第二章 发酵工业菌种.

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1 第二章 发酵工业菌种

2 本章内容 一、常用的工业微生物 二、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术 三、发酵工业菌种改良

3 一、常用的工业微生物 对产物进行菌种筛选时，有两条经验： 进化上向上兼容； 次生代谢在进化上后移，芽孢菌以上才有筛选意义。

4 一、常用的工业微生物 细菌 醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌 乳酸杆菌 枯草杆菌 丙酮丁醇梭菌 大肠杆菌 谷氨酸棒状杆菌

5 酵母菌 酿酒酵母 假丝酵母属 产朊假丝酵母 解脂假丝酵母 热带假丝酵母 毕赤酵母属、汉逊酵母属

6 霉菌 曲霉属 米曲霉 黑曲霉 青霉属 青霉菌：点青霉、产黄青霉 桔青霉 根霉属 德氏根霉 米根霉、小麦曲根霉 红曲霉属 紫红曲霉

7 放线菌 链霉菌属 小单孢菌属 地中海诺卡氏菌 米苏里游动放线菌

8 未培养微生物 定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为99％。
研究方法 模拟自然培养法: 原位培养、培养条件优化、 单细胞操作 宏基因组分析法

9 二、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术 （一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 （二）分离筛选原理与技术 （三）应用举例

10 （一）发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 1. 菌种选择的总趋势 野生菌→变异菌 自然选育→代谢控制育种 诱发基因突变→基因重组的定向育种

11 2. 菌种选择的要求 能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成的目的产物产量高、易于回收； 生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；
培养条件易于控制； 抗噬菌体及杂菌污染的能力强；

12 2. 菌种选择的要求（续） 菌种不易变异退化； 对放大设备的适应性强； 菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。

13 （二）分离筛选原理与技术 1. 筛选的指导思想 2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面 3. 新种分离筛选原理与技术

14 1. 筛选的两种指导思想 先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。 分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。 结果有两种可能：
获得适于工业发酵菌株 只获得选育所需的出发菌株

15 2.分离筛选工作在实际中应用的几个方面 从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； 生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ；
从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目的的优良菌株 ； 从已知菌种和大自然中分离新菌株 寻找新的发酵产品的产生菌； 寻找老产品的新的优良菌株。 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 经济性 指导性

16 设计筛选方案时必须考虑两个要点 选择性 灵敏度

17 3.新种分离与筛选的步骤 调查研究（包括资料查阅） 试验方案设计 含微生物样品的采集 （如何使样品中含所需微 生物的可能性大？）
  含微生物样品的采集 （如何使样品中含所需微 生物的可能性大？）   样品预处理 （如何在后续的操作中使这种可 能性实现）   菌种分离

18 菌种分离 根据目的菌株及其产物特点分    选择性分离方法 随机分离方法 (定向筛选←选择压力) (用筛选方案- 检测系统进行间接分离）   富集液体培养 固体培养基条件培养 (初筛) 菌种纯化   复筛

19 菌种纯化 初步工艺条件摸索 再复筛 生产性能测试 较优菌株1-3株 保藏及进一步做生产试验 某些必要试验和 或作为育种的出发菌株 毒性试验等

20 含微生物样品的采集 采样时应注意的问题: 土壤微生物的分布 采土深度 土壤植被情况 采样季节 土壤的酸碱度
对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准： 土壤来源广泛 在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新菌种

21 样品的预处理 目的：提高分离效率 方法： 物理方法：热处理；膜过滤法；离心法 化学方法 诱饵法

22 分离方法的选择 根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法 菌种的营养特征独特 生长特征独特 无选择性特征 根据产物的特征进行 选择性分离
无选择性特征 根据产物的特征进行 随机分离 选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控制，从而实现定向富集筛选。 选择性分离

23 选择性分离原理和技术 生长条件的选择与控制原理 控制营养成分 控制培养基酸碱度 添加抑制剂 控制培养温度 控制通气条件 选择性分离技术
富集液体培养技术 固体培养技术 施加选择压力，进行定向筛选

24 A.富集液体培养 增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件
培养方式 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选，存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题 连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选

25 基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（μ）的影响
S0 基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（μ）的影响 当S<S0时，富集什么菌株？ 当S>S0时，富集什么菌株？

26 连续富集培养技术分离菌株的优点 分离的菌株特别适合连续发酵生产过程 有利于分离具有某种工业生产特性的菌株 可以筛选出能共生的稳定混合培养物

27 B. 固体培养技术 常用于分离某些酶产生菌 选择压力：在选择培养基中加入所需酶的基质

28 随机分离原理与技术 从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛选出所需的目的菌。
技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应筛选方法的确定。 随机分离技术举例 抗生素产生菌的筛选 药理活性化合物产生菌的筛选 生长因子产生菌的筛选 多糖产生菌的筛选

29 高产培养基设计的几个原则 制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素； 使用一聚合或复合形式的生长限制养分；
避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代谢物阻遏； 确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）； 使用pH缓冲剂以减少pH变化； 前体、促进剂及抑制剂的采用。

30 抗生素产生菌的筛选 筛选模型：试验菌 筛选方法： 铺菌法 复印平板法 液体培养筛选 固体培养筛选 抗药性筛选
筛选模型：氨苄青霉素和β-内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同 I II 无试样时（不含棒酸时），I对II菌作用不大 有试样时（含棒酸时），I对II菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性 固体培养筛选

31 试验菌 代表微生物类型 金黄色葡萄球菌209p 革兰氏阳性球菌 枯草杆菌 革兰氏阳性杆菌 大肠杆菌 革兰氏阴性肠道细菌 耻垢分枝杆菌 结核杆菌 白色念珠菌 酵母状真菌 青霉菌 丝状真菌

32 药理活性化合物产生菌的筛选 药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到治疗的目的。 筛选模型：目标酶

33 生长因子产生菌的筛选 筛选模型：营养缺陷型试验菌 筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进营养缺陷型试验菌生长

34 氨基酸产生菌的筛选 预处理 初筛（除真菌） 复印平板（copy 法） u.v线杀死长好的菌落 位置，找到目的菌落 目的菌落进行液体培养，
样品   预处理   初筛（除真菌）   在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板（copy 法） 平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 对应到copy前相应 u.v线杀死长好的菌落 位置，找到目的菌落 再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂 培养后 产氨基酸菌落周围有生长圈 目的菌落进行液体培养， 对产物进行定量测定 筛选产物含量高的菌株

35 多糖产生菌的筛选 取样特点：碳水化合物工业的废弃物
筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选高产菌。

36 细菌分离：以乳酸菌为例 取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中 加麦芽汁至瓶口处，封塞，25℃培养24-48h
  加麦芽汁至瓶口处，封塞，25℃培养24-48h 培养基中长出绢丝状波动物，镜检 杆状，阳性染色 初步断定乳酸菌   用选择性培养基分批富集培养2-3代 稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、CaCO3的琼脂培养基  根据透明圈挑选菌落   性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定）   Rf值定性 （有机酸呈黄斑点）    乳酸生成量测定（滴定法）

37 放线菌的分离： 以产链霉素菌种的分离为例 （从退化菌种中筛选）
取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀   采用稀释法制平板，获取单菌落 斜面保藏 高产菌恢复 根据高产菌的特点，选择目的菌落 放大培养，发酵液性能测试 筛选模型：形态依据

38 真菌的分离筛选：以啤酒酵母为例 取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7 稀释分离法 取0.1ml 加入固体培养基铺平皿（×2）
  在麦芽汁固体培养基上，25℃培养48-72h 形态筛选 根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用   纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次      ①生成子囊孢子速度测定 ②发酵力测定 性能测定 ③热死温度测定 ④凝集力测定 ⑤双乙酰含量测定

39 菌种选育改良的具体目标 提高目标产物的产量 提高目标产物的纯度，减少副产物 改良菌种性状，改善发酵过程 改变生物合成途径，以获得高产的新产品

40 发酵工业菌种改良方法 常规育种(诱变育种) 细胞工程育种 基于代谢调节的育种技术 基因工程育种 蛋白质工程育种 代谢工程育种

41 赖氨酸生产菌种的选育改良思路 出发菌株：黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌 育种思路 1.优先合成的转换——渗漏缺陷型的选育
2.切断支路代谢——营养缺陷型的选育：高丝氨酸缺陷型 3.抗结构类似物突变株的选育 4.解除代谢互锁：Leu- 、 抗Leu结构类似物、 喹啉s 、 苯醌s 5.增加前体物的合成和阻塞副产物的生成 6.改善细胞膜的透过机能 7. 选育温度敏感突变株 8. 应用细胞工程和基因工程育种

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43 选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株
赖氨酸合成中间代谢有以下两条途径： ①通过TCA循环 葡萄糖 丙酮酸 草酰乙酸 天冬氨酸 赖氨酸 ② 通过磷酸烯醇丙酮酸羧化反应 葡萄糖 磷酸烯醇 草酰乙酸 天冬氨酸 式丙酮酸 丙酮酸

44 代谢工程的定义 利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一个新的学科领域。 又称作途径工程，是多基因的基因工程。

45 代谢工程发展基础 代谢网络理论：是把细胞的生化反应以网络整体，而不是孤立地来考虑。
代谢网络分流处的代谢产物称为节点，其中对终产物合成起决定作用的少数节点称为主节点。 根据节点下游分支的可变程度，节点分为： 柔性节点： 解除一个分支的反馈抑制可提高该分支下游产物的产量。 半柔性节点：须降低主分支的酶活并同时提高次分支的酶活或解除其反馈抑制，才可提高次分支下游产物的产量。 刚性节点：其下游各分支的比例不易改变。

46 代谢工程发展基础 相依网络：代谢网络中各主节点集中于产物，为了避免中间物的过量积累，各分支的代谢流都必须保持平衡，各分支的分流相等，各节点的重要性相同。 独立网络：代谢网络的主节点不集中，可以通过对代谢的修饰来影响产物的产量,其对代谢修饰的应答能力，取决于各节点的刚柔性及其位置。 S I P S Ⅰ Ⅱ P Ⅱ B B B2 相依网路 独立网路

47 （三）代谢工程育种思路 1. 改变代谢流：改变分支代谢途径的流向，阻断有害代谢产物的合成。 （1）加速限速反应
（2）改变分支代谢途径流向：提高代谢分支点的某一分支代谢途径酶系的活力，在与另外的分支代谢途径的竞争中占有优势，可以提高目的代谢末端产物的产量。 （3）构建代谢旁路 （4）改变能量代谢途径

48 代谢工程育种思路 2. 扩展代谢途径 （1）在引入外源基因后，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端代谢产物。
（2）使原来的代谢途径向前延伸，可以利用新的原料生物合成代谢末端产物。

49 代谢工程育种思路 3. 转移或构建新的代谢途径 1)转移代谢途径: 为生产某一新的化学结构的代谢产物，将催化某一代谢途径的基因组克隆到另一不具备该种能力的微生物中，达到代谢途径转移的目的，使之具备生产该种新化合物的能力。 2)构建新的代谢途径: 利用基因工程手段，通过克隆少数基因将原来细胞中无关的两条代谢途径桥连在一起，形成新的代谢途径。

50 本章小结 掌握微生物分离筛选的基本概念、基本原理与基本技术 掌握菌种改良的基本技术与方法