药物的分析 牡丹江医学院药学院 药物分析教研室.

Presentation on theme: "药物的分析 牡丹江医学院药学院 药物分析教研室."— Presentation transcript:

1 药物的分析 牡丹江医学院药学院 药物分析教研室

2 The Analysis of vitamins Drugs
第九章 The Analysis of vitamins Drugs 维生素类药物的分析 药学院 药化药剂教研室 李文超

3 概 述 1 概 述 1 维生素A的分析 2 维生素B1的分析 3 维生素C的分析 4 维生素D的分析 5 维生素E的分析 6

4 概 述 一、定义 维生素(vitamins)又称为维他命是维持人体正常代谢功能所必需的一类微量的生物活性物质，大多数人体内不能自行合成,必须从食物中摄取，主要用于机体的能量转移和代谢调节。 1897年艾克曼发现 1911年卡西米尔冯克鉴定

5 维生素缺乏症 维生素A：夜盲症，角膜干燥症，皮肤干燥，脱屑。　　 维生素B1：神经炎，脚气病，食欲不振，消化不良，生长迟缓 。　　 维生素B2：口腔溃疡，皮炎，口角炎，舌炎，唇裂症，角膜炎等 。　　 维生素C：坏血病，抵抗力下降 。　　 维生素D：儿童的佝偻病，成人的骨质疏松症 。　　 维生素E：不育，流产，肌肉性萎缩等。

6

7 维持人体正常生理机能所必须的生物活性物质
10%油、脂肪 及甜品 10%乳类制品 10%肉类、蛋类 制品 18%蔬菜 12%水果 40%谷类和麦类主食

8

9 维生素分布 维生素A：动物肝脏、蛋类、乳制品、胡萝卜、南瓜、香蕉、橘子和一些绿叶蔬菜中。 维生素B1：葵花籽、花生、大豆、猪肉、谷类中。
维生素C：柠檬、橘子、苹果、酸枣、草莓、辣椒、土豆、菠菜中。 　　 维生素D：鱼肝油、鸡蛋、人造黄油、牛奶、金枪鱼中。 维生素E：谷物胚胎、植物油、绿叶。 　　 忠告！ 食用新鲜蔬菜和水果是最简单而安全的补充维生素的方法！

10 概 述 二、分类 1. 脂溶性维生素﹙fat soluble vitamins﹚ VitA、D、E、K1
概 述 二、分类 1. 脂溶性维生素﹙fat soluble vitamins﹚ VitA、D、E、K1 2. 水溶性维生素( water soluble vitamins ﹚ VitB族 (B1、B2、B6、B12) 、VitC、叶 酸、烟酸、烟酰胺

11 三、分析方法 生物法、微生物法、化学法和物理化学法，多依据其生物特性及理化性质进行，但目前常用的分析方法是化学法或物理化学法。

12 第一节 维生素A的分析 一、结构和性质 维生素A 维生素A1（视黄醇）(retinol) 去氢维生素A (dehydroretinol)A2
30～40% 去水维生素A (anhydroretinol) A3 0.4%

13 主要来源于鲛类无毒海鱼肝脏中提取的脂肪油,即鱼肝油。从鱼肝油提取的VA多为各种酯类的混合物，其中主要为醋酸酯和棕榈酸酯。
来 源 主要来源于鲛类无毒海鱼肝脏中提取的脂肪油,即鱼肝油。从鱼肝油提取的VA多为各种酯类的混合物，其中主要为醋酸酯和棕榈酸酯。 六十万IU/g

14 第一节 维生素A的分析 定 义 药 典 VA 《中国药典》 人工合成的全反式VA醋酸酯结晶加精制植物油制成的油溶液 《美国药典》
药 典 VA 《中国药典》 人工合成的全反式VA醋酸酯结晶加精制植物油制成的油溶液 《美国药典》 VA及其 VA醋酸酯、棕榈酸酯混合物的食用油溶液 《英国药典》 VA醋酸酯、棕榈酸酯和丙酸酯混合物的植物油溶液

15 第一节 维生素A的分析 结构 -H 维生素A醇 -COCH3 维生素A醋酸酯 -COC15H31 维生素A棕榈酸酯 R :
共轭多烯醇侧链的环己烯 1 9 7 5 3 -H 维生素A醇 -COCH 维生素A醋酸酯 -COC15H 维生素A棕榈酸酯 R :

16 第一节 维生素A的分析 存在多种立体异构化合物 具有UV吸收 易发生脱氢、脱水、聚合 反应 共轭多 烯侧链 环己烯

17 第一节 维生素A的分析 9 1 2 3 4 5 6 7 8 五个异构体

18 鱼肝油

19 1. 性状 淡黄色油溶液或结晶与油的混合物；无败油臭。
第一节 维生素A的分析 性质 9 1 2 3 4 5 6 7 8 1. 性状 淡黄色油溶液或结晶与油的混合物；无败油臭。 2. 溶解性 VA易溶于CHCl3、乙醚、环己烷、石油醚，微溶于乙醇，不溶于水。

20 第一节 维生素A的分析 3. 不稳定性 易被空气中的氧所氧化； 易被紫外光裂解； 受热或有金属离子存在时更易氧化变质生成
3. 不稳定性 易被空气中的氧所氧化； 易被紫外光裂解； 受热或有金属离子存在时更易氧化变质生成 无生物活性的环氧化合物； 易被MnO2、氧化剂或脱氢酶氧化生成相应的醛和酸； 对酸不稳定，易脱水。 9 1 2 3 4 5 6 7 8

21 第一节 维生素A的分析 氧化过程 O2 [O] VA醛 H+ 重排 [O] VA酸 呋喃型氧化物（无生物活性）

22 第一节 维生素A的分析 + 酸脱水 + H+ + -H 烯丙型醇 遇酸易发生脱水反应 去水VA（VA3）

23 第一节 维生素A的分析 4、与三氯化锑发生呈色反应（Carr-price反应） 鉴别试验 CHCl3

24 第一节 维生素A的分析 5、紫外吸收特征 （鉴别和含量测定） 维生素A：5个共轭双键，无水乙醇液在326nm波长 处有最大吸收。
Vit A3 去水维生素A：6个共轭双键，其最大吸收波长向红移，在348、367、389nm波长间出现3个最大吸收峰。 Vit A

25 第一节 维生素A的分析 二、鉴别试验 1.三氯化锑反应； 2.紫外-可见分光光度法； 3.薄层色谱法:显色剂用三氯化锑或磷钼酸；

26 第一节 维生素A的分析 1.三氯化锑反应 （Carr-price 反应） CHCl3

27 第一节 维生素A的分析 注意事项：反应需在无水、无醇条件下进行。 溶剂：饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液
方法：VitA油溶液1滴→10ml无水三氯甲烷→2滴→2ml三氯甲烷+0.5mlSbCl3三氯甲烷溶液→蓝色→紫红色 注意事项：反应需在无水、无醇条件下进行。 水可使SbCl3水解成SbOCl 乙醇可与正碳离子作用，使正电荷消失 大量水可使SbCl5水解成Sb2O5 溶剂：饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液

28 第一节 维生素A的分析 2.紫外-可见分光光度法 Vit A3 △ 30s 326nm Vit A 无水乙醇-盐酸（100：1）

29 第一节 维生素A的分析 3.薄层色谱法: USP：规定斑点颜色和Rf值 BP：（鉴别维生素A的各种酯类） 薄层板：硅胶G； 薄层板：硅胶G；
展开剂：环己烷-乙醚（80：20）； 供试品溶液：维生素A的三氯甲烷溶液(1500IU/ml)0.01ml，展开10min 显色剂：磷钼酸溶液。 规定：维生素A醇及其醋酸酯均蓝绿色，Rf分别0.1、0.45、和0.7。 BP：（鉴别维生素A的各种酯类） 薄层板：硅胶G； 展开剂：环己烷-乙醚(80：20)； 供试品与对照品溶液：环己烷为溶剂5IU/μl各2μl； 显色剂：三氯化锑溶液。

30 第一节 维生素A的分析  三、含量测定 Assay 含量＝？ UV法 HPLC法 SbCl3比色法 (1) (3) (2)
加SbCl3无水CHCl3溶液，在618~620nm波长处有最大吸收，符合Beer定律。

31 第一节 维生素A的分析 A=E1%1cmCL （一）紫外分光光度法 325～328nm
优点：快速、准确，测定结果能较正确的反映VA的生物效价。 UV-Vis 缺点：杂质在325～328nm处有吸收，对VA测定有干扰。

32 第一节 维生素A的分析 9 1 2 3 4 5 6 7 8 杂质 (1)异构体

33 第一节 维生素A的分析 (2)维生素A2和维生素A3

34 第一节 维生素A的分析 (3)维生素A的氧化产物 环氧化物 VitA醛 VitA酸

35 第一节 维生素A的分析 (4)维生素A聚合物 鲸醇

36 第一节 维生素A的分析 1、原理： 三点校正法——三波长测定法 Ａ２ Ａ１ Ａ３ λ１ λ３ A=E1%1cmCL
（1）杂质的吸收在310～340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小； A=E1%1cmCL （2）物质对光的吸收具有加和性。

37 第一节 维生素A的分析 2、三点波长选择： 第一法：等波长差法： 1- 2= 3-1 《中国药典》测定VA醋酸酯 环己烷
1=328nm、 2=316nm、 3=340nm A1 环己烷 A2 A3 Aλ1 Aλ2 Aλ3 X2 X1 X3

38 第一节 维生素A的分析 第二法：等吸收比法： A2=A3= 6/7Amax 《中国药典》中测定VA醇，
1=325nm、 2=310nm、 3=334nm 异丙醇

39 第一节 维生素A的分析 3、测定方法： 第一法（直接测定法）： 适用于高纯度的 VitA醋酸酯 第二法（皂化法）：适用于 VitA醇
供试品中干扰测定的杂质较多；

40 第一节 维生素A的分析 4、百分标示量计算: 第一步：A选择，A测定或A校正 1 第二步：求 第三步：求效价

41 第一节 维生素A的分析 第四步：求标示量％ A*D*换算因数*W ＝ W*100*标示量 ×100％

42 第一节 维生素A的分析 生物效价及换算因数 （由纯品计算而得） 1）生物效价的定义 每克供试品中所含VA的国际单位数。 即IU/g表示.
1IU的全反式维生素A醇=0.300ug 1IU的全反式维生素A醋酸酯=0.344ug 1g维生素A醋酸酯相当的维生素A的国际单位数为 1g维生素醇相当的维生素A的国际单位数为

43 第一节 维生素A的分析 2）换算因数： （由纯品计算而得） 单位E％1cm数值所相当的效价数。 =1900 （维生素A醋酸酯）

44 第一节 维生素A的分析 =1830 （维生素A醇）

45 第一节 维生素A的分析 5、第一法 等波长差法 1）方法： 维生素A醋酸酯的含量 λ１ λ３ λ4 λ0 Ａ１ Ａ３ Ａ２ λ2 Ａ0 Ａ4

46 第一节 维生素A的分析 2）A值的选择 ①判断λmax是否在326～329nm之间 否 是 求算Ai/A328 并与规定值比较 改用第二法

47 第一节 维生素A的分析 ②求算Ai/A328并与规定值比较

48 第一节 维生素A的分析 a、无超过 b、有超过0.02 用A328计算 A328 第二法 第二法 3% －15% －3% f

49 例题： VitAD胶丸中VitA的含量测定
精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量 g/丸）的内容物 g 至250ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一20 ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度为 A300 ：0.354 A316 ：0.561 A328 ：0.628 A340 ：0.523 A360 ：0.216 A300 /A328 ：0.555 A316/A328 ：0.907 A328/A328 ：1.000 A340/A328 ：0.811 A360/A328 ：0.299 求本品中维生素A的含量？

50 第一节 维生素A的分析 + 0.01 －0.01 + 0.02 + 0.04 A300 /A328 ：0.564 A316/A328 ：0.893 A328/A328 ：1.000 A340/A328 ：0.833 A360/A328 ：0.344 － 0.555 0.907 1.000 0.811 0.299 =

51 第一节 维生素A的分析

52 第一节 维生素A的分析 6、第二法 等吸收比法 [ 皂化法、6/7A法 ] 适用于维生素A醇 第一法无法消除杂质干扰时用此法

53 第一节 维生素A的分析 1）方法： 脂溶性 水溶性

54 判断max是否在323～327nm之间，且A300/A325的比值≤0.73
下式判断 取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定

55 第一节 维生素A的分析 计算A325(校正) 3% －3%

56 第一节 维生素A的分析 小结： 第一法 第二法 测定对象 维生素A醋酸酯 维生素A醇 方法 直接取样，测定 皂化提取，测定 溶剂 环己烷
异丙醇 max 328 nm 325 nm 测定波长 5个 4个 换算因数 1900 1830

57 第一节 维生素A的分析 （二）三氯化锑比色法 标准曲线法→系列浓度→三氯化锑→5～10s→620nm→A 优点： 简便 快速
优点： 简便 快速 1、蓝色不稳定 （5 ~ 10s内）； 2、水分\醇干扰； 缺点： 3、-1℃ ≤标准曲线温差≤1℃ 显色强度 4、非专属性； 5、三氯化锑有腐蚀性；

58 第一节 维生素A的分析 （三）高效液相色谱法 色谱柱：C18柱 流动相：甲醇－水（96：4） 流 速:1.2ml/min
检测波长与AUFS:0min-8min(330nm,0.25AUFS)用于测定VA ; 8min后（292nm,0.05AUFS）用于测定VE 内 标：VA醋酸酯 工作曲线计算

59 小 结 杂质 维生素A1 去氢维生素A 去水维生素A 性质 维生素A 鉴别 Carr-price反应 UV TLC 含测 UV：三点校正
小 结 杂质 溶解性 稳定性 紫外 三氯化锑呈色 维生素A1 去氢维生素A 去水维生素A 性质 维生素A 鉴别 Carr-price反应 UV TLC 含测 UV：三点校正 三氯化锑比色； HPLC 测定原理 波长选择 测定方法 计算 A的选择 E 效价 标示量%

60 第二节 维生素B1的分析 VB1：盐酸硫胺 存在于动植物中，尤以酵母、米糠、麦麸和瘦肉中含量多，主要是化学合成。

61 第二节 维生素B1的分析 一、结构与性质 噻唑环 还原性 氨基嘧啶环 UV 碱性基团，可与酸成盐 氨基嘧啶环－CH2－噻唑环(季铵碱)

62 第二节 维生素B1的分析 性质及鉴别反应 1、性状 白色结晶或结晶性粉末；有微弱的臭味；味苦。
1、性状 白色结晶或结晶性粉末；有微弱的臭味；味苦。 迅速吸收4%水 2、溶解性 易溶于水；微溶于乙醇；不溶于乙醚。 3、酸性 水溶液呈酸性，在酸性溶液中稳定， 同时在碱性条件下，噻唑环破坏。 4、碱性 嘧啶环----噻唑环 5、UV μg/ml的盐酸溶液 λmax= E 406～436 6、氯化物特性

63 第二节 维生素B1的分析 7、与生物碱沉淀试剂的反应（鉴别） H+ H+ VitB1 H+ H+ 苦酮酸 [B] ·2

64 第二节 维生素B1的分析 8、硫色素反应VitB1的专属反应 （鉴别） + K3Fe(CN)6 硫色素（蓝色荧光） 正丁醇 λem435nm
NaOH 环合 环合 ［Ｏ］ K3Fe(CN)6 λem435nm λex365nm 硫色素（蓝色荧光） 正丁醇

65 第二节 维生素B1的分析 含量测定 硫色素荧光法 激发波长365nm 发射波长435nm 方法与计算 适用于原料和制剂 （1）氧化剂的制备
新鲜的1.0%铁氰化钾溶液4→100（3.5mol/LNaOH） （2）对照液的制备 25mg →300ml稀醇→3mol/L盐酸溶液→pH4 →至1000ml稀醇→0.2μg/ml溶液（ 0.2mol/L盐酸 ）

66 第二节 维生素B1的分析 + 铁氰化钾(1~2s)+ 异丁醇(30s内) + NaOH + 异丁醇 对照液 +铁氰化钾 + 异丁醇
（3）供试液的制备 适量 → 100μg/ml溶液（0.2mol/L盐酸溶液）→5ml→0.2μg/ml溶液（ 0.2mol/L盐酸 ） （4）测定 + 铁氰化钾(1~2s)+ 异丁醇(30s内) + NaOH + 异丁醇 S 对照液 d +铁氰化钾 + 异丁醇 + NaOH + 异丁醇 供试液 分离有机层 A b 特点 ①灵敏度高，线性范围宽，操作繁琐，测定 受干扰因素较多。 ②溴化氰、氯化汞。

67 第二节 维生素B1的分析 二、鉴别试验 1.硫色素反应 2.生物碱沉淀反应 3.与硝酸铅的反应 Vit B+NaOH→Na2S→PdS↓
4.氯化物反应

68 三、含量测定 原料 Assay Non-aqueous 片剂、注射液 Titrimetry Vit B1 含量＝? 原料及制剂 非水滴定法
冰HAc和Hg(Ac)2 HClO4滴定 1 Non-aqueous Titrimetry Assay 片剂、注射液 2 Vit B1 含量＝? UV法 (max 246nm) 3 Thiochrone Fluoremetry 硫色素荧光法 (VB1专属反应) 原料及制剂

69 第二节 维生素B1的分析 （一）非水溶液滴定法（原料药） 1、原理 ChP 喹那啶红-亚甲蓝混合指示液 （紫红→天蓝） 2、计算

70 第二节 维生素B1的分析 3、方法 取本品0.15g→100ml具塞锥形瓶中加冰醋酸20ml→微热→溶解→防冷→醋酸汞5ml→喹那啶红－亚甲蓝2d→高氯酸(0.1mol/L)滴定。由紫红→天蓝T=16.86mg/ml。 4、注意 （1）有机碱的氢卤酸盐在用高氯酸滴定前，须加醋酸汞溶液。 （2）维生素B1：高氯酸=1：2

71 第二节 维生素B1的分析 （二）紫外－可见分光光度法（维生素Ｂ1片剂）
取本品20片→精密称取适量（约相当于维生素 Ｂ1 25mg）→100ml 量瓶中→盐酸溶液(9→1000) 约70ml→振摇15分钟→加盐酸溶液(9→1000) 稀释至刻度→摇匀→用干燥滤纸滤过→精密量取续滤液5ml→置另一100ml量瓶中→盐酸溶液(9→1000) 定容→摇匀→246nm 的波长处测定吸收度，按C12H17ClN4OS.HCl的吸收系数为 421计算，即得。

72 第二节 维生素B1的分析 维生素Ｂ1注射剂 精密量取本品适量（约相当于维生素 Ｂ1 50mg），置200ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml， 置100ml量瓶中，加盐酸溶液(9→1000)稀释至刻度，摇匀，照分光光度法在246nm 的波长处测定吸收度，按C12H17ClN4OS.HCl的吸收系数为 421计算，即得。 注意：pH= nm pH= ~233nm ; nm 255

73 第三节 维生素C的分析 L（+）－抗坏血酸 广泛存在于蔬菜和鲜水果中，尤以柑、桔、鲜枣、番茄中含量丰富。
参与体内多种代谢过程、帮助酶将胆固醇转化为胆酸排泄，减少毛细血管的脆性，增加机体抵抗能力，用于坏血病的预防和治疗。

74 第三节 维生素C的分析 一、结构与性质 两个手性碳原子，有四个光学异构体 L（+）－抗坏血酸（活性最高） D（-）－异抗坏血酸（为前者5%）
烯二醇强还原性 弱酸性（一元酸）

75 第三节 维生素C的分析 性质 1、性状 白色结晶或结晶性粉末；无臭，味酸；久 置色渐变微黄，水溶液显酸性。
1、性状 白色结晶或结晶性粉末；无臭，味酸；久 置色渐变微黄，水溶液显酸性。 2、溶解性 易溶于水；略溶于乙醇；不溶于氯仿和 乙醚。 3、旋光性 比旋度+20.50°～21.50°

76 第三节 维生素C的分析 4、酸性 烯二醇结构 由于共轭效应的影响 C3－OH pKa = 4.17 C2－OH pKa = 11.5
VC表现为一元酸，可 与NaHCO3生成钠盐 烯二醇结构

77 第三节 维生素C的分析 5、水解性 Ｎa2CO3 ＮaOH 酮酸盐

78 第三节 维生素C的分析 6、强还原性 烯二醇结构 Ｌ－抗坏血酸 （有生物活性） Ｌ－去氢抗坏血酸 （有生物活性） Ｌ－二酮古洛糖酸
－2H ＯＨ-（Ｈ＋） ＋2H Ｌ－抗坏血酸 （有生物活性） Ｌ－去氢抗坏血酸 （有生物活性） Ｌ－二酮古洛糖酸 （无生物活性）

79 第三节 维生素C的分析 7、糖的性质 50℃ 8、紫外吸收特性 243 中性或

80 第三节 维生素C的分析 二、鉴别试验 1、氧化反应 （１）与AgNO3反应

81 第三节 维生素C的分析 （２）与2，6 - 二氯靛酚反应 H+ + + 无色

82 第三节 维生素C的分析 2、与其他氧化剂反应 3、紫外分光光度法 （1）与碱性酒石酸铜反应 （2）与KMnO4反应 HCl 亚甲蓝、磷钼酸
BP HCl

83 第三节 维生素C的分析 4、糖类的反应 糠醛——吡啶反应 50℃ 蓝色 H2O -3H2O 糠醛 -CO2 戊糖 H+

84 第三节 维生素C的分析 杂质检查 （一） 溶液的澄清度与颜色检查 1、原料药：3.0g，水15ml，振摇溶解→澄清无色；
显色→4号垂熔玻璃漏斗→ 420nm测定吸光度≤0.03 。 2、片剂：取片粉适量（相当于1.0g） →水20ml溶解→滤过→ 440nm→吸收度≤ 0.07。 3、注射液：取本品适量→水→ 50mg/ml的溶液→ 420nm →吸收度≤ 0.06。

85 第三节 维生素C的分析 （二）铁和铜离子的检查 a 原料药 b 合格 b ＜ a- b 原子吸收光谱法 供试品 + 标准溶液 供试品
248.3nm 合格 b ＜ a- b 1、供试品溶液：5.0g→25ml(0.1mol/L硝酸溶液)； 2、对照溶液：5.0g+标准铁溶液1.0ml →25ml(0.1mol/L硝酸溶液). 3、标准铁溶液：863mg硫酸铁铵+25ml1mol/L硫酸溶液→ 1000ml(水) →10ml →100ml（水）。

86 三 、含量测定 碘量法 (直接滴定法) VC含量=? HPLC法 2,6-二氯靛酚滴定法

87 第三节 维生素C的分析 （一）碘量法 1、原理 Ｈ＋ ＋ＨＩ ＋Ｉ２

88 第三节 维生素C的分析 2、测定方法 取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.１mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.１mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6 空白试验

89 第三节 维生素C的分析 3、注意 1、酸性环境 减慢VitC被O2氧化速度 2、新沸冷H2O 3、立即滴定
4、注射剂测定时注意 消除辅料的干扰 NaHSO3 + CH3COCH3

90 第三节 维生素C的分析 (二) 2，6 - 二氯靛酚滴定法 H+ + 红色 + 无色

91 方法： 维生素C注射剂 一定体积的注射液（约50mg）→偏磷酸-醋酸20ml→水定容100ml→精明量取约含2mg维C→偏磷酸-醋酸5ml →2，6-二氯靛酚→玫瑰红色→5s不褪色 空白：偏磷酸-醋酸5.5ml →水15ml → 2，6-二氯靛酚→玫瑰红色→5s不褪色 计算

92 第三节 维生素C的分析 讨论 缺点 酸性环境 HPO3-HAc中VitC稳定 不稳定 （定量过量） （测剩余染料） 需经常标定 贮存≤一周
快速滴定 防止其他干扰物质影响（2min内） 剩余比色测定 （定量过量） （测剩余染料） 需经常标定 缺点 不稳定 贮存≤一周 缓缓分解

93 第三节 维生素C的分析 （三）高效液相色谱法 血浆中维生素C的测定
标准溶液包括样品预处理过程均需加入偏磷酸，偏磷酸同时可用于血样中的蛋白沉淀；当天取血当天测定；处理好的样品亦需冰箱保存

94 第四节 维生素D的分析 维生素D是一类抗佝偻病维生素的总称。目前已知的维生素D类物质至少有十种之多，它们都是甾醇的衍生物。中国药典主要收载有维生素D2、D3原料药；维生素D2胶丸和注射剂；维生素D3注射剂。USP(24)收载有片剂、胶囊、口服液等剂型。BP(2000)收载的剂型有片剂、口服液、注射液以及钙与维生素D2、D3制成的复方片剂。

95

96 第四节 维生素D的分析 一、结构与性质 （一）结构 维生素 D2(麦角骨化醇) 维生素D3(胆骨化醇)

97 第四节 维生素D的分析 （二）性质 1.性状 无色针状结晶或白色结晶性粉 末；无臭，无味。 2.溶解性 三氯甲烷，乙醇、丙酮、乙醚；在
1.性状 无色针状结晶或白色结晶性粉 末；无臭，无味。 2.溶解性 三氯甲烷，乙醇、丙酮、乙醚；在 植物油中略溶，在水中不溶。 3.不稳定性 含有多个烯键，光、空气及 氧化剂、酸。

98 第四节 维生素D的分析 4．旋光性 维生素D2 6个手性碳原子 维生素D3 5个手性碳原子 5．显色反应 甾类化合物
5．显色反应 甾类化合物 氯仿溶液 黄色 红色 紫色 绿色 6．紫外吸收特性 无水乙醇 nm 维生素D2 为460－490 维生素D3 为465－495 醋酐 浓硫酸 E 1% 1cm E 1% 1cm

99 第四节 维生素D的分析 二、鉴别试验 （一）显色反应 1．与醋酐-浓硫酸反应 氯仿溶液 黄色 红色 紫色 绿色 2．与三氯化锑反应 本品
氯仿溶液 黄色 红色 紫色 绿色 2．与三氯化锑反应 1,2-二氯乙烷 三氯化锑试液 本品 橙红色 粉红色 CHCl3

100 第四节 维生素D的分析 3．其它显色反应 维生素D 橙黄色 绿色 （二）比旋度鉴别 无水乙醇溶液 维生素D2
三氯化铁 维生素D 橙黄色 二氯丙醇 乙酰氯 绿色 （二）比旋度鉴别 无水乙醇溶液 维生素D2 比旋度为＋102.5°至＋107.5° 维生素D3 比旋度为＋105°至＋112°

101 第四节 维生素D的分析 薄层色谱法、HPLC法 制备衍生物测熔点 紫外、红外吸收光谱 （四）维生素D2、D3的区别反应 （三）其它鉴别方法
红色λmax570nm 维生素D2 乙醇1ml 和85%硫酸5ml 96%乙醇 取0.1ml 维生素D3 黄色 λmax495nm 10ml

102 第四节 维生素D的分析 三、杂质检查 （一）Vit D2中麦角甾醇的检查 维生素D210mg, 洋地黄皂苷溶液 90%乙醇溶液 18h
不得发生浑浊或沉淀 2ml

103 维生素D2和D3的合成

104 （二）前维生素D的光照产物

105 第四节 维生素D的分析 四、含量测定 正相高效液相色谱法 （一）维生素D测定法 含量以国际单位表示---IU
每单位相当于维生素D 0.025μg 注意：计算的是维生素D及前维生素D经折 算成维生素D的总量

106 第四节 维生素D的分析 第一法：无干扰杂质 第二法：有VA及其他杂质干扰 第三法：用第二法时，前 VD峰受杂质干扰 仅VD峰可分离
在半暗室及避免氧化

107 第四节 维生素D的分析 第一法 无干扰杂质 内标物：邻苯二甲酸二甲酯 色谱条件及系统适用性试验： 填充剂：硅胶
流动相：正己烷-正戊醇（997：3） 检测波长：254nm

108 第四节 维生素D的分析 系统适用性试验 维生素D3 ＞1.0 ＞1.0 先后进样5次，维生素D3 峰面积的 RSD≤2.0 % 溶液组成
分离度 前维生素D3 反式维生素D3 维生素D3 速甾醇D3 维生素D3 0.5 0.6 1.0 1.1 ＞1.0　 △ 光照 ＞1.0 先后进样5次，维生素D3 峰面积的 RSD≤2.0 %

109 第四节 维生素D的分析 维生素D3处理： D3对照液5ml→具塞容器→氮气→90℃1h →迅速冷却→正己烷5ml →1cm石英吸收池→45度→2个8W主波254nm\365nm 照射5min →距灯管5～6厘米

110 第四节 维生素D的分析 校正因子测定： 对照品储备液/内标溶液→各5ml→50ml(正己烷) →HPLC
维生素D的校正因子: f1=Asmi/Aims 对照品储备液5ml+2,6-二叔丁基对甲酚结晶1粒 →通氮气 → 密塞 →90℃水浴1.5h →迅速冷却→内标溶液5ml →定容50ml(正己烷) →HPLC 前维生素D折算成维生素D的校正因子: f2=（Asmr-f1msAr1）/（Ar2ms） 含量测定：计算维生素D及前维生素D折算成维生素D的总量 mi=（f1Ai1+f2Ai2）ms/As

111 第四节 维生素D的分析 第二法 有VA及其他杂质干扰 第一步：皂化提取 供试品 乙醚提取液 残渣 供试溶液A OH- 加热回流 冷却
挥干乙醚 残渣 甲醇溶解 供试溶液A

112 第四节 维生素D的分析 （1）皂化提取： 约Vit D总量600IU以上，重量≤2.0g→皂化瓶→乙醇30ml+抗坏血酸0.2g+50%氢氧化钾3ml→回流30min→冷却→10ml水冲洗回流管内壁→分液漏斗→洗涤皂化瓶(60~100ml) →洗液并入分液漏斗→不含过氧化物的乙醚提取3次（第一次60ml→每次40ml）→水洗数次（每次100ml）→水层遇酚酞不显红色→分取乙醚层→干燥滤纸条除水→水浴蒸发至5ml→氮气吹干→甲醇3ml→离心→取上清液备用→供试溶液A

113 第四节 维生素D的分析 第二步：分离收集 供试品溶液A 供试品溶液B 维生素D 前维生素D 维生素A及其他杂质 叠峰 分离
内标的正己烷溶液 RP-HPLC 分离 收集 挥干 溶解 维生素D及前维生素D 第三步：按第一法进行含量测定（内标法）

114 第一法 内标法含量测定 （2）净化色谱分离收集维生素D
上述供试溶液A 500μl→C18色谱柱→甲醇-乙腈-水（50:50:2）→254nm→收集维生素D及前维生素D的全部流出液→圆底烧瓶→氮气吹干→内标溶液→超声助溶→供试品溶液 第一法 内标法含量测定

115 第三法 第一步：皂化提取 同第二法得供试品溶液A 第二步： 供试品溶液A 维生素D 前维生素D 维生素A及其他杂质 叠峰 分离 供试品溶液C
用第二法时，前 VD峰受杂质干扰 第一步：皂化提取 同第二法得供试品溶液A 前维生素D 维生素D 第二步： 对照溶液 供试品溶液A 维生素D 前维生素D 维生素A及其他杂质 叠峰 分离 RP-HPLC 收集 异辛烷溶解 90℃、1.5h 挥干 挥干 正己烷溶解 供试品溶液C 第三步：用第一法色谱条件按外标法计算含量

116 前维生素D的光照产物

117 注意： 1、硅胶为填充剂。正己烷-正戊醇（997：3）为流动性，正相色谱。检测波长254nm. 2、测定在半暗室，必要通惰性气体，使用棕色玻璃容器。 3、皂化过程极为复杂，测定结果可能偏低。 苯→VD 己烷或戊烷 4、供试品中无维生素A醇及其他杂质干扰，可直接进样测定。

118 第五节 维生素E的分析 Vitamin E 与生育有关，防治习惯性流产、不育症、牙周炎等；也用于心血管疾患、脂肪肝，新生儿硬肿症的辅助治疗。
存在于豆类、 蔬菜、麦胚油中 有还原性， 可作抗氧剂 与生育有关，防治习惯性流产、不育症、牙周炎等；也用于心血管疾患、脂肪肝，新生儿硬肿症的辅助治疗。

119 第五节 维生素E的分析 * * * 一、结构与性质 二氢吡喃 苯 VE是苯并二氢吡喃衍生物， 苯环上有一个乙酰化的 酚羟基，故又称生育酚 1
1’ 3’ 5’ 7’ 9’ 11’ 8 8 8 13’ 7 7 * * * 5 4 二氢吡喃 苯

120 第五节 维生素E的分析 * * * 醋酸酯 名 称 R1 R2 相对活性 α-生育酚 β-生育酚 γ -生育酚 δ -生育酚 CH3 H
化学名：（±）-2,5,7,8-四甲基-2-(4,8,12-三甲基十三烷基)-6-苯并二氢吡喃醇醋酸酯 醋酸酯 名 称 R1 R2 相对活性 α-生育酚 β-生育酚 γ -生育酚 δ -生育酚 CH3 H 1.0 0.5 0.2 0.1

121 第五节 维生素E的分析 定 义 生物效价 右旋体 ： 消旋体 = 1.4 ：10 （合成品） （天然品） 药 典 VE 《中国药典》
右旋体 ： 消旋体 = 1.4 ：10 一般药用品为合成品，即消旋体 （合成品） （天然品） 主要存在于植物中，麦芽油、花生油、玉米油中含量最为丰富。 定 义 药 典 VE 《中国药典》 人工合成的消旋α-生育酚醋酸酯 《美国药典》 右旋或消旋α-生育酚及其醋酸酯和琥珀酸酯 《英国药典》《日本药典》 消旋α-生育酚醋酸酯和α-生育酚

122 第五节 维生素E的分析 性质 苯环 + 二氢吡喃环 + 饱和烃链 1、性状 微黄色至黄色或黄绿色澄清的 粘稠液体;遇光色渐变深。
1、性状 微黄色至黄色或黄绿色澄清的 粘稠液体;遇光色渐变深。 2、溶解性 无水乙醇、丙酮、乙醚、石油醚， 不溶于水。 3、紫外吸收特性 无水乙醇λmax=284nm E1%1cm为41.0～45.0

123 第五节 维生素E的分析 4、酯键 易水解（H+、OH-） 加热至200℃也未被破坏，遇光、空气可被氧化。 5、易氧化 O2 △ [o]

124 第五节 维生素E的分析 二、鉴别试验 1、硝酸反应 75℃15min HNO3 75℃ 15′ 橙红色

125 第五节 维生素E的分析 2、三氯化铁－联吡啶反应 △ [O]

126 第五节 维生素E的分析 生育酚 Fe3+ [O] 对-生育醌 红色

127 第五节 维生素E的分析 3、紫外光谱法 4、薄层色谱法 λmax284nm λmin254nm 5、其他方法： 硅胶G板
0.01%的无水乙醇 λmax284nm λmin254nm 4、薄层色谱法 5、其他方法： GC和IR 硅胶G板 展开剂：环己烷-乙醚（4：1）→10~15cm→晾干 显色剂：浓硫酸喷雾，105℃加热5min 结果： Rf α-生育酚=0.5 Rf α-生育酚醋酸酯=0.7 Rf α-生育醌=0.9

128 第五节 维生素E的分析 （三）杂质检查 醋酸+α-生育酚 1、酸度
乙醇15ml+乙醚15ml→酚酞指示液0.5ml←氢氧化钠(0.1mol/L)滴定→微显粉红色←本品1.0g←氢氧化钠(0.1mol/L) 滴定≤0.5ml

129 第五节 维生素E的分析 2、生育酚 原理：利用游离生育酚的还原性，将硫酸铈还原成 硫酸亚铈。 滴定液：硫酸铈滴定液（0.01mol/L）
指示剂：二苯胺（亮黄→灰紫） 试剂

130 方法： 0.10g→5ml无水乙醇→二苯胺1d→硫酸铈滴定液（0.01mol/L）＜1.0ml 计算： Ch.p 规定： 每1ml硫酸铈滴定液（0.01mol/L）相当于 g的游离生育酚。 限度：L(%)=TV/S×100%=2.15%

131 第五节 维生素E的分析 四、含量测定 （一） GC法 1、 GC特点 选择性好 灵敏度高 速度快 分离效能好

132 第五节 维生素E的分析 2、VitE测定的色谱条件 载气→N2 固定液→硅酮（OV-17） 担体→硅藻土或高分子多孔小球 柱温→265℃
内标加校正因子法 载气→N2 固定液→硅酮（OV-17） 担体→硅藻土或高分子多孔小球 柱温→265℃ 检测器→氢火焰离子化检测器(FID) 内标→正三十二烷 n ≥ 500 R≥2 内标法加校正因子定量

133 第五节 维生素E的分析 校正因子的测定： 内标溶液：正三十二烷适量→1.0mg/ml（正己烷）
对照品+内标：维E20mg→内标10ml→1～3μl注入 样品测定： 样品+内标：20mg→ 内标10ml→1～3μl注入

134 第五节 维生素E的分析 （二）RP - HPLC法（外标一点法） 供试品中Vit E的量（mg）=mr×Hr/Hx JP
供试品溶液( dl－α－生育酚)→0.05g →50ml(无水乙醇) 对照品溶液： dl－α－生育酚→0.05g →50ml(无水乙醇) 固定相→十八烷基硅烷键合硅胶 流动相→甲醇-水（49 ：1） 检测波长→292nm R＞2.6 (生育酚与醋酸生育酚) RSD≤0.8% 供试品中Vit E的量（mg）=mr×Hr/Hx

135 （三）荧光分光光度法 337nm △λ40nm，200～400nm

136 第五节 维生素E的分析 CE= F样品 - F空白 F标准 4.0（mg/L) 人体血样中维生素E的测定 对照品→ dl－α－生育酚
方法： U血清 S对照品 B水 0.1ml→水0.1ml→0.4ml无水乙醇→混匀30s→正己烷2.0ml→ 60s → 离心2min → △λ40nm，200～400nm → 337nm CE= F样品 - F空白 F标准 4.0（mg/L)

137 第六节 复方制剂中多种维生素的分析 一、离子对HPLC法测定多种维生素 以樟脑磺酸作为离子对试剂，以二巯基丙烷磺酸钠作为抗氧剂
第六节 复方制剂中多种维生素的分析 一、离子对HPLC法测定多种维生素 以樟脑磺酸作为离子对试剂，以二巯基丙烷磺酸钠作为抗氧剂 二、反相HPLC法同时测定9种水溶性维生素 三、非水反相HPLC法同时测定4种脂溶性维生素

138 本 章 小 结 1、VitA：掌握三氯化锑鉴别反应的原理、 UV法(三 波长法)含量测定的原理及两者的区别。
本 章 小 结 1、VitA：掌握三氯化锑鉴别反应的原理、 UV法(三 波长法)含量测定的原理及两者的区别。 2、 VitB1：掌握硫色素反应原理。 3、 VitC：掌握其结构特征（还原性）、碘量法含量 测定的原理及操作注意事项。 4、VitE：掌握硝酸反应的原理。

139 Thank You !