第十四章 维生素类药物分析 Analysis of Vitamins

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1 第十四章 维生素类药物分析 Analysis of Vitamins
定义:维持人类机体正常代谢功能所必需的一类活性物质, 体内不能合成, 必须从食物中摄取. VitA, E, B, C, D.

2 脂溶性 水溶性 VitB族(B1、B2、B6、B12) VitC、叶酸、烟酸、烟酰胺 VitM VitPP
VitA、D2、D3、 E、K1 等 水溶性 VitB族(B1、B2、B6、B12) VitC、叶酸、烟酸、烟酰胺 VitM VitPP

3 第一节 维生素 A R -H 维生素A醇 -COCH 维生素A醋酸酯 -COC15H 维生素A棕榈酸酯

4 一、结构和性质 1.与有机溶剂混溶, 2.共轭双键：UV、多个立体异构、易氧化. 3.与SbCl3发生显色反应. 4.分为维生素A醇和酯.

5 相对生物效价 维生素A （全反式） % 新维生素Aa % 新维生素Ab % 新维生素Ac % 异维生素Aa % 异维生素Ab %

6 脱氢 VitA2 脱水 VitA3 聚合物 鲸醇

7 共轭多烯侧链 易被氧化 △或有金属离子存在时氧化↑；VitA密封凉暗处，充氮气或加入抗氧剂保存

8 环氧化物 VitA醛 VitA酸

9 试剂：饱和无水SbCl3的无醇CHCl3溶液 现象：蓝色（渐变为紫红色）
二、鉴别试验 1.三氯化锑反应 试剂：饱和无水SbCl3的无醇CHCl3溶液 现象：蓝色（渐变为紫红色） （Ｃarr-Price反应）

10 蓝色 紫红

11 2.UV: VitA（λmax326nm）→HCl/加热得脱水VitA（350～390nm有3个峰,348,367,389nm）

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13 3.TLC BP 对照品法 显色剂 三氯化锑 USP 显色剂 磷钼酸 规定斑点颜色和Rf值

14 三、含量测定 （一）UV：三点校正法（★） 1.原理： （1）杂质的吸收在310~340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小；
（2）物质对光的吸收具有加和性。 A样=A纯品+A杂质 

15 2.生物效价：每克供试品中所含VitA的国际 单位数（IU/g） 3.换算因子：每1个E数值所相当的效价。 换算因子=效价/E
1 IU=0.344μg VitA醋酸酯=0.300µg VitA醇 每克维生素A醋酸酯相当于 IU 每克维生素A醇相当于 IU 1% 1cm

16 溶剂 max 换算因素 E VitA醋酸酯 环己烷 VitA醇 异丙醇 5、三点波长的选择： 1）等法: 用于VitA醋酸酯测定， 1=328，2=316，3=340nm ( 3－1 = 1－2) 2）等A法:VitA醇及不能用第一法测定的VitA醋 酸酯 325，310，334nm (A2=A3=6/7A1)

17 判断 是否在326～329nm之间 在326～329nm之间 是 否 改用第二法 求算 并与规定值比较

18 计算： A×D×1900×W W×100×标示量 标示量%= 6、测定： 第一法（适用于VitA醋酸酯 ）
VitA醋酸酯加环己烷制成9-15µg/ml，测5个波长下的吸收度，计算Ai/A328。 计算： A×D×1900×W W×100×标示量 标示量%=

19 A值选择 （nm） A A A A A A5 Ai/A A1/A3 A2/A3 A3/A3 A4/A3 A5/A3 药典规定值 判断方法： 1.最大吸收值是否在 nm间； 2.计算Ai/A328 与药典规定值 之差.若  0.02， 用A328计算. 3.若一个以上超过 0.02，计算 A328校正=3.52（2 A328 –A316 – A340）

20 4.求f值 （1） 3%，用A328计算 （2）-15%～-3%，用A328校正计算 （3）﹤-15%或﹥+3%用第二法

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22 例:VitAD胶丸中VitA的含量测定 精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0
例:VitAD胶丸中VitA的含量测定 精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量 g/丸）的内容物 g 至250ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一20 ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度为

23 A300 /A328 ：0.555 A316/A328 ：0.907 A328/A328 ：1.000 A340/A328 ：0.811 A360/A328 ：0.299 A300 ：0.354 A316 ：0.561 A328 ：0.628 A340 ：0.523 A360 ：0.216 求本品中维生素A的含量？

24 规定: 0.555 0.907 1.000 0.811 0.299 A300 /A328 ：0.564 A316/A328 ：0.893 A328/A328 ：1.000 A340/A328 ：0.833 A360/A328 ：0.344 + 0.01 －0.01 + 0.02 + 0.04 － =

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26 如果用A328测定值计算，则为102.8%

27 UV第二法（皂化法） 适合于维生素A醇以及VitA醋酸酯用第一法无法消除杂质干扰时用此法
1.方法：在300，310，325，334nm处测定吸收度 2.计算：求E

28 3、A值选择： （1）max在323～327nm之间，且A300/A325  A325校正=6.815A325–2.555A310–4.260A334 （A325校正-A325）100%/A325 3%，则用A325计算 超出3%，则用A325校正计算 （2）若max不在323～327nm之间或A300/A325大于0.73，色谱法纯化后再测定。

29 判断max是否在323～327nm之间 是 否 取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定 计算

30 判断 A300 /A325 是否小于或等于0.73 否 是 取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定 计算A325(校正)

31 （二） HPLC:NP-HPLC，ChP（2010）新增方法,第二法，外标A定量
(三)三氯化锑比色法 1、原理： VitA加饱和无水SbCl3的无醇CHCl3溶液 显蓝色 2、方法：标准曲线法 3、注意：1)快速测定 , 2)无水操作 , 3)样品温度, 4) 专属性

32 第二节 维生素B1的分析 HCl Cl- 氨基嘧啶环－CH2－噻唑环(季铵碱)

33 一、结构和性质 1、易溶于水 2、硫色素反应 3、UV:λmax=246nm 4、噻唑N（季胺盐）和伯氨基碱性强,显二元碱;嘧啶环上2个N碱性弱，不能成盐 5、与生物碱沉淀剂反应生成恒定的沉淀

34 二、鉴别试验 1.硫色素反应thiochrome reaction（VitB1特有）
强碱性：NaOH试液（3.25mol/L）,加酸荧光消失. 氧化剂：铁氰化钾, 产物：三环共轭显兰色荧光

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36 氧化 硫色素

37 2.沉淀反应 碱性N：与硅钨酸，重金属盐等反应生成沉淀；类似生物碱性质

38 沉淀反应 VitB1 H+ H+ H+ H+

39 3. Cl- Cl-反应

40 4.硫元素反应 S元素反应

41 5.IR

42 三、含量测定 1、非水溶液滴定法(原料) （1）盐酸盐ChP2005加HgAc25ml， ChP2010不加
（2）VitB1:HClO4（1:2）,指示剂:喹哪啶红-亚甲蓝（ChP2005），ChP2010用电位法 T=0.1×1/2×337.27=16.86mg.

43 2、UV(制剂): 246nm， 片剂 A×D ×W ×1000×100% E × 100×W ×S标
D=100×100÷5 , E=421 注射液: A×D ×1000×100% E × 100×V ×S标 标示量%= 标示量%=

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45 3、硫色素荧光法：USP34-NF29 VitB1 OHˉ/铁氰化钾 硫色素, 异丁醇提取, 365 nm下呈蓝色荧光，435nm, 对照品法测定含量.

46 S 对照液 d A 供试液 b + NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 + NaOH + 异丁醇 + NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇

47 第三节 维生素 C

48 1、易溶于水 2、水溶液呈酸性 一、结构和性质 1.溶解性, C3－OH的 pKa = 4.17 一元酸 C2－OH的

49 2. 光学活性 手性C（C4、C5） * L(+)－抗坏血酸 活性最强 *

50 3.强还原性:烯醇式(dienol group)结构

51 有活性 无活性 有活性

52 与碱反应 4. 水解反应

53 5. 具糖的性质 结构与糖类相似 糖类的显色反应 50℃

54 6. UV:

55 二、鉴别试验 1、AgNO3反应(ChP2010)：

56 2、与2，6 - 二氯靛酚反应 (ChP2000) 还原型 氧化型 玫瑰红色 蓝色 OHˉ

57 3、与其他氧化剂反应： VitC：亚甲蓝、碱性酒石酸铜试液(USP)、KMnO4

58 4.TLC:CHP2010 对维生素C制剂（泡腾片）进行鉴别
5.具糖类性质(USP)： VitC 水解、脱羧, 脱水生成糠醛,加吡咯加热变为蓝色

59 戊糖 50℃ （蓝色） ← (糠醛) (吡咯)

60 6.UV(BP)： 0.01molHCl中243nm有最大吸收

61 三.杂质检查 1.溶液澄清度和颜色 ChP2010测定420nm吸收度:原料(200mg/ml),A应﹤0.03,注射剂(50mg/ml)A应﹤0.06,片剂(50mg/ml)A应﹤0.07 2.Fe,Cu:AAS Fe:供试液:5g 0.1MHNO3 25ml,测A为b 对照液:5g 1ml标准Fe,0.1MHNO3 25ml测A为a 要求:b﹤(a-b)

62 3.草酸:加CaCl2检查澄清度. 草酸+钙→草酸钙 比浊法 供试品溶液：样品+水+氢氧化钠试液+稀醋酸+氯化钙试液,放置1小时,浑浊 对照品溶液：草酸+水+氢氧化钠试液+稀醋酸+氯化钙试液,放置1小时,浑浊

63 三、含量测定 1. 碘量法：直接碘量法 1）VitC还原性强 2） VitC :I2=1 :1
3) 条件:酸性,滴定剂:I2(0.05mol/L),指示剂:淀粉 H H O H O H H O H O O H + O O + I2 O + 2HI O H O H O O

64 4）注射剂测定+丙酮,消除抗氧剂 NaHSO3的干扰 5) 片剂:过滤后测定 ) T=0.05× ×1/1=8.806mg

65 取本品约0. 2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0
取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6.

66 2. 2，6-二氯靛酚滴定法(USP, JP)→条件：酸性, 自身指示剂法指示终点, 滴定剂：2,6-二氯靛酚
3. HPLC:用于多种维生素含量测定. 考虑:检测波长, 分离条件(流动相)

67 第四节 维生素D的分析 维生素D2 维生素D3

68 一、结构和性质 1. 无色针晶或白色粉末 2. 含多个双键, UV吸收(λmax265nm), 极不稳定, 易氧化变质, 效价↓, 毒性↑. 3. 具有旋光性. 4. 类似甾体结构 H2SO4/Ac2O 显色. 5. 脂溶性.

69 二. 鉴别 1.显色:VD H2SO4/Ac2O 黄→红→紫→绿. SbCl3 红. 原料:IR
3. VD2，D3区别: H2SO4/EtOH ，λmax: D2为 570nm, D3为495nm.

70 三 杂质检查 1.麦角甾醇→D2:本品10mg 90% EtOH 溶解，加洋地黄毒苷，不得产生浑浊或沉淀. 2.前维生素D光照产物检查
三 杂质检查 1.麦角甾醇→D2:本品10mg 90% EtOH 溶解，加洋地黄毒苷，不得产生浑浊或沉淀. 2.前维生素D光照产物检查 3.有关物质：NP-HPLC

71 四 含量测定(ChP:HPLC) 无VA醇和其它杂质干扰时，用第一法，否则用第二法 第一法:
1.对照液:D2，D3均为0.25mg/mL(异辛烷). 2.内标液:邻苯二甲酸二甲酯 1mg/mL (正己烷). 3.色谱条件及系统适用性试验:取D3①对照液,用正己烷稀释,用波长为254nm和365 nm的紫外光照射,使产生前D3②,反式D3③,速甾醇④等,(1)进样5次,测定D3峰值,RSD应＜2.0%. (2)测定②与和③以及 ①和 ④的R均应＞1.0。

72 4.F测定: VD As/ms Ar/mr. D3对照液5ml，加2,6二叔丁基对甲酚1粒，通N2， 90°C水浴1.5hr，冷后加内标5ml,加正己烷到50ml，进样，计算前VD折算成VD的校正因子: f2=(Asmr﹣f1msAr1)/(Ar2ms) s:内标， 1:VD， 2:前VD， r:对照 5.含量:本品25mg加三甲基戊烷80ml,超声1min定溶到100ml，取5ml加内标5ml加正己烷至50ml. HPLC测定VD总量: mi=(f1Ai1+f2Ai2)ms/As f1=

73 第五节 维生素E * * *

74 名 称 R1 R2 相对活性 α-生育酚 β-生育酚 CH3 H 1.0 0.5 0.2 0.1 一、结构和性质 γ -生育酚 δ -生育酚
1、有、、 、 结构,天然品为d-,合成品为dl-，生物效价: 右旋体：消旋体=1.4:10 名 称 R1 R2 相对活性 α-生育酚 β-生育酚 γ -生育酚 δ -生育酚 CH3 H 1.0 0.5 0.2 0.1

75 4、VitE（加热水解)→游离生育酚 氧化 醌型 化合物 5、UV :λmax=284nm
2、微黄色或黄色透明的粘稠液 3、不溶于水，易溶于有机溶剂 4、VitE（加热水解)→游离生育酚 氧化 醌型 化合物 5、UV :λmax=284nm

76 二、鉴别试验 1.硝酸反应（水解氧化同时发生） 75℃15′

77 取本品约30mg，加无水乙醇10ml溶解后，加硝酸2ml，摇匀，在75℃加热15分钟，溶液应显橙红色。

78 2.FeCl3反应（可区别VitE和生育酚） VitE（醇制KOH，水解)→生育酚（FeCl3氧化) →对位醌+Fe+2（2，2′联吡啶，显色)→血红色

79 生育酚 弱氧化剂 [O] 对-生育醌

80 3.UV:λmax=284nm, λmin=254nm = 41.0～45.5

81 4.TLC 5.IR及GC:ChP2010采用IR鉴别VE 薄层板 硅胶G 展开剂 环己烷 -乙醚（4 ：1） GC鉴别VE软胶囊和VE粉
展开剂 环己烷 -乙醚（4 ：1） 显色剂 硫酸（105℃ 5′） VitE Rf = 0.7

82 三、杂质检查 1. 酸度:检查游离醋酸,滴定法:本品1g,用0.1mol/L氢氧化钠滴定，酚酞指示液指示，不得过0.5ml。
2.生育酚→滴定液：0.01mol/L Ce（SO4）2 , 指示剂：二苯胺。 0.1g本品加无水乙醇5ml,消耗滴定液不得过1.0ml.L=2.15% T=0.01×430×1/2=2.154mg 3.有关物质:GC,主成分自身对照法 4.残留溶剂（正己烷）:GC,顶空进样

83 四、含量测定 1.GC(ChP2010) 固定相：硅酮OV-17，检测器：FID，内标：正三 十二烷 n﹥500或5000， R应符合规定。
As/Cs Ax×Cs Ar/Cr As f= Cx=f 内标: 样品中不存在的物质 与被测组分峰靠近 能与各组分完全分离 与被测组分的量接近

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85 内标液 取正三十二烷加正己烷溶解 并稀释成1.0mg/ml溶液 例 对照液 :精密称取VitE对照品0.2011g, 置棕色具塞锥形瓶中，精密加入内标液10ml，密塞，振摇使溶解，取1~3ul注入GC仪，测定，计算 供试液: 精密称取供试品0.1998g置棕色具塞锥形瓶中，精密加入内标液10ml，密塞，振摇使溶解，取1~3ul注入GC仪，测定，计算

86 0.373 对照液 0.368 供试液 本品含C31H52O3应为96.0 ~ 102.0%

87 2.HPLC(JP):外标法(h) 固定相→十八烷基硅烷键合硅胶 流动相→甲醇-水（49：1） 检测波长→292nm; R＞2.6; RSD≤0.8% 3.FLu

88 第六节 复方制剂分析 HPLC

89 例：VitB1片UV法含量测定，取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于VitB1 25mg），置100ml量瓶中，加盐酸溶液(9→1000)约70ml，振摇15分钟，加盐酸溶液(9→1000)稀释至刻度。用干燥滤纸滤过，精密量取续滤液5.0ml，置另一100ml量瓶中，再加盐酸溶液(9→1000)稀释至刻度，摇匀，在246nm处测定吸收度，按C12H17ClN4OS·HCl的吸收系数E为421计算，即得。 已知：20片重=1.4070g，A246=0.461 取样量=0.1551g，规格=10mg/片 求：本品含量是否符合药典规定？ （应相当于标示量的90.0～110.0%)

90 小结 1. VitA:UV(三点校正法)测定含量. 2. VitB1:硫色素,UV和非水碱量法测定含量.
3. VitC:还原性→鉴别和含量测定 4. VitD:HPLC, 5. VitE:GC测定含量,游离酚.