Flow cytometry在研究上的應用

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1 Flow cytometry在研究上的應用
鍾景光 教授 中國醫藥大學 生物科技學系 08/04/ /18/2011

2 Research Methodology of Biotechnology
科 目 名 稱 中 文 生物科技研究方法 修習別 選修（暑期第 2 期） 100年8月4日～9月1日 學分數 2 英 Research Methodology of Biotechnology 任課教師（職級） 鍾景光教授等 課程屬性 通識醫藥領域 授課時間 星期 二 節次 1-4 四 限修條件 無 授課地點 立夫教學大樓204教室 週 次 日期 內 容 任 課 教 師 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 8月4日(四) 8月9日(二) 8月11日(四) 8月16日(二) 8月18日(四) 8月23日(二) 8月25日(四) 8月30日(二) 9月1日(四) 1-2節 3-4節 生物科技研究方法課程介紹 流式細胞計數儀在研究上的應用（一） 動物實驗研究方法 心血管研究方法 色層分析 奈米在生技研究的應用 蛋白質相關的研究方法 天然藥物的研究方法 生物資訊的研究方法 流式細胞計數儀在研究上的應用（二） DNA晶片 基因治療的研究方法 藥物抗癌的研究方法（一） 藥物抗癌的研究方法（二） DNA repair的研究方法（一） DNA repair的研究方法（二） 微生物遺傳的研究方法 課程檢討及考試 鍾景光 李守倫 郭薇雯 周聖杰 林宥欣 黃耀德 翁靖如 鄭志鴻 林如華 高銘欽 楊家欣 蔡士彰 徐媛曼

3 美國科研人員聲稱人工「製造生命」 人工合成細胞被視為生物科學研究的一個里程碑 文特博士所帶領的研究小組，曾成功人工合成細菌基因
也曾成功將細菌基因移植到新的細胞 最新的研究成功則是以上兩項研究的集成。他們所合成的人工細胞已經分裂了超過 10次，每次分裂所產生的新細胞也都仍然由最初的人工合成的染色體所控制。 這項新成果被視為科學征服自然的新的裏程碑，不過也有人擔心人工製造組織可能 產生危險。科研人員希望最終可以設計細菌細胞以製造有生命的機器或者燃料、治 療疾病甚至吸收溫室氣體

4 首例“人造細胞”問世 中科院專家:人造生命離我們還遠
科學家克雷格‧文特爾（Craig Venter）表示，他們合成了全新的基因組，將其植入一個內 部被掏空遺傳物質的單細胞細菌（山羊支原體），使這個受體細菌“起死回生”,並開始在實 驗室的培養皿中繁殖。 此次科研成果只是理論上的突破，證明了體外合成基因組是可能的 對“人造生命”來說，合成了基因組固然重要，但製造合適的細胞環境更為關鍵，也更難。 “人造生命”遭遇的難題和克隆生物、試管嬰兒等技術所遭遇的瓶頸是一樣的。 科學家選取名為絲狀支原體的細菌，將它的染色體 解碼，利用化學方法重新排列DNA。 2. 將重組的DNA碎片放入酵母液中，令其慢慢地重 新聚合。 3. 將人造DNA放入另一個受體細菌中。通過生長和 分離，受體細菌產生兩個細胞，一個帶有人造 DNA，一個帶有天然DNA。 4. 培養皿中的抗生素將帶有天然DNA的細胞殺死， 只留下人造細胞不斷增生。 5. 幾個小時之內，受體細菌內原有DNA的所有痕跡 全部消失，人造細胞不斷繁殖。 人民日報

5 首例人造細菌-- 可吸廢氣救地球專家憂變生化武器
美國生物學者文特 （Craig Venter）的團隊 成功以人造DNA（去氧核糖核酸）培養出活 生生、可自動繁殖的細胞，造出全球首見的 人造微生物 他稱此技術未來可用於發展環保能源、或吸 收大氣層中的溫室廢氣、清除油污，也可應 用在食品業或製造新疫苗。 學術界不乏反對聲浪，擔憂實驗失誤會造出 可怕的超級病菌，釀成大禍。 實驗過程9月播出Discovery頻道過去5年來長 期記錄文特研究所的實驗過程，製成電視專 題節目。 2010年05月22日蘋果日報

6 藻類變燃料 --人工細胞能辦到 研究團隊表示： 最初的一步只是再造現有的生命， 即把一種簡單形式的細菌轉變成另
一種，不是從無中生有的人工細胞。 文特的目標是創造有機物，使它們有 更多用途。他目前正與艾克森美孚公 司合作，希望把藻類變成燃料。 這項研究刊登於廿一日上市的「科 學」（Science）期刊。

7 流式細胞儀 (Flow cytometry)
流式細胞儀可提供快速、精準、客觀的診斷數據。 目前已成為臨床免疫、血液及腫瘤學上重要的診斷工具。 由於該類型的儀器設備硬體、軟體的不斷更新，以及使用新的檢驗方法與試劑(例如：單一激光可同時偵測四螢光，No-wash sample prep等等)，迅速發展出許多新的基礎與臨床之應用。

8 流式細胞分析法之應用範圍，可依螢光性質分為：單、雙、或三色分析(單一雷射即可達成)，配合第二、三雷射可達到四色及五色分析：若依觀察目標物所在，則可分列五個層級之分析應用：
A. 細胞表面抗原之分析：例如使用各種CD markers來做immunophenotyping, 及subset analysis B. 細胞膜內物質之分析：例如intracellular pH, Ca2+ influx, mitochondria membrane potential, enzyme activity。 C. 細胞核內分子之分析：DNA content analysis (diploidy, cell cycle, apoptosis), RNA content analysis. D.細胞的 function: Macrophagues的Phagocytosis; NK cells的Cytotoxicity E.細胞的secretions: IL, cytokines

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10 Detect DNA damage or Comet assay
Viability and cell cycle analysis

11 Calcium analysis ROS analysis

12 Flow Cytometry 研究上的應用 Analysis of blood cells by flow cytometry
The use of flow cytometry to detect intracellular cytokine production in individual cells Detection of intracellular/intranuclear antigens Detection of intracellular/intranuclear antigens in tumor cells Detection of Cyclins in individual cells by flow and laser scanning cytometry Estimation of cell viability by flow cytometry Analysis of apoptosis by flow cytometry Cell cycle analysis Estimation of drug resistance by flow cytometry Clinical diagnostics used in flow cytometry Immune responses

13 CD Markers or Cell Receptors
ROS Caspase-3,-8,-9 Cytokine Cyclin p53 DNA/RNA (DNA damage/Apoptosis) Ca2+ Mitochondria membrane potential (MMP)

14 FCM/Laser/Fluorescence 原理
Semiconductor Laser Flow Cell Laser beam: 633nm CELLPACK CELLPACK Sample

15 側散亂光(SSC) 細胞內顆粒、結構複雜性 前散亂光(FSC) 細胞大小 側螢光(SFL) DNA / RNA 資訊

16 Analysis of blood cells by flow cytometry
1.Hematopoetic Progenitor Cell 偵測 應用-PBSCT 2.Reticulocyte, Maturity Index (HFR,MFR,LFR,IRF) 應用-EPO治療的監控 -Erythropoiesis 的評估 -Thalassemia -BMT Recovery 評估 -放/化療後的監控 3.RDW-SD, RDW-CV 應用-Thalassemia與IDA的區分

17 DIFF Scattergram DNA / RNA 含量 內容物結構