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第十一章 细胞增殖及其调控 ●细胞增殖(cell proliferation)的意义 ●细胞周期与细胞分裂 ●细胞周期调控
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细胞增殖(cell proliferation)的意义
◆对单细胞生物，导致生物个体数量增加；对多 细胞生物，是繁殖的基础 ◆成体生物中取代衰老死亡细胞， 维持个体细胞 数量的相对平衡和机体的正常功能 ◆机体创伤愈合、组织再生、病理组织修复
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第一节 细胞周期与细胞分裂 ●细胞周期(cell cycle)概述 ●有丝分裂(mitosis) ●胞质分裂(Cytokinesis)
第一节 细胞周期与细胞分裂 ●细胞周期(cell cycle)概述 ●有丝分裂(mitosis) ●胞质分裂(Cytokinesis) ●减数分裂(Meiosis)
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一、细胞周期(cell cycle)概述 ●细胞周期 ●细胞周期中各个不同时相及其主要事件 ●细胞周期长短测定 ●细胞周期同步化
●特异的细胞周期
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细胞周期 ◆概念： 细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分完成所经历的一个有序过程。其间细胞遗传物质和其他内含物分配给子细胞。
◆细胞周期时相组成 ◆细胞周期时间 ◆据增殖状况，细胞分三类
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细胞周期概述 细胞物质积累与细胞分裂的循环过程，为细胞周期 但积累不仅在量，而在质
从一次细胞分裂结束开始，经过物质积累过程，直到下一次细胞分裂结束为止，称为一个细胞周期。是一个细胞的生命过程，即由一个老细胞变成了两个新细胞。又称细胞生活周期或细胞繁殖周期 分裂期和分裂间期 20th50放射自显影技术：G1，S，G2，M
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细胞周期时相组成 间期(interphase): G1 phase，S phase，G2 phase M phase:
有丝分裂期(Mitosis), 胞质分裂期(Cytokinesis) 细胞沿着G1→S→G2→M→G1周期性运转，在间期细胞体积增大(生长)，在 M 期细胞 先是核分裂，接着胞质分裂，完成一个细胞周期。
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细胞周期时间 不同细胞的细胞周期时间差异很大 S+G2+M 的时间变化教小，细胞周 期时间长短主要差别在G1期
有些分裂增殖的细胞缺乏G1、G2期
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据增殖状况，细胞分三类 连续分裂细胞(cycling cell) 休眠细胞(Go细胞) 终末分化细胞
分，有的细胞过去认为属于终末分化细胞，目前 可能被认为是Go期细胞
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细胞周期中不同时相及其主要事件 ◆ G1期 ◆ S 期 ◆ G2期 ◆ M 期
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G1期 ·与DNA合成启动相关，开始合成细胞生 长所需要的多种蛋白质、RNA、碳水化 合物、脂等，同时染色质去凝集
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G2期 DNA复制完成，在G2期合成一定数量的蛋白质和RNA分子
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M 期 M期即细胞分裂期，真核细胞的细胞分裂主要包括两种方式，即有丝分裂(mitosis)和减数分裂(meiosis)。遗传物质和细胞内其他物质分配给子细胞
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S期 ·DNA复制与组蛋白合成，同步， 组成核小体串珠结构 ·S期DNA合成不同步
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细胞周期各不同时期及其主要事件 限制点(R点)，起始点，或检验点：最早来源于E.coli复制调控
当DNA受损或复制受抑制时，激活RecA蛋白酶解LexA 诱导SOS基因表达 导致受损DNA修复，细胞分裂停止等，但其根本原因不在于DNA受损或复制未完成，而在于细胞内存在一系列监控机制(检验点)
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细胞周期长短测定 ◆脉冲标记DNA复制和细胞分裂指数观察测定法 ◆流式细胞仪测定法(Flow Cytometry)
◆缩时摄像技术，可以得到准确的细胞周期时间及分裂间期和分裂期的准确时间。
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细胞周期长短测定 脉冲标记DNA复制和细胞分裂指数观察测定法
3H-TdR，数分钟至半小时后，洗脱，换新鲜培养基培养，隔半小时或一小时定期取样，放射自显影 S期标记细胞进入M期， S期最晚期细胞首先进入M期，所以从更换培养液—被标记M期细胞开始出现为止，经历时间为G2期时间；从被标记的M期细胞占M期细胞总数比例到最大值时，经历时间为M期时间；从被标记M期细胞数占M期细胞总数50%开始，经历最大值，再下降到50%经历的时间为S期时间；从被标记M期细胞开始出现、消失，到被标记细胞M期细胞再次出现，为一个细胞周期总时间Tc，计算得TG1期=Tc-TG2-TS-TM
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脉冲标记法缺点 设备要求高 实验操作也需格外小心 放射性同位素有一定干扰
BrdU取代3H-TdR，被标记细胞用抗BrdU抗体免疫染色 细胞群体组成复杂，细胞不同步时，很难得到正确结果
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流式细胞分选仪测定法 逐个分析细胞或颗粒某个参数，也可结合各种细胞标记技术，同时分析多个参数，也可分拣群体中某个细胞
在细胞周期研究中广泛应用。在G1-G2/M期，DNA量恒定，S期介于2n和4n之间
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细胞周期同步化 ◆自然同步化，如有一种粘菌的变形体plasmodia， 某些受精卵早期卵裂 ◆人工选择同步化 ◆药物诱导法
◆条件依赖性突变株在细胞周期同步化中的应用： 将与细胞周期调控有关的条件依赖性突变株转移 到限定条件下培养，所有细胞便被同步化在细胞 周期中某一特定时期。
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细胞周期同步化 自然同步化：粘菌 人工同步化
处于对数期单层培养细胞，分裂活跃会使细胞变圆，从瓶壁上隆起，轻摇，悬浮到培养液，离心，可得到一定数量的分裂期细胞。未经任何药物处理，未受任何伤害，真实反映细胞周期，同步化效率高，但分离的细胞数少 密度梯度离心法：裂殖酵母，不同时期细胞的体积重量有差别，该法简单、省时，高效，低成本，但对大多数种类的细胞不适用
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诱导同步化 DNA合成阻断法 用低毒或无毒DNA合成抑制剂，特异抑制DNA合成，而不影响处于其他时期的细胞的细胞周期运转，从而将被抑制细胞抑制在DNA合成期的实验方法 培养液中加过量TdR(2.5mmol/L)使[dTTP]、[dATP]、[dGTP]特别使[dTTP]升高25倍，高[dTTP]反馈抑制二磷酸核苷酸还原酶活性，使CDP不能合成dCDP 由于 缺少dCTP使DNA合成不能进行 TdR和羟基脲(HU)G1/S交界处狭窄时间区段，2次使用，同步化效率高
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诱导同步化 分裂中期阻断法 用秋水仙素、秋水仙胺和nocodazole，抑制微管聚合，有效抑制细胞分裂器形成，将细胞阻断在细胞分裂中期，处于间期细胞受药物影响相对较小，继续运转，同前法轻摇，将变圆的分裂期细胞摇脱，离心，可得到大量分裂中期细胞。操作简便，效率高，但药物毒性相对较大 条件依赖性突变株在细胞周期同步化中的应用
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特异的细胞周期 ◆爪蟾早期胚胎细胞的细胞周期 特异的细胞周期是指那些特殊的细胞所具有的与标准的细胞周期相比有着鲜明特点的细胞周期
◆酵母细胞的细胞周期 ◆植物细胞的细胞周期 ◆细菌的细胞周期
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特异的细胞周期 早期胚胎细胞的细胞周期 受精卵在卵裂过程中的细胞周期，尤其两栖类、海洋无脊椎类、昆虫类的早期胚胎细胞。
卵细胞贮存的物质基本满足早期胚胎发育需要，受精后，迅速卵裂，但总体积不增加，卵裂球体积越分越小，每次卵裂时间大大短于体细胞，其G1和G2期非常短，以至于认为由S期和M期组成 细胞周期调控因子和调控机制与一般体细胞一致
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爪蟾早期胚胎细胞的细胞周期 细胞分裂快,无G1期, G2期非常短,S期也短(所有 复制子都激活), 以至认为仅含有S期和M期
无需临时合成其它物质 子细胞在G1、G2期并不生长，越分裂体积越小 细胞周期调控因子和调节机制与一般体细胞标准 的细胞周期基本是一致的
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酵母细胞的细胞周期 特点：持续时间短，90min；核膜不解聚；纺锤体不在细胞质，而在细胞核内；一定条件下，进行有性繁殖
芽殖酵母：起始点后，马上出芽；纺锤体装配与S期DNA复制同时进行；如环境因素不适应，直接进入G0期或进行有性生殖，最终形成4个单倍体孢子，一旦环境条件适应，孢子萌发，回到无性生殖状态
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裂殖酵母的细胞周期 短棒状，起始点后，DNA复制；G2后，细胞生长到一定体积，才进入M；染色质凝集，纺锤体核内装配、延长，细胞核拉长、分裂，再胞质分裂 两个不同性别的单倍体裂殖酵母细胞直接结合，经减数分裂，形成4个单倍体孢子 起始点无明显形态学标志，但细胞分裂均等；细胞长度不变，通过测定长度，确定细胞周期变化
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植物细胞的细胞周期 植物细胞的细胞周期与动物细胞的标准细胞 周期非常相似，含G1期、S期、G2期和M期期
植物细胞不含中心体，但在细胞分裂时可以 正常组装纺锤体 植物细胞以形成中板的形式进行胞质分裂
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细菌的细胞周期 细菌在生长缓慢时与真核生物相似
快速生长时，有显著变化，最主要的变化是调节快速分裂与DNA复制速度的问题。细菌细胞分裂一次仅需35min，而完成一次DNA复制要40min，且10minG1期，20minG2期，一个周期70min 上一次分裂结束时，胞内DNA已复制到一半路程，分裂后，10minDNA开始复制，且在两个DNA分子上同时开始
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二、有丝分裂(mitosis) 有丝分裂过程 与有丝分裂直接相关的亚细胞结构 有丝分裂过程中染色体运动的动力机制
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有丝分裂过程 ●前期(prophase) ●前中期(prometaphase) ●中期(metaphase) ●后期(anaphase)
●末期(telophase)
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前期(prophase) ◆标志前期开始的第一个特征是染色质开始浓缩
(condensation)形成有丝分裂染色体(mitotic chromosome） ◆第二个特征细胞骨架解聚，有丝分裂纺锤体 (mitotic spindle)开始装配 ◆Golgi体、ER等细胞器解体，形成小的膜泡
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前期(prophase) ·这种染色体由两条染色单体(chromatid)构成 ·在前期末，染色体主缢痕部位形成一种蛋白复
合物称为动粒(kinetochore)
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间期动物细胞含一个MTOC，即中心体，在
S期末，两个中心粒在各自垂直的方向复制出一个中心粒，形成两个中心体。当前期开始时， 2个中心体移向细胞两极，并同时组织微管生 长，由两极形成的微管通过微管结合蛋白在正 极末端相连，最后形成有丝分裂纺锤体
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前中期(prometaphase) ◆核膜破裂成小的膜泡，这一过程是由核纤层蛋白中 特异的Ser残基磷酸化导致核纤层解体
◆纺锤体微管与染色体的动粒结合，捕捉住染色体每个 已复制的染色体有两个动粒，朝相反方向，保证与两 极的微管结合；纺锤体微管捕捉住染色体后，形成三 种类型的微管 ◆不断运动的染色体开始移向赤道板。细胞周期也由前中 期逐渐向中期运转。
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中期(metaphase) ◆所有染色体排列到赤道板(Metaphase Plate)上， 标志着细胞分裂已进入中期
◆是什么机制确保染色体正确排列在赤道板上？ 着丝粒微管动态平衡形成的张力
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Experimental demonstration of the importance of mecha- nical tension in metaphase checkpoint control. MT behavior during formation of the metaphase plate. Initially,MT from opposite poles are different in length.
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后期(anaphase) ◆排列在赤道面上的染色体的姐妹染色单体分离 产生向极运动
◆排列在赤道面上的染色体的姐妹染色单体分离 产生向极运动 ◆后期(anaphase)可分为连续两个阶段，即后期A 和后期B ·后期A：动粒微管去装配变短，染色体产生两极运动 ·后期B：极间微管长度增加，两极之间的距离逐渐拉 长，介导染色体向极运动
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末期(telophase) ◆染色单体到达两极，即进入了末期 (telophase), 到达两极的染色单体开始去浓缩 ◆核膜开始重新组装
◆ Golgi体和ER重新形成并生长 ◆核仁也开始重新组装，RNA合成功能逐渐 恢复, 有丝分裂结束
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三、胞质分裂(Cytokinesis) ●动物细胞胞质分裂 ●植物细胞胞质分裂
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动物细胞胞质分裂cytokinisis 胞质分裂开始于细胞分裂后期，完成于末期。赤道板周围细胞表面下陷，成分裂沟(furrow) ，沟加深直至两个子代细胞完全分开 分裂沟下方，肌动蛋白、微管、小膜泡聚集，共同构成一个环形致密层，即中间体； 胞质分裂开始时，大量肌动蛋白和肌球蛋白在中间体处装配成微丝束，环绕细胞，称收缩环(contractile ring) 。收缩环收缩，分裂沟加深，细胞相互分离
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植物细胞胞质分裂 ◆与动物细胞胞质分裂不同的是，植物细胞胞 质分裂是因为在细胞内形成新的细胞膜和细 胞壁而将细胞分开
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胞质分裂 极性微管参与了分裂沟的形成，分裂沟与纺锤体位置明显相关
ras基因家族中racE基因在收缩环收缩和细胞膜融合中起重要作用，因其表达产物为GapA和RgaA/DPAP1，调节小分子GTP酶、Ca2+及GTP酶活性，从而参与收缩环收缩和细胞膜融合过程
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与有丝分裂直接相关的亚细胞结构——中心体
中心体：由一对位于中央相互垂直的中心粒和周围无定型物质构成，每一中心粒为一圆筒状结构，管壁由9组三联微管构成，微管主要成分、微管蛋白，也有微管蛋白 中心体与四射的微管合称星体 中心体周期：G1期末开始复制，S期已有一对中心体，但二者没分开； G2期分开，并向各自细胞的两极移动，并参与纺锤体；细胞分裂结束，每子细胞获得一个中心体
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动粒与着丝粒 动粒又称着丝点 抗动粒蛋白抗体作免疫荧光染色，电镜下观察，分内、中、外三层，内层宽40-60nm，着丝粒染色质构成，外层40-60 nm，纤维网格样结构；中层25-30nm，有细纤维横跨内外层之间；在外层的表面有纤维样物质
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哺乳类动粒蛋白成分 CENP-A：内层，是组蛋白H3类蛋白 CENP-B：内层内侧 CENP-C：内层
CENP-E：外层表面，驱动蛋白，促使染色体与来自两极的微管连接 CENP-F：间期，核骨架蛋白；分裂前，动粒上；分裂后，纺锤体中间区域；末期，中体 INCENP等
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纺锤体spindle 染色体分离直接相关的细胞器，纺锤形，主要由微管、微管结合蛋白组成，两端为星体，由动粒微管和极性微管组成
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纺锤体装配 微管在中心体周围装配有许多因子参与： 微管蛋白，pericentrin等
中心体分离：需移动素类蛋白和胞质动力蛋白，前者为向微管正极运动的蛋白，后者为向微管负极运动的蛋白
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染色体运动的动力机制 染色体列队：启动染色体分离并向两子细胞平均分配的先决条件
动粒上Mad蛋白和Bub蛋白，对微管捕捉有关键作用，染色体不能被捕捉，后期无法启动
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染色体列队学说 牵拉假说(pull)：染色体受动粒微管牵拉而排到赤道板，动粒微管越长，拉力越大，当来自两极拉力相等时，染色体被稳定在赤道板上 外推假说(push)：星体的排斥力将染色体外推到赤道板，染色体越近，星体的外推力越强，推力相等时，染色体被稳定在赤道板
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染色体列队与后期启动 动粒在与微管联结之前，会发出抑制信号，Mad2与后期促进因子复合体及其他相关物质结合，抑制APC(cdc20)活性，阻止细胞周期向下一个阶段运转 联结后，CENP-E分子结构和位置发生变化，这一变化影响到Bub1蛋白活性，后者进一步影响Mad2稳定性和与其他有关物质的 结合，最终导致Mad2对APC 抑制的解除
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染色体分离 后期A：动粒微管变短(动粒端解聚)，将染色体拉向两极， 后期B：极性微管游离端在ATP提供能量时微管蛋白聚合，使极性微管加长
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四、减数分裂(Meiosis) ●减数分裂概念与过程： ●减数分裂的意义 ●减数分裂特点 ●脊椎动物配子发生过程
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减数分裂概念与过程 ◆概念：减数分裂是细胞仅进行一次DNA复制， 随后进行两次分裂，染色体数目减半的一种 特殊的有丝分裂 ◆减数分裂过程
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减数分裂的意义 ◆确保世代间遗传的稳定性 ◆增加变异机会，确保生物的多样性， 增强生物适应环境变化的能力 ◆减数分裂是生物有性生殖的基础，
是生物遗传、生物进化和生物多 样性的重要基础保证。
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减数分裂生物学意义 有效获得父母双方遗传物质，保持后代遗传的稳定性 增加更多变异机会，确保生物多样性，增强生物适应环境变化能力
减数分裂是生物有性生殖的基础，是生物遗传、生物进化和生物多样性的重要基础
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减数分裂生物学意义 减数重组破坏协同进化的基因组合，导致基因负荷 单基因座的分离，也可能消除进化上优势的杂合子
完全分化的雌雄配子的出现，可减半生物体繁殖的潜在速率，这是广泛接受的“雌雄性的双重损失” 与无性繁殖的简洁、复制、分裂策略相比，有性繁殖显得过于繁琐，在受精各环节，一方面需要大量能量保证，另一方面需精细协调两性间的利益冲突以有利于整个物种
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减数分裂特点 ◆遗传物质只复制一次，细胞连续分裂两 次， 导致染色体数目减半 ◆S期持续时间较长
◆遗传物质只复制一次，细胞连续分裂两 次， 导致染色体数目减半 ◆S期持续时间较长 ◆同源染色体在减数分裂期I(MeiosisI)配对 联会、基因重组 ◆减数分裂同源染色体配对排列在中期板 上,第一次分列时,同源染色体分开
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减数分裂前S期与有丝分裂前S期长度比较
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前期I分为细线期，偶线期，粗线期，双线期，
终变期等五个阶段 形成联会复合体(Synaptonemal Complex, SC) 同源染色体间遗传物质重组,产生新的基因组合
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减数分裂的前间期 1) S期持续时间长； 2) 个别植物中该间期的S期仅复制其DNA总量的 %，剩下的 %要等到减数分裂的前期阶段才复制，而且这些推迟的DNA被分割成小片段； 3) L蛋白与那些小片段结合，阻止其复制； 4) 细胞核大于体细胞核； 5) 染色质凝集成异染色质； 6) 生物种类不同，G2期长短变化较大
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减数分裂过程 减数分裂期Ⅰ 前期Ⅰ,前中期Ⅰ,中期Ⅰ,后期Ⅰ,末期Ⅰ和胞质分裂Ⅰ等6个阶段
前期Ⅰ：持续时间较长；期间有染色体配对和基因重组；合成一定量RNA和蛋白质。据细胞形态变化，人为划分为：细线期，偶线期，粗线期，双线期，终变期5个阶段
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细线期leptotene,leptonema
染色质凝聚成细纤维样染色体结构，又凝集期，染色体单线状，染色单体没完全形成，臂不分离 具染色粒结构 染色体端粒通过接触斑与核膜相连，其他部分以环状延伸到核质中，个别种类，接触斑位于细胞核一侧，染色体呈花束状向核内其他部位延伸，又花束期
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偶线期zygotene, zygonema 又合线期，配对期：主要发生同源染色体配对，配对后，称二价体或四分体
联会synapsis：同源染色体配对的过程 联会复合体(SC) 合成间期未完成的0.3%的DNA，Z-DNA Z-RNA：由Z-DNA转录的RNA
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粗线期pachytene, pachynema
同源染色体配对完成后， 但他们仍紧密结合 染色体进一步浓缩，变粗变短，并与核膜保持接触 等位基因间部分DNA片段交换和重组 有些生物在联会复合体中间形成重组结 合成部分DNA，即P-DNA 合成减数分裂专有组蛋白，并部分或全部置换下体细胞中组蛋白 rDNA扩增
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双线期diplotene, diplonema
同源染色体相互分离，仅留几处相互联系，交叉明显 许多动物，尤其鱼类、两栖类、爬行类和鸟类的雌性动物在双线期，同源染色体要发生去凝聚，RNA转录活跃，形成灯刷染色体 转录合成前体mRNA，tRNA，5S rRNA 有些mRNA翻译成蛋白质，但也有以非活跃形式储备在卵母细胞质中
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终变期diakinesis 染色体重新开始凝聚，成短棒状，灯刷染色体侧环回缩，RNA转录停止，核仁消失，交叉向染色体臂端部移动，直至端化，此时染色体仅端部和着丝粒处相互联结
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中期Ⅰ 四分体排列到赤道板，一条同源染色体两个动粒位于一侧，另一条的两个动粒位于另一侧
纺锤体一极发出的微管只与一个同源染色体的两个动粒相连
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后期Ⅰ 四分体之间同源染色体向两极移动是一个随机过程，到达两极的染色体会出现许多排列方式
23对染色体的人类细胞，理论上有223种不同的排列方式，遗传上完全相同配子的概率只有 分之一，还有基因重组，精子、卵子随机结合，得到遗传上完全相同的个体几乎不可能
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末期Ⅰ,胞质分裂Ⅰ和减数分裂间期 末期与有丝分裂末期相同 间期基本相同，但有别：不再进行DNA复制，也没有G1、S、G2之分 时间较短
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第二次减数分裂 与有丝分裂相似 经过第二次减数分裂，共形成4个子细胞 雄性动物：4子细胞大小相似，将来发育成4个精子
雌性动物，第一次减数分裂不均等，产生一个卵母细胞，一个第一极体，后者死亡，前者继续第二次减数分裂，产生一个卵细胞，一个第二极体，后者没有功能，很快解体
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减数分裂过程中特殊结构及其变化 性染色体的分离 联会复合体和基因重组
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性染色体的分离 多数雌性动物细胞两条性染色体XX，雄性 细胞染色体为XY(XO，无Y染色体) 个别恰好相反，雌性XY，雄性XX
人类的XY染色体在前期I配对，中期到赤道板，随常染色体分离；有时XY染色体的两条单体在第一次减裂时相互分离，导致产生两细胞各含一个X染色体和一个Y染色体 XY(XY, O ) X, Y, O, O; XY (X, Y) 2X, 2Y
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性染色体的分离 对XO(昆虫)物种， XO X，O O，O X，X XO XO，O O，O X，O
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联会复合体和基因重组 1963Moses卵母细胞 沿同源染色体长轴分布
中央成分(125KD)，侧成分(30, 33KD, DNA拓扑异构酶) ，横向纤维，配对的同源染色体(DNA拓扑异构酶) DNA与联会复合体结合不需要特殊DNA序列，染色体任何部位都有可能与联会复合体侧成分结合，这些DNA片段可能穿越侧成分进入中央成分，在此与同源染色体的基因重组
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联会复合体和基因重组 中央成分和侧成分还有RNA，推测可能有核糖核蛋白复合体
联会复合体从细线期开始装配，偶线期形成明显的联会复合体结构，粗线期时，重组结开始装配
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第二节 细胞周期的调控 MPF的发现及其作用 P34cdc2激酶的发现及其与MPF关系 周期蛋白 CDK激酶和CDK激酶抑制物
第二节 细胞周期的调控 MPF的发现及其作用 P34cdc2激酶的发现及其与MPF关系 周期蛋白 CDK激酶和CDK激酶抑制物 细胞周期运转调控 其他内在和外在因素在细胞周期调控中的作用
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MPF的发现及其作用 MPF卵细胞促成熟因子，或细胞促分裂因子，或M期促进因子
1970 Johnson 和Rao 将HeLa细胞同步化在不同的细胞周期，然后将M期细胞与其他间期细胞在仙台病毒介导下融合，并培养一定时间，发现与M期细胞融合的间期细胞发生了形态各异的染色体凝集，并称之为染色体超前凝集(PCC) 该现象在其他材料都得以证实，说明M细胞中有细胞促分裂因子
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人M期细胞与袋鼠(Ptk)G1、S、G2期细胞融合诱导PCC：
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MPF的发现及其作用 1971，Masui和Markert用非洲爪蟾卵实验，明确提出MPF概念
成熟卵母中MPF已经存在，只是处于非活性状态，即前体MPF 1988，分离、纯化到MPF，分析含有p32和p45两种蛋白，是种蛋白激酶
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处于第六期的爪蟾卵母细胞(RD前期I)，具GV
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注射实验表明：孕酮诱导卵母细胞成熟；成熟卵细胞质中，含有卵母细胞成熟的因子，称做MPF。
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P34cdc2激酶的发现及其与MPF关系 L.Hartwell等在不同温度条件下培养芽殖酵母，分离到数十个温度敏感突变体，以他们为材料研究突变体基因变化和表达 P.Nurse等获得数十个温度敏感的裂殖酵母突变体，发现与细胞周期调控有关的基因，cdc基因 cdc2基因裂殖酵母细胞中最重要的基因之一，该基因突变导致细胞周期停留在G2/M交界处，表达产物为34KD蛋白，称p34cdc2。P34cdc2具蛋白激酶活性，使多种蛋白底物磷酸化，因而被称为p34cdc2激酶
136
P34cdc2激酶的发现及其与MPF关系 在芽殖酵母中关键的调控基因为cdc28，该基因突变使细胞停留在G1/S，G2/M交界处，表达产物为蛋白激酶p34cdc28 P34cdc2和p34cdc28本身不具蛋白活性，只有与蛋白结合后才显活性 Tim Hunt等以海胆卵为材料，发现细胞周期蛋白，并证明MPF有两亚基，周期蛋白和Cdc2，两者结合后，表现出激酶活性， Cdc2为催化亚基，周期蛋白为调节亚基
137
周期蛋白 1983首次发现周期蛋白后，酵母6种，高等动物中有14多种，这些周期蛋白在细胞内表达的时期不同，所执行的功能也多种多样。只在G1期表达，并只在G1/M转化过程中起调节功能的为G1期周期蛋白，有的虽在间期表达积累，但M期才表现调节功能的，称为M期周期蛋白
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周期蛋白 各周期蛋白的共性：有一段相当保守的氨基酸序列，即周期蛋白框，该框有100 Aa左右。周期蛋白框介导周期蛋白与CDK结合
不同周期蛋白识别不同的CDK，组成不同的周期蛋白- CDK复合体，表现出不同的CDK激酶活性 M周期蛋白近N端有9Aa组成的特殊序列，称破坏框，破坏框后有40Aa组成的赖氨酸富集区，破坏框参与由泛素介导的周期蛋白A、B的降解
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周期蛋白 G1期周期蛋白不含破坏框，但C端有PEST序列，该序列与G1期周期蛋白更新有关
不同的周期蛋白在细胞周期中表达的时期不同，并与不同的CDK结合，调节不同的CDK激酶
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CDK激酶和CDK激酶抑制物 周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase) ：简称CDK激酶, 与周期蛋白结合，并将周期蛋白作为其调节的亚单位才表现出蛋白激酶活性。目前发现的CDK激酶有Cdc2, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6,CDK7,CDK8 等 CDK激酶结构域,PSTAIRE序列相当保守,此序列与周期蛋白结合有关;某些位点磷酸化修饰,参与CDK激酶活性调节
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CDK激酶抑制物 CDK激酶抑制物(CDKI)：对CDK激酶活性起负性调控的蛋白质
CIP/KIP家族代表有p21CIP/WAF1、p27KIPI、p57KIP2、p21CIP/WAF1，其中p21主要对G1期CDK激酶起抑制作用 INK：p16、p15、p18、p19，其中p16为该家族代表，主要抑制CDK4和CDK6激酶活性
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CDK1的调节与活化; CAK=CDK1-Activiting Kinase
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细胞周期运转调控 CDK激酶对细胞周期起着核心性调控作用，不同种类的周期蛋白与不同种类CDK结合，构成不同的CDK激酶
G2/M期转化与CDK1激酶的关键性调控作用 M期周期蛋白与分裂中期向分裂后期转化 G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDK激酶 DNA复制延搁检验点参与调控S/G2/M期转化
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G2/M期转化与CDK1激酶的关键性调控作用
CDK1激酶，即MPF, p34cdc2激酶，由p34cdc2或p34cdc28蛋白与周期蛋白B结合而成， p34cdc2蛋白在细胞周期中含量稳定，而周期蛋白B含量则呈周期性变化。 CDK1激酶活性首先依赖于周期蛋白B含量的积累 周期蛋白B一般在G1晚期开始合成，经S期，到G2期含量最高， CDK1激酶活性在G2期晚期最大并一直维持到M期的中期阶段 周期蛋白A也与CDK1结合成复合体
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CDK1激酶 CDK1激酶通过使某些蛋白质磷酸化，改变其下游某些蛋白质结构和启动其功能实现其调控细胞周期的目的的
选择底物某特定序列中某个Ser/Thr残基 CDK1激酶可使许多蛋白质磷酸化，组蛋白H1、核纤层蛋白A、B、C、nucleolin、No.38、p60c-src、C-abl等
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CDK1激酶 CDK1激酶活性受多种因素综合调节 周期蛋白与CDK结合是先决条件，但不是全部
周期蛋白与CDK结合形成复合体后，weel/ mik1激酶和CDK1激酶催化CDK Thr 14, Tyr 15, Thr161磷酸化前体MPF CDK在磷酸酶Cdc25c催化下, Thr14, Tyr15去磷酸化才表现出活性
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M期周期蛋白与分裂中期向分裂后期转化 M期周期蛋白A、B降解，CDK1激酶活性丧失，周期从M期向后期转化
过程：泛素C端与非特异性泛素激活酶E1的Cys残基结合，成E1-泛素复合体将泛素转移另一泛素结合酶E2 靶蛋白Lys残基的氨基酸基团上。但通常，后一步还需E3催化一些泛素分子相继与前一个泛素分子Lys残基相连，成一多聚泛素链 周期蛋白泛素化过程中，其破坏框起重要作用
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后期促进因子 后期促进因子APC： APC1- APC8中已鉴定出4种成分,即Cdc16, Cdc23, Cdc27, BimE，另4种仍待研究 APC除调节M期周期蛋白泛素化途径降解外，还调节与细胞周期调控有关的非周期蛋白类蛋白的降解 M期CDK激酶活性对APC活性起着调控作用 Cdc20为APC有效的正调控因子：Cdc20与Mad2结合，使前者失去活性，不能活化APC
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G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDK激酶
哺乳动物细胞中， G1 期周期蛋白主要包括周期蛋白D、E、或许还有A。与G1 期周期蛋白结合的CDK激酶主要包括CDK2、CDK4和CDK6 周期蛋白D主要与CDK4和CDK6结合并调节CDK6的活性；周期蛋白E则与CDK2结合；周期蛋白A既为M期周期蛋白，也与CDK2结合并使其表现激酶活性，因此，也参与G1/S期转化
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G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDK激酶
目前，哺乳动物细胞表达三种周期蛋白D，即D1、D2、D3，但三者有组织特异性 一般，一种细胞仅表达两种周期蛋白D，但特异的周期蛋白D抗体的显微注射和反义RNA显微注射都显示它是细胞G1/S转化必需的 周期蛋白D-CDK4和D-CDK6不能使组蛋白H1磷酸化，因Rb是周期蛋白D-CDK激酶的底物， Rb是G1/S期转化的负性调节因子，在 G1期晚期通过磷酸化而失活
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G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDK激酶
周期蛋白E是哺乳动物中另一G1期周期蛋白，在G1期晚期开始形成，并一直持续到S期，进入S期后，很快被降解 周期蛋白E与CDK2结合成复合物，呈现CDK2激酶活性，且周期蛋白E-CDK2激酶活性为S期启动所必需 生长抑制因子TGF可有效地抑制周期蛋白E-CDK2激酶活性，但也有实验显示周期蛋白E在肿瘤细胞含量较正常细胞高得多。在细胞中提高周期蛋白E的表达，该细胞能快速进入S期，而且对生长因子的依赖性降低
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G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDK激酶
细胞周期蛋白E-CDK2激酶与 p107和 E2F结合成复合物后，CDK2激酶催化p107磷酸化，使 p107失去抑制作用；E2F的作用被显示出来，促进有关基因的转录，促使细胞周期由G1期向Ｓ期转化；它还直接参与中心体复制的起始调控 周期蛋白A-CDK2激酶为S期主要的CDK激酶，与DNA复制有关；它也与p107和 E2F结合成复合物，进而影响后者的功能
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G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDK激酶
S期，G1期周期蛋白也通过泛素途径降解，但与M期周期蛋白降解不同。G1期周期蛋白降解需要G1期CDK激酶活性的参与及特殊的E2和E3。 G1期周期蛋白分子中不含有破坏框序列，而是PEST序列，PEST序列对G1期周期蛋白降解起促进作用
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G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDK激酶
复制起始点复合物(Origin recongnition complex,Orc)蛋白,有6亚单位, Orc1、 Orc2、 Orc3、 Orc4、 Orc5、 Orc6 Orc识别DNA复制起始点并与之结合，是DNA复制起始所必需的 Cdc6和Cdc45也是DNA复制必需的调控因子，前者对Cdc45与染色质结合起促进作用
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G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDK激酶
DNA复制执照因子学说(DNA replication-licensing factor theory)：在细胞胞质内存在一种执照因子，对细胞核染色质DNA复制发行“执照”。M期，细胞核膜破裂，胞质中的执照因子与染色质接触并与之结合，使后者获得DNA复制所必需的执照，细胞经G1期入S期，DNA开始复制，随DNA复制过程的进行，“执照”信号不断减弱直到消失，到G2期，细胞核不再有执照信号，DNA复制结束并不再起始，只有等下一个M期
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G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDK激酶
DNA复制执照因子：Mcm蛋白，该蛋白共有6种，分别为Mcm2、 Mcm3、 Mcm4、 Mcm5、 Mcm6、 Mcm7，细胞中去除任何一种Mcm蛋白，细胞失去DNA复制起始功能，且执照因子中还存在其他某些成分
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DNA复制延搁检验点参与调控S/G2/M期转化
非洲爪蟾卵细胞中，S期时Cdc25c的活性较低，而Weel的活性较高， Weel使CDK1的Thr14和Tyr15磷酸化，从而抑制CDK1激酶活性。Cdc25c活性低，不能有效促使CDK1的Thr14和Tyr15去磷酸化，因而不能激活CDK1 如在S期加入过量Cdc25c，即使DNA复制尚未完成，也可促使由S期向G2和M期转化 Weel和Cdc25c的确参与了DNA复制延搁检验点的调控，但未复制DNA如何调控Weel和Cdc25c活性的，其他参与因子有哪些？
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其他内在和外在因素在细胞周期调控中 的作用
癌基因和抑癌基因 癌基因非正常表达导致细胞转化、增殖过程异常，甚至畸变。目前已分离出一百多种癌基因，其表达产物可归为蛋白激酶、多肽类生长因子、膜表面生长因子受体和激素受体、信号转导器、转录因子、类固醇和甲状腺激素受体、核蛋白等。 抑癌基因表达产物对细胞增殖起负性调节作用，p53，Rb
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其他内在和外在因素在细胞周期调控中的作用
细胞和机体外界因素对细胞周期也有重要影响。离子辐射、化学物质作用、病毒感染、温度变化、pH变化等
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