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第十四章 维生素类药物的分析
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维生素: 是维持人体正常代谢机能所必需的微量营养物质。人体不能合成维生素。
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分类: 脂溶性 VitA、D2、D3、 E、K1 等 VitB族(B1、B2、B6、B12) VitC、叶酸、烟酸、泛酸 水溶性
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第一节 维生素A的分析 全反式 -H 维生素A醇 -COCH 维生素A醋酸酯 -COC15H 维生素A棕榈酸酯 R :
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相对生物效价 一、结构与性质 (一)结构:具有共轭多烯侧链的环己烯 顺反异构 维生素A 325.5 100% 全反式
新维生素Aa % -顺 新维生素Ab % -顺 新维生素Ac % ,4-顺 异维生素Aa % -顺 异维生素Ab % ,6-顺
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共轭多烯侧链易发生脱氢、脱水、聚合反应 VitA2 VitA3 鲸醇
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环氧化物 VitA醛 VitA酸
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(二)性质 1.溶解性:易溶于有机溶剂和植物油等,不溶于水 2.不稳定性 3.紫外吸收特性 4.与三氯化锑呈色 CHCl3
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二、鉴别试验 (一)三氯化锑反应 CHCl3 条件: 无水、无醇 水 SbCl3 SbOCl 乙醇可使碳正离子的正电荷消失
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蓝色 紫红
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UV法 (二) BP(2008) λmax为326nm 一个吸收峰 λmax为350~390nm 三个吸收峰
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VitA ↓ 去水VitA(VitA3)
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TLC法 (三) BP 对照品法 显色剂 三氯化锑 USP 显色剂 磷钼酸 规定斑点颜色和Rf值
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(一) 含量测定 三、 UV法(三点校正法) 立体异构体 氧化产物及光照产物 合成中间体 去氢维生素A( VitA2)
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三点校正法 1. 前提条件: (1)杂质的吸收在310~340nm波长范围内呈一条直线,且随波长的增大吸收度减小; (2)物质对光的吸收具有加和性。
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2. 波长的选择: (1) VitA的max(如VitA酯 328nm) (2) 3 分别在1的两侧各选一点 第一法 等波长差法 测定对象:VitA醋酸酯 第二法 等吸收比法(皂化法) 测定对象:VitA醇
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3、测定法 (1)基本步骤: 第一步:A选择,A328测定或A328校正 第二步:求 第三步 求效价
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第四步:求标示量% A*D*换算因数*W = W*100*标示量 ×100%
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换算因数: 单位E 数值所相当的效价数 (由纯品计算而得)
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A值的选择: 1、 维生素A醋酸酯-第一法(等波长差法) 判断 是否在326~329nm之间 是 否 求算 并与规定值比较 改用第二法
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规定值 差值 判断差值是否超过
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有超过0.02 无超过 用A328计算 计算 A328(校正) 第二法 第二法 3% -15% -3% f
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VitAD胶丸中VitA的含量测定 精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下(平均装量 g/丸)的内容物 g 至250ml量瓶中,用环己烷稀释至刻度,摇匀;精密量取2.0ml,置另一20 ml量瓶中,用环己烷稀释至刻度,摇匀。以环己烷为空白,测定最大吸收波长为328nm,并在下列波长处测得吸收度为 A300 :0.354 A316 :0.561 A328 :0.628 A340 :0.523 A360 :0.216 A300 /A328 :0.555 A316/A328 :0.907 A328/A328 :1.000 A340/A328 :0.811 A360/A328 :0.299 求本品中维生素A的含量?
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+ 0.01 -0.01 + 0.02 + 0.04 A300 /A328 :0.564 A316/A328 :0.893 A328/A328 :1.000 A340/A328 :0.833 A360/A328 :0.344 - 0.555 0.907 1.000 0.811 0.299 =
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2、维生素A醇-等吸收比法(皂化法、6/7A法
脂溶性 水溶性
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判断max是否在323~327nm之间 否 是 取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定 计算 0.73 0.73
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-3% 3% f
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(二)高效液相色谱法 色谱柱:硅胶; 流动相:正己烷-异丙醇(997:3) 检测波长:325nm 流 速: 1.2ml/min 内 标:VA醋酸酯
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三氯化锑比色法 (三) 标准曲线法 λmax 618nm~620nm 优点: 简便 快速 呈色不稳定 (5 ~ 10s内) 水分干扰 缺点:
优点: 简便 快速 缺点: 呈色不稳定 (5 ~ 10s内) 水分干扰 与标准曲线温差≤1℃ 专属性差 三氯化锑有腐蚀性
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第二节 维生素B1的分析 一、结构与性质 (一)结构 HCl Cl- 氨基嘧啶环-CH2-噻唑环(季铵盐)
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二、性质 1. 溶解性:易溶于水,水溶液呈酸性。 2. 硫色素反应 3. UV共轭双键λmax = 246nm 4. 与生物碱沉淀试剂反应
5.氯化物的特性
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二、鉴别试验 (一) 硫色素荧光反应 专属性反应
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+2H 硫色素,蓝色荧光
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(二) 沉淀反应 VitB1 H+ H+ H+ H+
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(三) 其他反应 S元素反应 Cl- H+
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三、含量测定 (一) 非水溶液滴定法 冰醋酸+醋酐,电位法指示终点
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UV法 (二) 片剂、注射剂 = 421 A = ECL
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(三) 硫色素荧光法 原理 1. NaOH
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- = - ´ S d A b A b C样 ×C标 d S 特点 3、 + NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 对照液
供试液 b - A b = C样 ×C标 - d S 特点 3、 (1)灵敏度高,线性范围宽 (2)专属性强,氧化产物及代谢产物不干扰,可用于制剂分析,体液分析等。
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第三节 维生素C的分析 结构与性质 一、 (一)结构 二烯醇 内酯 两个手性碳(C4,C5) L-抗坏血酸
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* * (二)性质 1. 溶解性:易溶于水水溶液呈酸性 2. 酸性:一元酸,C3-OH的pKa = 4.17,C2-OH的
3. 旋光性:手性C(C4、C5) 4. 还原性 5. 水解反应: 6. 具糖的性质:具糖类的性质与反应 7. UV特征 * *
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二烯醇结构-还原反应 有活性 无活性 有活性
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鉴别试验 二、 利用还原性:与氧化剂的反应
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(一)与AgNO3反应 (二)与2,6 - 二氯靛酚反应 还原型 氧化型
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(三)与其他氧化剂反应 USP 与碱性酒石酸铜反应 与KMnO4反应 四、薄层色谱法: Rf值
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(五)糖类的反应 50℃ (吡咯) (蓝色)
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(六)UV BP 0.01mol/L HCl
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三、杂质检查 (一)溶液的澄清度与颜色检查 维生素C原料药 糠醛缩合呈色 片 剂 注射剂 (二)铁、铜离子的检查 原子吸收法 维生素C原料药
片 剂 注射剂 糠醛缩合呈色 (二)铁、铜离子的检查 原子吸收法 维生素C原料药 (三)草酸的检查:氯化钙
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四、含量测定 (一)碘量法 原理:利用Vc强的还原性 指示剂 淀粉 H+
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2、方法 原料药 取本品约0.2g,精密称定,加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解,加淀粉指示液1ml,立即用碘滴定液(0.05mol/L)滴定,至溶液显蓝色,在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6。
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3、讨论 赶走水中O2 (1)新沸冷H2O (2)酸性环境 稀醋酸 减慢VitC被O2氧化速度 (3)立即滴定 减少O2的干扰
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4. 附加剂干扰的排除 片剂 ——过滤 注射剂 —— 抗氧剂 —— 丙酮 甲醛 Na2SO NaHSO3 Na2S2O3 Na2S2O5
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O a S 3 + H 2 N 5 C H O 2 H O N C S 3 a
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(二) 2,6 - 二氯靛酚滴定法 1、原理 2、方法 自身指示终点法
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3、讨论 (2)快速滴定 2min内 (1)酸性环境 HPO3-HAc 稳定VitC 防止其他还原性物质干扰 (3)亦可剩余比色测定
(定量过量) (测剩余染料)
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(4)缺点 不稳定 需经常标定 贮存≤一周 (5)优点 专属性强,多用于含 Vc的制剂和食品的分析
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(三)高效液相色谱法 血浆中维生素C的测定(稳定性)
标准溶液包括样品预处理过程均需加入偏磷酸,偏磷酸同时可用于血样中的蛋白沉淀;当天取血当天测定;处理好的样品亦需冰箱保存
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第四节 维生素D的分析 一、结构与性质 (一)结构 维生素 D2(麦角骨化醇) 维生素D3(胆骨化醇)
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(二)性质 1.性状:无色针状结晶或白色结晶性粉末;无臭,无味。 2.溶解性:宜溶于有机溶剂,在植物油中略溶,在水中不溶。
3.不稳定性:含有多个烯键,所以极不稳定,宜氧化变质,效价降低,毒性增强。
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4.旋光性 维生素D2 6个手性碳原子 维生素D3 5个手性碳原子 5.显色反应:甾类化合物 氯仿溶液 黄色 红色 紫色 绿色
氯仿溶液 黄色 红色 紫色 绿色 6.紫外吸收特性:无水乙醇 nm 醋酐 硫酸
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二、鉴别试验 (一)显色反应 1.与醋酐-浓硫酸反应 氯仿溶液 黄色 红色 紫色 绿色 2.与三氯化锑反应 本品 橙红色 粉红色 醋酐 硫酸
氯仿溶液 黄色 红色 紫色 绿色 2.与三氯化锑反应 1,2-二氯乙烷 三氯化锑试液 本品 橙红色 粉红色
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3.其它显色反应 维生素D 橙黄色 绿色 (二)比旋度鉴别 无水乙醇溶液 维生素D2 比旋度为+102.5°至+107.5° 维生素D3
三氯化铁 维生素D 橙黄色 二氯丙醇 乙酰氯 绿色 (二)比旋度鉴别 无水乙醇溶液 维生素D2 比旋度为+102.5°至+107.5° 维生素D3 比旋度为+105°至+112°
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(三)其它鉴别方法 (四)维生素D2、D3的区别反应 薄层色谱法、HPLC法 制备衍生物测熔点 紫外、红外吸收光谱 红色λmax570nm
乙醇1ml 和85%硫酸5ml 96%乙醇 取0.1ml 维生素D3 黄色 λmax495nm 10ml
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三、杂质检查 (一)麦角甾醇的检查 洋地黄皂苷溶液 维生素D290%乙醇溶液 不得发生浑浊或沉淀
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(二)前维生素D的光照产物
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四、含量测定 正相高效液相色谱法 (一)维生素D测定法 含量以单位表示 每单位相当于维生素D 0.025μg
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测定在半暗室及避免氧化的情况下进行 第一法:无干扰杂质 第二法:有VA及其他杂质干扰 第三法:用第二法时,前 VD峰受杂质干扰 仅VD峰可分离
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第一法 无干扰杂质 内标物:邻苯二甲酸二甲酯 色谱条件及系统适用性试验: 填充剂:硅胶 流动相:正己烷-正戊醇(997:3)
检测波长:254nm
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系统适用性试验 维生素D3 >1.0 >1.0 溶液组成 分离度 前维生素D3 反式维生素D3 维生素D3 速甾醇D3 0.5 0.6
1.1 >1.0 △ 光照 >1.0 先后进样5次,维生素D3 峰面积的 RSD≤2.0 %
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f2=(Asmr-f1msAr1)/(Ar2ms)
校正因子测定: 维生素D的校正因子: f1=Asmi/Aims 前维生素D折算成维生素D的校正因子: f2=(Asmr-f1msAr1)/(Ar2ms) 含量测定:计算维生素D及前维生素D折算成 维生素D的总量 mi=(f1Ai1+f2Ai2)ms/As
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第二法 有VA及其他杂质干扰 第一步:皂化提取 供试品 OH- 加热回流 冷却 乙醚提取 乙醚提取液 挥干乙醚 残渣 甲醇溶解 供试溶液A
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第二步:分离收集 供试品溶液A 供试品溶液B 维生素D 前维生素D 维生素A及其他杂质 叠峰 分离 第三步:按第一法进行含量测定(内标法)
内标的正己烷溶液 RP-HPLC 分离 收集 挥干 溶解 维生素D及前维生素D 第三步:按第一法进行含量测定(内标法)
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第三法 第一步:皂化提取 同第二法得供试品溶液A 第二步: 供试品溶液A 维生素D 前维生素D 维生素A及其他杂质 叠峰 分离 供试品溶液C
用第二法时,前 VD峰受杂质干扰 第一步:皂化提取 同第二法得供试品溶液A 前维生素D 维生素D 第二步: 供试品溶液A 维生素D 前维生素D 维生素A及其他杂质 叠峰 分离 RP-HPLC 收集 异辛烷溶解 90℃、1.5h 挥干 挥干 正己烷溶解 供试品溶液C 第三步:用第一法色谱条件按外标法计算含量
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第五节 维生素E的分析 一、结构与性质 (一)结构 苯并-二氢吡喃醇
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* * * 名 称 R1 R2 相对活性 α-生育酚 β-生育酚 γ-生育酚 δ-生育酚 CH3 H 1.0 0.5 0.2 0.1
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dl-α-生育酚醋酸酯 生物效价 右旋体 : 消旋体 = 1.4 :10
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(二)性质 1、溶解性:易溶于有机溶剂,不溶于水 2、水解性:酯键易水解 3、氧化性 △ 4、UV
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二、鉴别试验 (一) 硝酸反应 75℃15′ 橙红色
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生育酚 强氧化剂 HNO3 (橙红色) 生育红
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三氯化铁-联吡啶反应 (二) △ [O]
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生育酚 Fe3+ [O] 对-生育醌 红色
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UV法 (三) 0.01%无水乙醇中 λmax = 284nm λmin = 254nm
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TLC法 (四) 薄层板 硅胶G 展开剂 环己烷 -乙醚(4 :1) 显色剂 硫酸(105℃ 5′) (五)其他鉴别方法 红外、气相色谱法
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三、杂质检查 (一)酸度:游离醋酸 (二)生育酚 1. 原理:游离生育酚还原性,硫酸铈滴定 2. 试剂:硫酸铈滴定液(0.01mol/L)
指示剂:二苯胺(亮黄→灰紫)
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四、含量测定 GC法 (一) GC特点 1、 选择性好 灵敏度高 速度快 分离效能好 挥发性低、不稳定、极性强→衍生化。易受样品蒸气压限制
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2、VitE测定的色谱条件 内标法加校正因子定量 固定液→硅酮(OV-17) 担体→硅藻土或高分子多孔小球 柱温→265℃
检测器→氢火焰离子化检测器(FID) 内标→正三十二烷 内标法加校正因子定量
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几种常用的固定相 非极性:OV-1、SE-30、HP-1(100%二甲基聚硅氧烷),分析:溶剂、石油产品、药物,按沸点出峰;一般使用温度:-60℃~340℃。 非极性:SE-54、HP-5、DB-5(5%二苯基95%二甲基聚硅氧烷),分析:环境样品、香料;使用温度:-60℃~325℃。
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中等极性:OV-17、HP-50+(50%苯基-50%二甲基聚硅氧烷)。用途:酯类及其它极性适中的药物;一般使用温度:25℃~340℃。
极性:PEG-20、Carbowax20M、INNOWAX(聚乙二醇)。用途:香料、酸类、胺类、溶剂。一般使用温度: 40℃~280℃
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毛细管色谱柱选择 柱内径 特点 复杂样品分析 0.20mm 0.25mm 高柱效 高分离度 在分流模式下进行复杂样品分析 0.32mm
较高柱容量 复杂样品,宽的浓度范围,可用分流、不分流和直接进样模式 0.53mm 较好分离度 很高的柱容量 最适合作纯度分析和痕量分析,直接进样,升级替代填充柱
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样品容量与柱内径、膜厚及溶解度关系,记住相似相溶原理
一般厚膜柱适合分析低沸点样品;薄液膜适合分析高沸点化合物,同时固定相流失少。 检测器:主要有热导检测器(通用)、氢火焰离子化检测器、电子捕获检测器
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(二)RP - HPLC法(外标法) 样品→ dl-α-生育酚 固定相→十八烷基硅烷键合硅胶 流动相→甲醇-水(49 :1)
流动相→甲醇-水(49 :1) 检测波长→292nm R>2.6 RSD≤0.8%
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(三)荧光分光光度法 F样品 F空白 - VE= 4.0(mg/L) F标准 - F空白 对照品→ dl-α-生育酚
在220~400nm波长范围内,以发射、激发波长间隔Δλ为40nm扫描同步荧光光谱,测定同步荧光峰的荧光强度信号值。 F样品 F空白 - VE= 4.0(mg/L) F标准 - F空白
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第六节 复方制剂中多种维生素的分析 一、离子对HPLC法测定多种维生素 以樟脑磺酸作为离子对试剂,以二巯基丙烷磺酸钠作为抗氧剂
第六节 复方制剂中多种维生素的分析 一、离子对HPLC法测定多种维生素 以樟脑磺酸作为离子对试剂,以二巯基丙烷磺酸钠作为抗氧剂 二、反相HPLC法同时测定9种水溶性维生素 三、非水反相HPLC法同时测定4种脂溶性维生素
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