提 纲 一、基本概念介绍 二、历史回顾 三、细胞周期各时相的动态变化 四、细胞周期的调控 五、细胞周期得以进行的两大机制

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1 提 纲 一、基本概念介绍 二、历史回顾 三、细胞周期各时相的动态变化 四、细胞周期的调控 五、细胞周期得以进行的两大机制
提　纲 一、基本概念介绍 二、历史回顾 三、细胞周期各时相的动态变化 四、细胞周期的调控 五、细胞周期得以进行的两大机制 六、细胞周期的界面机制 七、肿瘤与细胞周期 八、常用的细胞周期检测方法 九、细胞周期同步化

2 一、基本概念介绍 细胞周期(cell cycle) 细胞周期调控(cell cycle regulation)
“细胞周期”也称“细胞分裂周期”，是指一个细胞经生长、分裂而增殖成两个所经历的全过程，通常可分为若干阶段，即G1期、S期、G2期和M期。细胞在G1期完成必要的生长和物质准备，在S期完成其遗传物质——染色体DNA的复制，在G2期进行必要的检查及修复以保证DNA复制的准确性，然后在M期完成遗传物质到子细胞中的均等分配，并使细胞一分为二。 细胞周期调控(cell cycle regulation) 生命是如何生长、生存、繁衍和死亡？在每一个生命个体中都存在一个精密的程序，或生物钟。生物钟决定着细胞是否、何时生长、分裂、或死亡。这就是细胞周期调控机制，它在相关基因的控制下，依据一定的规则和节奏运行着，调控细胞的生长、分裂和死亡。在胚胎细胞，细胞周期保持快速运行，在一些成年细胞中其运行慢得多，而在神经元细胞细胞周期几乎完全不运行。在生长过程中的细胞，如果细胞周期不能运行，结果是死亡。而在成熟细胞，细胞周期不正确的运行，结果则是肿瘤的发生。

3 2001 Nobel Prize 二、历史回顾 Leland H. Hartwell 1970s “Checkpoint”
Yeast genetics ~100 CDC genes Start gene Paul M. Nurse 1970s CDKs yeast Tim Hunt 1980s Cyclins Sea Urchins 2001 Nobel Prize

4 生命复制之谜的揭开 （1）1858年建立细胞理论： 生命的基本形式是细胞，机体由细胞构成，细胞的生长复制形成了生物体的生长繁衍，细胞的异常或死亡导致机体的疾病或死亡。 　（2）1951年发现了细胞分裂周期：G1 S G2 M G0 细胞生长中有两种形式---- 有丝分裂期和细胞间期 DNA合成前期（G1期） 细胞间期 DNA合成期（S期） DNA合成后期（G2期） 细胞周期 前期 中期 有丝分裂期（M期） 后期 末期

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7 细胞分裂周期图

8 （3）随着成熟刺激因子（maturation promoting factor, MPF），细胞周期素（cyclin），细胞周期素依赖性蛋白激酶(cyclin dependent kinase，CDK)的发现使对细胞周期及与肿瘤的发生发展关系的研究有了很大进展

9 Cell cycle is the universal process by which cells reproduce, and that it underlines the growth and development of all living organisms. G1---the gap before DNA replication S-----the DNA synthetic phase G2---the gap after DNA replication M----Mitotic phase The most important events of the cell cycle are those concerned with the copying and partitioning of the hereditary material, that is replicating the chromosomal DNA during S phase and separating the replicated chromosomes during mitosis. Controls operate that regulate onset of these events such as S phase and mitosis, and ensure that these events occur in the correct sequence, are coordinated with cellular growth, and are corrected for errors in their execution.

10 三、细胞周期各时相的动态变化 １、G1期（DNA合成前期，指有丝分裂完成到DNA合成之前的一段时间）
　RNA在此期大量合成，导致蛋白质量明显增加。S期所需的DNA复制相关的酶系，如DNA聚合酶，G1期向S期转变相关的蛋白质如触发蛋白、钙调蛋白、细胞周期蛋白等均在此期合成。 　　　蛋白质的磷酸化作用在G1期开始增加，这将有利于G1晚期染色体结构成分的重排。非组蛋白、一些蛋白激酶在G1期也可发生磷酸化，已知大多数蛋白激酶磷酸化发生于其丝氨酸或苏氨酸、酪氨酸部位。

11 触发蛋白是一种不稳定蛋白，它对细胞从G1期进入S期是必须的。只有当其含量积累到临界值，细胞周期才能朝DNA合成方向进行。
钙调蛋白是真核细胞内重要的钙受体，它调节细胞内钙的水平，钙调蛋白的含量，在G1晚期可达峰值，用抗钙调蛋白药物处理细胞，可延缓其从G1期到S期的进程。 G1期蛋白质量的增加，可能与蛋白质合成增强有关，而另一原因则可能使其降解的减弱。

12 ２、S期（DNA合成期，从DNA合成开始到DNA合成结束的全过程，是细胞增殖周期的关键阶段）
包括DNA聚合酶、DNA连接酶、胸腺嘧啶核苷酸激酶、核苷酸还原酶等。随着细胞由G1期进入S期，这些酶的含量或活性可显著增高 （２）DNA复制具有严格的时间顺序 通常，GC含量较高的DNA序列在早S期复制，晚S期复制的主要为ＡＴ含量高的DNA序列；就染色体而言，常染色质的复制较异染色质要早，典型的例子如人类女性的细胞中，当其它染色体都被复制完以后，才开始进行纯化的X染色体复制。

13 （３）S期是细胞合成的主要时相 此时细胞质中可出现大量的组蛋白mRNA，新合成的组蛋白从胞质进入胞核，与复制后的DNA迅速结合，但绕成核小体，进而形成具有两条单体的染色体。除了蛋白质合成以外，在S期细胞中不断进行着组蛋白的持续磷酸化。 （４）中心粒的复制也在S期完成 原本垂直的一对中心粒发生分离，各自在其垂直方向形成一个子中心粒，由此形成的两对中心粒在以后的细胞周期进程中，将发挥微管组织中心的作用，纺锤体微管，星体微管的形成均与此相关。

14 ３、G2期（DNA合成后期，从DNA复制完成到有丝分裂开始前的时期，为有丝分裂 进行物质条件）
为细胞分裂准备期，细胞中合成一些与M期结构功能相关的蛋白质，与核膜破裂，染色体凝集相关的成熟促进因子在此期合成。 微管蛋白G２期合成达高峰，为M期纺锤体微管的形成提供了丰富的来源。 已经复制的中心粒在G2期逐渐长大，并开始向细胞两极分离。 ４、M期（有丝分裂期，细胞经过分裂将染色体平均分配到两个子细胞中） 　　　 在此期细胞中，染色体凝集后发生姊妹染色单体的分离，核膜核仁破裂后再重建，胞质中有纺锤体收缩环出现，随着两个子核的形成，胞质也一分为二，由此完成细胞分裂。

15 G1期：为DNA合成准备所需要的RNA、 蛋白质、脂类、糖类等 G1早期：细胞的生长 G1晚期：为S期的DNA合成做准备 M期（有丝分裂期） DNA、RNA、蛋白质合成停止。 细胞发生一系列形态变化、结构建成。将加倍的DNA平均分配到两个子细胞中 G2期（DNA合成后期） 有活跃的RNA和蛋白质合成 微管蛋白，促有丝分裂因子（MPF） 中心粒向两极移动 S期（DNA合成期） DNA合成(复制) 染色体蛋白的合成：组蛋白、非组蛋白等 中心粒的复制

16 四、细胞周期的调控 1、 细胞周期调控蛋白（cell cycle- regulating protein)
细胞周期调控研究过程的重要事件---MPF的发现： MPF是一种在G2期形成，能促进M期启动的调控因子，称之为促细胞成熟因子或促细胞分裂因子（MPF)。 MPF由调节亚单位细胞周期素（ cyclin ）和催化亚单位细胞周期素依赖性蛋白激酶（CDK）组成。

17 2）细胞周期调控蛋白的种类 A、CDK类蛋白激酶：
CDK与细胞周期素结合才具有激酶的活性，故名细胞周期素依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase，CDK). 作用：CDK可将特定蛋白磷酸化，促进细胞周期运行。 在动物中已知7种CDK，CDK1-7。 B、细胞周期素（cyclin) 特点：在细胞周期中呈周期性变化。 作用：能与CDK结合，激活CDK，间接调节细胞周期运行。 已知30余种，在脊椎动物中为cyclinA1-2、B1-3 、C、 D1-3、E1-2、F、G、H等。

18 Cyclins与CDKs结合后，CDKs才具有活性，它们两者的结合使细胞周期有序进行。具体结合方式如下：

19 C、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI)
Ink4: P16ink4a, P15ink4b, P18ink4c, P19ink4d。特异性抑制cdk4-cyclin D1, cdk6-cyclin D1。 Kip：P21cip1、P27kip1、P57kip2，抑制大多数CDK的激酶活性。P21cip1还能与DNA聚合酶δ的辅助因子PCNA结合，直接抑制DNA的合成。 　　作用机制：未完全清楚，大多数CKI是通过直接与Thr160/161磷酸化后的CDK-cyclin复合物密切结合，直接抑制其蛋白激酶活性。 　　现较为肯定的是p21，其调控水平在基因转录的层面，当DNA损伤和细胞衰老时，具有转录因子作用的p53增高，抑制其蛋白激酶活性，阻滞细胞周期的进行。

20 Cell cycle engines and brakes.
Cyclin-dependent kinases (CDKs), made of a catalytic protein kinase subunit and a cyclin subunit, were shown to act as universal cell cycle regulators (engines) CDK inhibitors

21 3）M期CDK的激活 M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的积累。 结合M -cyclin的CDK1被Wee1（抑制因子）将Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK/cyclin不断积累。 在M期，Wee1的活性下降，CDC25磷酸酶使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障碍。 CDK的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶(CAK)的作用下完成的。

22 CDK activating 活性位点 抑制位点

23 2、细胞周期限制点（check point）
　由于某些环境因素的作用细胞周期出现故障或差错， 这些信号可是细胞停留在某些点上，称为限制点。 　　　主要检验点： G1/S限制点：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restriction point)。 S期限制点：DNA复制是否完成？ G2/M限制点：DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？ 中-后期限制点：纺锤体组装限制点。

24 Four checkpoints

25 单细胞生物的增殖取决于营养，多细胞生物细胞的增殖与信号途径有关。
3、细胞周期中的信号系统调控 　单细胞生物的增殖取决于营养，多细胞生物细胞的增殖与信号途径有关。 A、生长因子：是与细胞增殖有关的信号物质，已知几十种，多数能促进细胞增殖，又称有丝分裂原（mitogen），如EGF、NGF。 作用方式：旁分泌。 信号通路：ras途径，cAMP途径、磷脂酰肌醇途径。 B、抑素（chalone)是一种由细胞自身产生、分泌的，对细胞增殖起抑制作用的糖蛋白，与膜上的受体结合，引起信号转换及在胞内传递，影响细胞周期相关的蛋白的表达。 具有严格的组织特异性和细胞周期阶段特异性。 作用于G1期的抑素可阻止细胞进入S期，称S因子。 作用于G2期的抑素可阻止细胞进入M期，称M因子。

26 五、 细胞周期得以进行的两大机制 细胞周期得以进行的核心机制是在一系列cyclin时相起伏的调控下，相应的CDK依次激活，驱使细胞通过G1,S,G2期，达到M期，细胞一分为二，实现忠于亲代的细胞复制。这一过程的顺利完成取决于是否启动和能否忠于运行，达到忠实复制，是细胞周期调控的两大生物学机制。

27 1、细胞周期的启动机制 细胞周期能否启动进行细胞增殖，主要的调控点在G1期，它决定细胞是否通过G1期进入S期。
这一调控点首先在芽殖酵母的研究中被认识，人们称其为“起始点”（START）。一旦细胞通过start,它们势必进入S期，完成整个细胞分裂周期。因此start有人称之为酵母细胞周期的“决定点”。 在人体细胞增殖中，在G1期存在相似的调控机制。在G1期较晚时，也有一个决定点，称为“限制点”（restriction point），与酵母的START功能类似，不同的是，人类细胞是否通过“限制点”，进入细胞周期，主要受与细胞增殖有关的细胞外生长因子的调控，而不是营养素。只要有相应的生长因子存在，细胞就能通过R点进入S期，完成整个细胞周期。回到G0/1期。相反，如果细胞在G1期就缺乏相应的生长因子，细胞周期的运行将停止在R点，此时细胞进入“安静状态，称之为G0期。

28 连接信号转导与细胞周期有两条途径，一是cyclin－D/CDK4，二是cyclinE/CDK2。二者都是G1期进行的限速步骤，即cyclinD或cyclinE的过度表达，均能缩短G1期时间或加速G1期进行

29 抑癌基因p53在人类细胞周期G1期检测点起着关键性作用。还存在G2期检测点。 时相次序监测点
2、细胞周期的监控机制 DNA损伤检测点 　抑癌基因p53在人类细胞周期G1期检测点起着关键性作用。还存在G2期检测点。 时相次序监测点 MPF(有丝分裂促进因子)，可以诱导所有细胞周期时相的细胞核发生染色体凝集。 SPF(S期促进因子)，只能诱发G1期细胞进入S期而不能使G2期细胞进入M期。

30 六、细胞周期的界面机制 1、细胞周期与DNA修复
所有的真核细胞中都高度保守者这一整套完整的精密机制，承担着DNA损伤、错误地发现，并将其信号传递给相应的机制，，去阻滞细胞周期的运行，并同时进行DNA损伤的修复。然后视修复情况，细胞基因的突变。决定继续分裂或死亡，执行一系列细胞的重要生命活动。 DNA修复方式 切除修复 错配修复 : 将局部一段错配的寡核苷酸链切除，重新合成之 全基因组切除修复 转录切除修复 碱基切除修复 核苷酸切除修复

31 2、细胞周期与细胞凋亡 细胞凋亡存在有细胞周期特异性，不同因素诱导的细胞凋亡发生在细胞周期不同的时相 3、细胞周期与细胞分化 细胞周期不仅与细胞增殖、细胞凋亡有关，还调控着细胞分化

32 七、肿瘤与细胞周期 1、细胞周期与肿瘤的关系
目前从多方面对肿瘤进行了深入研究（流行病学、病因学、遗传），肿瘤是多因素，多步骤，多阶段的。但是肿瘤的恶性增生从生物学角度看，主要表现在两方面：一是肿瘤细胞的不灭性，即细胞凋亡障碍；二是细胞增殖失控，程序发生紊乱，只是增殖超常加快。这两方面均已成为肿瘤发生发展研究的热点。 通过研究发现了1.存在于正常细胞内的原癌基因发生错误转变为癌基因2.一些基因失活后正常细胞转变为癌细胞—抑癌基因。经过70年代的癌基因时代，80年代的抑癌基因时代90年代的多基因时代或癌基因蛋白网络时代，提出了一系列的理论：肿瘤多步骤里论、DNA修复理论、细胞凋亡理论，进一步阐明细胞周期核心机制、细胞周期启动机制、细胞周期检测点机制。

33 2、 肿瘤细胞中细胞周期检控机制的破坏 细胞周期中检测DNA损伤的检测点至少有两处：
2、 肿瘤细胞中细胞周期检控机制的破坏 细胞周期中检测DNA损伤的检测点至少有两处： 一处在G1-S过渡期：控制进入S期的检测点，防止DNA受损细胞进入S期的DNA复制。 另一处在G2-M过渡期：控制进入M期的检测点，防止受损的DNA和未完成复制的DNA进入有丝分裂。 这些DNA损伤检测点的主要机制有二：一是p53依赖性机制，另一是p53非依赖性机制每一个完整的检测点应由四部分组成，即发现或传感器（detect或sensor）、制动或拘留（stop or arrest）、修复（repair）、决定（decision，divide or death）。理论上说监测点的任何一部分出了问题，都会导致功能的异常，结果是遗传不稳定，基因受损的细胞存活和复制或细胞遗传物质的改变，如此细胞多步骤进化，最终成为失控性生长的肿瘤细胞。

34 肿瘤的发生发展过程中，监控机制破坏的典型例子是P53基因的突变。大约50%的人类肿瘤都存在P53基因的突变，说明DNA损伤检测点在肿瘤的发生、发展中，具有重要的位置。
3、肿瘤细胞中细胞周期驱动机制的破坏 细胞周期监测点功能的减弱，导致突变基因的累积和正常细胞的进化，只有当这些累积的突变基因破坏了细胞周期驱动机制，细胞才能进入失控性生长的境界。 人们把细胞周期驱动机制比作一辆汽车或引擎，驱使其运行的因素好比“油门”；制动器运行的机制犹如“刹车”。持续地踏住“油门” 或“刹车”失灵，终将失控。这正是致变因素导致基因突变，检测点基因突变，突变基因累积，驱动机制失控的必然结果。

35 From: British J. Cancer 87:129-133

36 Mutation of G1/S regulators in human cancer
Only alternations that occur in more than 10% of primary tumors have been considered. Numbers represent the percentage of tumors with alternations in any of the listed cell cycle regulators. The loci in which specific genetic or epigenetic alternations have been defined are in pink. The alternations for which no mechanistic explanation has been provided are in yellow. Alternations relevant for tumor prognosis are indicated by asterisk. 1:

37 八、常用的细胞周期检测方法 流式细胞术 PI(碘化丙锭),可以与细胞内DNA和RNA结合,采用RNA抑制剂将RNA消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。 由于细胞周期各时相的DNA含量不同,因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期,S期和G2/M期,并可通过特殊软件计算各时相的百分率: G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N), G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N), S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。 值得注意的是,PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞),在标本制备时,必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性,才能使PI进入细胞内与细胞内的核酸结合。乙醇通常为终浓度为70%的冷乙醇。

38 D、方法： 将肿瘤细胞以1×106接种于60mm培养板，80％汇合后传代。 24－72小时后用胰酶消化收集细胞，PBS洗两遍，弃上清，加入70％预冷乙醇中，吹打均匀，4℃固定12小时以上。 PBS洗涤去乙醇，1000rpm, 5min，洗两遍。 0.5 ml PBS重悬细胞，加入PI和 RNaseA至终浓度50µg/ml，37℃ 温浴30 min。 用流式细胞仪测定周期。 PI：碘化丙啶，以PBS配成1mg/ml，4℃保存。 RNaseA：10mg/ml

39 Normal Cell Cycle s s M G2 G2 M G0 G1 G0 G1 DNA Analysis 2N 4N
Count s G2 M 2N 4N 200 400 600 800 1000 DNA content Purdue University Cytometry Laboratories

40 DNA content by flow cytometry
Events The Cell Cycle DNA content by flow cytometry G1 S phase M G0/1 G1 G2 G2/M 1 S DNA content Deconvolution into cell cycle phases

41 Measurement of sub G0/1 apoptotic particles
Events G0/1 Apoptosis Events S G2/M DNA content

42 10% 1% 90% 4% 4 hr, control 28 hr, control 28 hr, irradiated
28 hr, aphidicolin G1: 60.6% S: 34.9% G2/M: 4.5% G1: 94.1% S: 1.1% G2/M: 4.8% G1: 96.6% S: 1.6% G2/M: 1.8% G1: 94.1% S: 1.5% G2/M: 4.4% 10% 1% 90% 4%

43 of histone gene expression and inhibition of S phase entry (1)
Induction of p21 results in parallel loss of NPAT foci, down-regulation of histone gene expression and inhibition of S phase entry (1) A. O hr 6 hr 12 hr 18 hr 24 hr 93.5% 86.5% 58.5% 21.0% 2% B. G1: 47.2% S: 34.2% G2/M: 18.7% G1: 46.3% S: 34.9% G2/M: 18.8% G1: 51.9% S: 29.8% G2/M: 18.4% G1: 56.1% S: 23.9% G2/M: 20.1% G1: 57.8% S: 17.8% G2/M: 24.5% G1: 58.5% S: 12.5% G2/M: 29.0% G1: 60.2% S: 6.8% G2/M: 33.0% G1: 60.0% S: 3.9% G2/M: 36.1% G1: 62.1% S: 2.4% G2/M: 35.5% 0 hr 2 hr 4 hr 6 hr 8 hr 10 hr 12 hr 14 hr 24 hr

44 2、BrdU掺入法 (S phase) B、染色要点：短时标记 A、原理： C、主要用于检测生长中的细胞(S期)
在含有5溴脱氧尿嘧啶核苷（5～Bromodeoxyuriding，BrdU）的培养基中，BrdU能取代胸腺嘧啶脱氧核糖核苷（TdR）而渗入到新复制的DNA子链中， B、染色要点：短时标记 C、主要用于检测生长中的细胞(S期)

45 Cell cycle-dependent change of NPAT loci in WI38 cells
Prometaphase Anaphase

46 九、细胞周期同步化 细胞同步化(synchronization)是指在自然过程中发生或经人为处理造成的细胞周期同步化 1、自然同步化
多核体：如：粘菌、疟原虫。 某些水生动物的受精卵：如海胆、海参、两栖类。 增殖抑制解除后的同步分裂：如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。

47 2、人工同步化 1) 选择同步化 A. 有丝分裂选择法：M期细胞与培养皿的附着性低，振荡脱离器壁收集。
优点：操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害。 缺点：获得的细胞数量较少（分裂细胞约占1%～2%）。 B. 细胞沉降分离法： M期细胞体积大，可用离心分离。 优点：可用于任何悬浮培养的细胞。 缺点：同步化程度较低。

48 2) 诱导同步化 DNA合成阻断法：选用DNA合成的抑制剂，可逆地抑制DNA合成。常用TDR双阻断法： 在细胞处于对数生长期的培养基中加入过量TDR（Hela 2mol/L；CHO 7.5mol/L）。S期细胞被抑制，停在G1/S交界处。移去TDR，释放时间大于TS时，再次加入过量TDR。 优点：同步化程度高 缺点：产生非均衡生长，个别细胞体积增大。 中期阻断法 用秋水仙素等细胞分裂抑制剂将细胞阻断在中期。 优点：无非均衡生长现象， 缺点：可逆性较差。 血清饥饿法