g W E A D 100 ×
cm D 100 1 × 标示量 平均片重 规格 g/片 g

48 （三） 硫色素荧光法 原理 1、 荧光 硫色素 异丁醇 铁氰化钾 1 VitB NaOH 通过与对照品荧光强度的比较即可测得供试品含量

49 2、实验操作 40 ml具塞试管3支→对照品溶液5 ml；其中2支加入氧化试剂3.0 ml，再迅速加入异丁醇20 ml，振摇。第三支试管中加入3.5 mol/l的NaOH，同法操作为空白。 另取三支试管加入对照品同法操作。 各试管中加入无水乙醇2 ml，分取异丁醇，进行荧光测定。

50 3、结果计算

51 特点 4、 （1）灵敏度高，线性范围宽 （2）代谢产物不干扰，适用于 体液分析 （3）该法适用于VitB1的制剂含量分析 （4）可用BrCN为氧化剂，反应定量完全，适合于生物样本分析

52 第三节 维生素C 具有烯二醇结构； 具有内酯环； 具2个手性碳原子具有旋光性 L－抗坏血酸

53 结构与性质 一、 （一） 溶解性 1、易溶于水 2、水溶液呈酸性

54 （二） 还原性 烯二醇结构 烯二醇结构 二酮基结构

55 有活性 有活性 无活性

56 （三） 具糖的性质 结构与糖类相似 糖类的显色反应 △ 50℃

57 酸性 （四） 一元酸 C3－OH的 pKa = 4.17 C2－OH的 pKa = 11.57

58 （五） 光学活性 手性C（C4、C5） * L(+)－抗坏血酸 活性最强 *

59 与碱反应 （六） 水解性 弱碱中生成单钠盐， 强碱中水解

60

61 七 紫外吸收特性

62 鉴别试验 二、 与氧化剂的反应 （一） 去氢抗坏血酸 ] O [ VitC

63 1、与AgNO3反应 2、与2，6 - 二氯靛酚反应 还原型 氧化型 玫瑰红色 蓝色 OHˉ

64 （玫瑰色） （无色）

65 3.其他氧化剂的反应： 亚甲蓝或高锰酸钾 试剂褪色 碱性酒石酸铜 砖红色沉淀 磷钼酸 钼蓝

66 糖类的反应 （二） USP 或盐酸 吡咯 50℃

67

68 戊糖 (糠醛) 50℃ (吡咯) （蓝色）

69 UV （三） BP 0.01mol/L HCl

70 三、杂质检查 1.溶液的澄清度与颜色：有色杂质 分光光度法 2.铁、铜离子：原子吸收分光光度法

71 含量测定 四、 碘量法 （一） 原理 1、 指示剂 淀粉指示液

72 H+

73 方法 2、 取本品约0.2g，精密称定，加新 沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶 解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴 定液（0.1mol/L）滴定，至溶液显蓝 色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液 (0.1mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6

74 讨论 3、 （1）酸性环境 HAc 减慢VitC被O2氧化速度 （2）新沸冷H2O 赶走水中O2 （3）立即滴定 减少O2的干扰

75 （4）附加剂干扰的排除 片剂 —— 滑石粉 —— 过滤 注射剂 —— 抗氧剂 —— 丙酮 甲醛 Na2SO NaHSO3 Na2S2O3 Na2S2O5

76 2，6 - 二氯靛酚钠滴定法法 （二） USP JP 原理 1、 酚亚胺 二氯靛酚 ， - 6 2 VitC

77 方法 2、 自身指示终点法

78 讨论 3、 （1）酸性环境 HPO3-HAc 稳定VitC （2）快速滴定 min内 防止其他还原性物质干扰 （3）剩余比色测定 （定量过量） （测剩余染料）

79 （4）缺点 需经常标定 不稳定 贮存≤一周 干扰多 氧化力较强

80 三、高效液相色谱法 人血浆中VitC浓度的HPLC法测定 1、色谱条件 2、标准溶液的制备 3、血浆样品的处理：酸性溶液沉淀蛋白法
4、方法学考察 5、测定

81 第五节 维生素E 苯并－二氢吡喃醇 VitE为二氢吡喃醇衍生物

82 * * * 名 称 R1 R2 相对活性 α-生育酚 β-生育酚 γ -生育酚 δ -生育酚 CH3 H 1.0 0.5 0.2 0.1
名 称 R1 R2 相对活性 α-生育酚 β-生育酚 γ -生育酚 δ -生育酚 CH3 H 1.0 0.5 0.2 0.1 VE为 α-生育酚及其各种酯类

83 dl－α－生育酚醋酸酯

84 一、 结构与性质 苯环 + 二氢吡喃环 + 饱和烃链 1、溶解性 易溶于乙醇、丙酮、 乙醚等，水中不溶 2、氧化性 对氧十分敏感遇光、
1、溶解性 易溶于乙醇、丙酮、 乙醚等，水中不溶 2、氧化性 对氧十分敏感遇光、 空气可被氧化为生育醌和生育 酚二聚体

85 3、UV－284 nm 吸收系数为41.0-45.0 4、乙酰化的酚羟基 易水解 生育酚 醌型化合物 VitE ] O [ 杂质，需检查
4、乙酰化的酚羟基 易水解 杂质，需检查 △ 生育酚 - + or OH H VitE ] O [ 醌型化合物

86 鉴别 二、 （一） 硝酸反应 75℃水解 HNO 3 VitE 生育酚 ] O [ 生育红 橙红色

87 生育酚 强氧化剂 HNO3 生育红 （橙红色）

88 三氯化铁-联吡啶反应 （二）

89 生育酚 弱氧化剂 [O] 对-生育醌

90 血红色

91 （三） UV法 0.01%无水乙醇中 λmax = 284nm λmin = 254nm = 41.0～45.5

92 （四） TLC法 薄层板 硅胶G 展开剂 环己烷 -乙醚（4 ：1） 显色剂 硫酸（105℃ 5′） VitE Rf = 0.7 -生育酚 Rf = 0.5 -生育醌 Rf = 0.9

93 三、 杂质检查 酸度 以NaOH滴定液（0.1mol/L≤0.5ml）体积控制。 2. 游离生育酚
原理:利用游离生育酚的还原性，可被硫酸铈定量氧化 根据消耗硫酸铈滴定液的体积来控制游离生育酚的限量。

94 （M生育酚= 430.8） 例 取本品0.10g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液1滴，用硫酸铈液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸铈液（0.01mol/L）不得过 1.0ml。

95 限量 ≤2.15％

96 四、 含量测定 （一） GC法（法定方法） 1、 GC特点 挥发性低、不稳定、极性强→衍生化易受样品蒸气压限制 选择性好 灵敏度高 速度快 分离效能好

97 内标法加校正因子 2、 VitE测定的色谱条件 载气→N2 固定液→硅酮（OV-17） 担体→硅藻土或高分子多孔小球 柱温→265℃
检测器→氢火焰离子化检测器(FID) 内标→正三十二烷 n ≥ 500 R≥2 内标法加校正因子

98 内标法 供试液（样品+内标） 对照液（对照+内标） 是样品中不存在的物质 与被测组分峰靠近 能与各组分完全分离 与被测组分的量接近 内标物

99 实际工作中的计算方法 K W × 稀释倍数 2 对 VitE % = × × % 100 K W 稀释倍数 × 1 样

100 维生素发展史 公元前3500年-古埃及人发现能防治夜盲症的物质，也就是后来 的维A。
  公元前3500年-古埃及人发现能防治夜盲症的物质，也就是后来 的维A。  1600年-医生鼓励以多吃动物肝脏来治夜盲症。  1747年-苏格兰医生林德发现柠檬能治坏血病，也就是后来的维C。 1831年-胡萝卜素被发现。  1905年-甲状腺肿大被碘治愈。  1911年-波兰化学家丰克为维生素命名。  1915年-科学家认为糙皮病是由于缺乏某种维生素而造成的 1916年-维生素B被分离出来。  1917年-英国医生发现鱼肝油可治愈佝偻病，随后断定这种病是 缺乏维D引起的。 

101 1993年-哈佛大学发表维生素E与心脏病关系的研究结果。
1920年-发现人体可将胡萝卜转化为维生素A。  1922年-维E被发现。  1928年-科学家发现维B至少有两种类型。  1933年-维E首次用于治疗。  1948年-大剂量维C用于治疗炎症。  1949年-维B3与维C用于治疗精神分裂症。  1954年-自由基与人体老化的关系被揭开。  1957年-Q10多酶被发现。  1969年-体内超级抗氧化酶被发现。  1970年-维C被用于治疗感冒。  1993年-哈佛大学发表维生素E与心脏病关系的研究结果。 返 回

102 练习与思考 [A型题] 1. 维生素B1的鉴别方法是 A.三氯化铁反应 B. 硫色素反应 C. 柯柏反应 D.与碱性酒石酸铜试液反应
E. 双缩脲反应

103 2. 维生素E《中国药典》规定的含量 测定方法为 A.非水溶液滴定法 B.旋光法 C.HPLC法 D.紫外分光法 E.GC法

104 [B型题] A。亚硝基铁氰化钠反应 B. 硫色素反应 C.硝酸反应 D. 三氯化锑反应 E. 硝酸银试液的反应 1. 维生素C

105 [X型题] 1. 用碘量法测定的药物有 A. 醋酸地塞米松 B. 丙酸睾酮 C. 维生素C D. 硫酸阿托品 E. 维生素C注射液

106 2. 可用紫外分光光度法测定含量的 药物有 A. 维生素A丸剂 B. 丙酸睾酮 C. 维生素A D. 硫酸阿托品 E. 维生素B1片 返 回

107 简答题 简述碘量法测维生素C含量的原理及实验注意事项。

108 第四节 维生素D 一、结构与性质 维生素D2－骨化醇

109 维生素D3－胆骨化醇

110 开环的甾体：具有甾类化合物的显色反应，可用于鉴别。
手性碳原子：具有旋光性，可用于鉴别。 多烯：可进行紫外检测。

111 性质： 1、脂溶性 2、不稳定性 3、旋光性 4、显色反应 5、紫外吸收特性

112 二、鉴别试验 1. 显色反应 醋酐-硫酸反应 D2 黄 红 紫 绿 D3 黄 红 紫、蓝绿 绿 三氯化锑反应 橙红色渐变粉红
三氯化锑反应 橙红色渐变粉红 三氯化铁反应 橙黄色 二氯丙醇和乙酰氯反应 绿色

113 2. 比旋度鉴别 维生素D2 维生素D3 溶 剂 无水乙醇 无水乙醇 40mg/ml 5mg/ml 比旋度值
溶 剂 无水乙醇 无水乙醇 浓 度 40mg/ml 5mg/ml 比旋度值 +102.5°～+107.5° +105°～+112° 注意事项：应于容器开启30分钟内取样， 在溶液配制后30分钟内测定。

114 4.其他方法： 3.区别反应： 以96%乙醇为溶剂，加乙醇和85%硫酸，D2 显红色，在570nm处有最大吸收，D3显黄色，
TLC、HPLC、制备衍生物测熔点

115 三、杂质检查 维生素D2中麦角甾醇的检查：加洋地黄皂苷溶液，混合，放置18h不得发生浑浊或沉淀。 前维生素D的光照产物

116

117 四、含量测定方法 中国药典采用正相高效液相色谱法(NP-HPLC）测定维生素D的含量，定量方法为内标法，内标物为邻苯二甲酸二甲酯。
根据样品的具体情况按以下三个方法进行分析。

118 固定相：硅胶 流动相：正己烷-正戊醇（997：3）
第一法：用于无维生素A醇及其它杂质干扰的情况，步骤如下： 1．系统适用性试验：测定重复性和分离度。 固定相：硅胶 流动相：正己烷-正戊醇（997：3）

119 第二法：用于有杂质的干扰的情况，步骤如下： 1．皂化处理：皂化、乙醚提取、洗涤提取液、蒸除乙
醚、制备供试液A。 2．净化：供试液A经液相色谱分离，准确收集含有维 生素D及前维生素D混合物的全部流出液，制 备成供试液B。 固定相：ODS 流动相：甲醇-乙腈-水（50：50：2） 3．含量测定：取供试液B按第一法测定。

120 第三法：用于经第二法处理后仍有杂质的干扰的情况。步骤如下：
1．制备供试液：取供试液A，净化，水浴加热，正已烷溶解，得供试液C。 制备对照液：对照品储备液（异辛烷溶解）：稀释、加热。 2．含量测定：在第一法的色谱条件下，交替精密进样 对照液和供试液，按外标法定量。

121 Discussion 1、采用的是正相高效液相色谱法 2、测定过程中应避免VitD的氧化
3、皂化应剧烈振摇，水浴温度≤40℃，提取溶剂大多采用己烷或戊烷以消除苯的毒性 4、若供试品中没有VitA醇及其它杂质干扰时，可以直接进样分析 5、注意色谱系统适用性样品VitD、前VitD的制备方法