动物细胞工程.

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1 动物细胞工程

2 一、教学目标： 1、简述动物细胞培养的过程、条件及应用 2、简述通过动物体细胞核移植技术克隆动物的过程及应用前景 3、举例说出动物细胞融合与单克隆抗体的原理和应用 二、教学重点和难点： 1.动物细胞培养的过程及条件 2.用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 3.单克隆抗体的制备和应用

3 思考： 强调： 动物细胞工程常用的技术手段： 植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养、 植物体细胞杂交
植物组织培养、 植物体细胞杂交 动物细胞工程常用的技术手段： 动物细胞培养、 动物细胞核移植、 动物细胞融合、 单克隆抗体 强调： 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。

4 问题讨论: 取相应的细胞，大量培养，即通过动物细胞培养
材料一：对于大面积烧伤的病人，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，且会产生排斥反应。怎样才能获得大量的自体健康皮肤呢？ 材料二：单细胞产生的蛋白质很少，怎样才能获得大量的分泌蛋白呢？ 取相应的细胞，大量培养，即通过动物细胞培养

5 一、动物细胞培养 阅读P44， 思考： 1、为什么要进行动物细胞培养？ 2、什么是动物细胞培养？ 3、动物细胞培养的原理是什么？ 4、怎样培养动物细胞？需要哪些条件？

6 一、动物细胞培养 1、概念： 动物细胞培养就是从动物机体内取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。

7 动物细胞培养 原

8 动物细胞培养的过程 动物组织 细胞悬浮液 细胞贴壁(单层) 10-50代细胞 获得不死性 剪碎 原代培养 胰蛋白酶处理 胰蛋白酶处理
核型改变（突变） 10-50代细胞 获得不死性 分瓶传代培养 继续传代培养

9 探究 1、为何动物细胞培养过程将组织分散成单个细胞的呢？ 成块的组织细胞靠在一起,彼此限制了细胞的生长和增殖
分散后，易于吸收营养，排出代谢废物 2、如何将动物组织分散成单个的细胞呢？ 先用剪刀剪碎,后用蛋白酶处理 3、胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？ 胰蛋白酶水解蛋白质 细胞间的成份是蛋白质

10 探究 蛋白质和脂质 4、细胞膜的主要成份是什么？ 能 5、胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？
6、既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？ 注意时间的控制 7、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？ 不能，因为动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶( )的活性较高。 8、动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因？ 胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛

11 探究 这样的过程叫做传代培养 9、动物细胞培养瓶内表面为何要光滑、无毒？ 易于培养细胞贴壁，进行生长增殖
10、培养瓶中的细胞培养到什么时候就不再分裂、增殖？ 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞分裂就会停止分裂增殖，这种现象叫接触抑制。 11、如此时细胞数量并未达到人们的需求，应该怎样办？ 将贴满细胞壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖。 这样的过程叫做传代培养

12 探究 12、如何理解原代培养和传代培养？ 上述过程中，在第一培养瓶中培养就是原代培养，之后转移到其它培养瓶中培养就是传代培养
13、传代培养的细胞都能一直传代下去吗？ 不都能 14、有些为何能一直传下去吗？ 发生突变，朝着癌细胞方向发展 15、动物细胞培养就是为了得到这些细胞吗？ 不是 16、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？ 保存10代以内的细胞，因为10－50代部分细胞的细胞核型可能发生变化，有少部分遗传物质发生改变，发生突变向癌细胞方向发展。

13 有关概念 原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。
传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。

14 有关概念: 细胞贴壁： 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。 要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。
细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。

15 探究： 多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的知识，认为体外培养细胞应该模拟内环境的哪些内容呢？

16 含蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等及一些未知的营养物质，保证细胞顺利的生长增殖
3、条件： 1、无菌、无毒 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液） 2、全部的营养物质 （葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。） 3、适宜的温度和PH值 含蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等及一些未知的营养物质，保证细胞顺利的生长增殖 36.5+（-）0.5度, 4、必要的气体条件 O2和CO2（95%空气和5% CO2 ） 维持培养液的PH

17 植物细胞和动物细胞培养的比较 植物细胞的全能性 细胞有丝分裂 固体培养基 液体培养基 蔗糖、植物激素 葡萄糖、动物血清 植株 相同细胞
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养 原理 植物细胞的全能性 细胞有丝分裂 培养基性质 固体培养基 液体培养基 蔗糖、植物激素 葡萄糖、动物血清 培养基特有成分 培养结果 植株 相同细胞 快速繁殖、培育无病毒植株等 获得细胞或细胞产物 培养目的

18 4、应用 大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体） 作为基因工程中的受体细胞
培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性 用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据

19 (1)①过程植物细胞原生质体的分离需经过酶解，其中“酶解”所用的酶应该包括________________。
野生马铃薯品种的植株具有较强的抗病、抗虫、抗盐碱、抗寒能力，但块茎不能食用。俄、德、芬兰专家共同做实验研究，用野生马铃薯与马铃薯的体细胞进行杂交，培育出了生活能力强的杂交系马铃薯。据图分析回答问题： (1)①过程植物细胞原生质体的分离需经过酶解，其中“酶解”所用的酶应该包括________________。 (2)②过程可用聚乙二醇(PEG)，其目的是______________________。 (3)请用文字和箭头表示出④⑤技术过程的实验流程：_____________________________________________________________。 由此过程可以看出植物细胞有形成完整个体的可能性，这是__________________________的表现。 (4)在培养基上培养一段时间后，原生质体会再生出细胞壁。可以取样，通过__________________________实验来鉴别细胞壁是否已经再生。 (5)请说明运用植物体细胞杂交法的最大好处：____________________________。 纤维素酶、果胶酶 诱导原生质体融合 融合细胞 愈伤组织 胚状体幼苗 植物细胞具有全能性 植物细胞的质壁分离与复原 可以克服不同生物远缘杂交不亲和的障碍

20 （07年海南）某研究小组进行药物试验时，以动物肝细胞为材料，测定药物对体外培养细胞的毒性。供培养的细胞有甲、乙两种，甲细胞为肝肿瘤细胞，乙细胞为正常肝细胞。 请回答下列有关动物细胞培养的问题：   （1）将数量相等的甲细胞和乙细胞分别置于培养瓶中培养，培养液及其它培养条件均相同。一段时间后，观察到甲细胞数量比乙细胞数量__________。 （2）在动物细胞培养时，通常在合成培养基中加入适量血清，其原因是_________ __ 。细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是____________________________。 （3）在两种细胞生长过程中，当乙细胞铺满瓶壁时，其生长____________。药物试验需要大量细胞，两种细胞频繁传代，甲细胞比乙细胞可以传代的次数更_______。若用动物的肝脏组织块制备肝细胞悬液，需用___________消化处理。 （4）为了防止细胞培养过程中细菌的污染，可向培养液中加入适量的_____________。 （5）已知癌细胞X过量表达与肝肿瘤的发生密切相关，要试验一种抗肿瘤药物Y对甲细胞生长的影响，可将甲细胞分为A．B两组，A组细胞培养液中加入___________，B组细胞培养液中加入无菌生理盐水，经培养后，从A．B两组收集等量细胞，通过分别检测X基因在A．B两组细胞中的________或_______合成水平的差异，确定Y的药效。 多 血清可以补充合成培养基中缺乏的物质 维持培养液pH 停止 多 胰蛋白酶 抗生素 Y mRNA 蛋白质

21 小结 一、动物细胞培养 1、概念 2、过程 3、条件 4、应用

22 多莉羊的培育过程 Ａ母绵羊 Ｂ母绵羊 卵母细胞 乳腺细胞 细胞核 细胞质 融合后的卵细胞 细胞核移植 卵裂 早期胚胎 胚胎移植 C母绵羊子宫
分娩 妊娠

23 二、动物体细胞核移植技术: 将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。 用核移植的方法得到的动物称为克隆动物 胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易 克隆：无性繁殖 胚胎细胞核移植 核移植 体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难 体细胞核移植（难度高）

24 动物细胞培养

25 一、体细胞核移植的过程 归纳： 1.整个过程包括细胞核移植和胚胎移植
供体细胞（供核） 动物细胞培养 体细胞 细胞融合 杂种细胞 注入 去核 卵母细胞（减２中期：供质） 无核卵母细胞 胚胎移植 新个体(与供体相同的个体) 构建重组胚胎 代孕母体 归纳： 1.整个过程包括细胞核移植和胚胎移植 2.取减Ⅱ中期的卵母细胞：体积大，易操作；含有促进细胞核表达全能性的营养物质；细胞核易去除

26 1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？
提示：为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。

27 2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？
提示：培养的动物细胞一般当传代至10～50代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。

28 3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？
提示：克隆动物绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。用教材中所述的方法克隆的动物不是供核动物完全相同的复制。此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。

29 二、体细胞核移植技术的应用前景 1、加快家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁殖 2、保护濒危物种 3、利用生物反应器生产医用蛋白
4、异种移植的供体 5、组织器官移植

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31 三、体细胞核移植技术存在的问题 成功率低 存在健康问题

32 （一）思考与探究 1.幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于培养？思考一下，这是什么道理？
提示：细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。

33 2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？
提示：脱分化又称去分化，是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程。植物的任何一部分，甚至单个细胞都具有长成完整植株的能力。但要发育成完整植株，必须先脱分化，脱分化的细胞具有发育成任何组织的能力，然后进行再分化，形成完整植株。植物细胞培养主要用于农林生产中的作物、苗木育种，快速繁育种苗、培育无病毒植株等，这就要求植物的组织或细胞先进行脱分化。动物细胞的培养有各种用途，一般而言，动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。

34 3、能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。
提示：可以用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达。卢辛达的产奶量很高，说明它有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。

35 4、如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？
提示：首先从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。

36 5.体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。
提示：在研究方面，克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。 在应用上，生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。

37 动物细胞融合与 单克隆抗体

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39 思考下列问题： 1、什么叫动物细胞融合？植物体杂交技术与动物细胞融合有什么不同呢？
2、动物细胞在结构上有何区别？这与它们杂交或融合过程有什么影响？ 3、动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理是否相同？两者的融合过程是否也一样？

40 1.概念 2.过程 一、动物细胞融合 细胞A 细胞B 杂交细胞
也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程，融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞 2.过程 细胞A 细胞B 物理法 化学法 灭活的病毒 如：仙台病毒 杂交细胞

41 动物细胞融合

42 不能，不灭活的病毒会感染细胞，而不能诱导细胞融合
思考讨论： 1.为什么灭活的病毒诱导细胞融合？ 因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。 2.不灭活的病毒能作为诱导剂吗？ 不能，不灭活的病毒会感染细胞，而不能诱导细胞融合

43 3.意义 细胞融合技术突破了有性杂交方法的局限，使远源杂交成为可能 4.应用 应用于研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等（制备单克隆抗体）

44 动物细胞融合 去壁 融合 组培 动物细胞A 动物细胞B 物理法 生物法： 灭活的病毒 化学法 植物体细胞杂交 植物细胞A 植物细胞B
杂种细胞 原生质体A 原生质体B 融合 物理法 杂种细胞 生物法： 灭活的病毒 化学法 愈伤组织 组培 杂种植株 植物体细胞杂交

45 植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较 比较项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合 细胞融合原理 细胞膜的流动性、植物细胞的全能性 细胞膜的流动性
细胞融合的方法 去除细胞壁后诱导原生质体融合 使细胞分散后诱导细胞融合 诱导方法 物理（离心、振荡、电刺激） 化学（聚乙二醇） 物理、化学方法（同左） 灭活的病毒 用途 获得杂种植株 制备单克隆抗体

46 二、单克隆抗体 什么是抗体？ 抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。

47 B淋巴细胞与抗体的关系： １．B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。 ２．每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。
所以传统的抗体的生产方法及缺陷是什么？ 怎样解决这个问题？ 大量单一的抗体

48 如何大量生产单克隆抗体？ 利用B淋巴细胞产生抗体的功能 利用骨髓瘤细胞无限增殖的特性
融合方式？ 如何大量生产单克隆抗体？ 利用B淋巴细胞产生抗体的功能 利用骨髓瘤细胞无限增殖的特性 利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有B淋巴细胞和骨髓瘤细胞特性的杂交瘤细胞 利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞 如何筛选？

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51 单克隆抗体制备过程 抗原 B-B细胞 B淋巴细胞 效应B细胞 人工 选择性培养基 刺激 瘤-瘤细胞 杂交瘤细胞 诱导 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞
克隆化培养 抗体检测 体外培养 单克隆抗体 杂交瘤细胞 小鼠腹腔内增殖

52 单克隆抗体 　　由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。

53 单克隆抗体的应用 与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。 应用主要有： 1、临床诊断
2、作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”治疗肿瘤 　　资料：目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病，用单克隆抗体作为诊断手段，是一个必然趋势。另外，用单克隆抗体做体内诊断，借以鉴别和定位体内“病灶”也引起人们的注意，目前，主要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。

54 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案
B 体外培养 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 足够数量的细胞群 注射到 小鼠腹腔 A C 制备单克隆抗体 2、该方案能达到预期效果吗？为什么？ 4、图中B为________过程，常用_________作为诱导剂，该细胞继承___________的遗传特性，既能__________,又能___________。 1、该实验方案的目的是__________ 3、A是从小鼠的脾脏中取得_______,该细胞能够产生______ 5、C过程指细胞培养，该过程包括_____培养和_____培养两个阶段. 抗体 B细胞 动物细胞融合 灭活病毒 双亲细胞 分泌单一抗体 无限增殖 原代 传代

55 练一练 A 、 B细胞为动物细胞,请据图回答问题: A细胞 C细胞 D细胞 B细胞 (1)若A细胞为骨髓瘤细胞B细胞为淋巴细胞,那么D细胞称为 细胞,D细胞具有两个亲本细胞的特征,一方面因具有骨髓瘤细胞的 性质,通过 方式产生大量细胞,我们称之为 过程;另一方面能分泌大量的抗体,我们把该过程分泌的抗体称 杂交瘤 连续分裂 有丝分裂 单克隆 单克隆抗体

56 练一练 (2)D细胞中产生的抗体其化学本质是 ,合成该物质的场所是 ,它是由 控制合成的,合成过程包括 和 两个重要步骤.
球蛋白 核糖体 基因 转录 翻译 (3)D细胞中产生的抗体具有 作用,与血清抗体相比其优越之处在于 强, 高. 免疫 特异性 灵敏度 (4)若A为人细胞,B为鼠细胞,用同位素标记A细胞膜上的蛋白质,B不标记,在C细胞时,检测结果发现整个细胞一半有放射性另一半没有.在D细胞时,检测结果发现整个细胞都有放射性,请解释原因 构成细胞膜的蛋白质分子大都可以流动

57 5．(2010·福建理综，32)红细胞生成素(EPO)是体内促进红细胞生成的 一种糖蛋白，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，目前临床上使用的红细胞生成素主要来自于基因工程技术生产的重组人红细胞生成素(rhEPO)，其简要生产流程如下图。请回答： (1)图中①所指的是________技术。 (2)图中②所指的物质是________，③所指的物质是________。 (3)培养重组CHO细胞时，为便于清除代谢产物，防止细胞产物积累对细胞自身造成危害，应定期更换________。 (4)检测rhEPO的体外活性需用抗rhEPO的单克隆抗体。分泌该单克隆抗体的________细胞，可由rhEPO免疫过的小鼠B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细 胞融合而成。 PCR mRNA rhEPO 培养液 杂交瘤

58 【例3】 (潍坊质检)人CD20单克隆抗体是治疗一些恶性肿瘤的特效药
物，目前主要是通过培养哺乳动物细胞的方式生产。我国科学家已经 培育出世界上第一头转入了CD20抗体基因的转基因牛，可以从它产 的牛奶中直接提取CD20抗体。这项技术成熟后，有望使这一特效药 的生产成本降至现在的1/10。请回答： (1)单克隆抗体的制备过程需先将____________________和 ______________融合，这一过程的诱导方法与植物体细胞杂交不同的 是_________________。 (2)动物细胞培养需要在含__________________混合气体的培养箱中进 行，培养液中通常需加入________________等一些天然成分。 (3)转基因技术的核心是______________________。该过程用到的工 具酶有 ________________________和________________。 经过免疫的B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 用灭活的病毒诱导 95%空气加5%CO2 血清、血浆 基因表达载体的构建 限制酶 DNA连接酶

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60 小结 动物细胞培养过程 两个过程 单克隆抗体制备过程 一个诱导细胞融合的新方法－－灭活病毒 三个“一” 一个新细胞－－杂交瘤细胞
一个优势－－单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势

61 动物细胞培养 动物细胞工程常用技术 核移植 动物细胞融合 单克隆抗体技术

62 1.动物细胞工程技术的基础是：（　　　　） 　A．动物细胞融合 　B．胚胎移植 　C．动物细胞培养 　D．核移植 Ｃ

63 ２．在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（　　）
A．结果是相同的 B．杂种细胞的形成过程基本相同 C．操作过程中酶的作用相同 D．诱导融合的手段相同 Ｂ

64 ３. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞
诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞， 在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（ ） ①淋巴细胞　 ②小鼠骨髓瘤细胞　 ③B淋巴细胞自身融合细胞　 ④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞　 ⑤杂交瘤细胞 A． ②④ B．①③⑤　　 C． ①②③④ 　 D．②③ C

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67 （1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是___________。
(07年山东)继哺乳动物乳腺发生器研发成功后，膀胱生物发生器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答： （1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是___________。 （2）进行基因转移是，通常要将外源基因转入___________ 中，原因是_____________。 （3）通常采用_______技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组 （4）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的________细胞中特异表达。 （5）为使外源基因在后代长期保持，可将转基因小鼠细胞的_____转入________细胞中构成重组细胞，使其发育成与供体具有相同性状的个体。该技术称为_______。 显微注射 受精卵（或早期胚胎） 受精卵（或早期胚胎）具全能性可使外源基因在相应组织细胞表达 DNA分子杂交 膀胱上皮 细胞核 去核的卵 核移植

68 细胞核 去核 重组胚胎 子宫 不足 促性腺 动物体细胞核 A 两 雌 不同
（07年宁夏）现有A和B两个肉牛品种，A品种牛的细胞组成可表示为A细胞核、A细胞质，B品种牛则为B细胞核、B细胞质。 （1）如果要获得一头克隆牛，使其细胞由A细胞核和B细胞质组成，基本步骤是，从A品种牛体内取出体细胞，进行体外培养。然后再从培养细胞中取出_______注入B品种牛的 _________卵母细胞，经过某处刺激和培养后，可形成胚胎，该胚胎被称为_______，将该胚胎移入代孕母牛的_______中，通过培育可达到目的。 （2）一般来说，要想大量获得这种克隆牛比较难，原因之一是卵母细胞的数量______，为解决这一问题，可以用______激素处理B品种母牛。 （3）克隆牛的产生说明_ _ _ 具有全能性。克隆牛的性状主要表现____品种牛的特征。由A、B两品种杂交得到的牛与克隆牛相比，杂交牛细胞核的遗传物质来自______个亲本，细胞质来自______性亲本，克隆牛和杂交牛的遗传物质组成______（相同，不同）。 细胞核 去核 重组胚胎 子宫 不足 促性腺 动物体细胞核 A 两 雌 不同

69 （07年江苏）很久以前科学家在土壤中发现了某种细菌能制造一种对昆虫有毒的蛋白质，当时许多人就想把编码这一蛋白质的基因(抗虫基因)转移到农作物中，以降低昆虫对农作物造成的危害。20世纪90年代，美国科学家采用基因工程技术首次培育出抗虫玉米新品种。下图为这一转基因玉米的主要培育过程。 (1)获得特定目的基因的途径除了从该细菌中直接分离抗虫基因外，还可以 。将目的基因与运载体结合时必须用 酶和DNA连接酶。在基因工程中，常用的运载体有 等，而作为运载体必须具备相应的条件，例如应具有 以便进行筛选。 (2)由转基因玉米细胞经过 形成愈伤组织，然后发育成胚状体和试管苗。若要制备转基因玉米的人工种子，可选择上述实验过程中的 再包裹合适的 等。 人工合成 同种限制 质粒(或动植物病毒或噬菌体等) 标记基因 脱分化 胚状体 人造种皮

70 （07年海南）已知SARS是由一种RNA病毒感染所引起的疾病。SARS病毒表面的S蛋白是主要的病毒抗原，在SARS病人康复后的血清中有抗S蛋白的特异性抗体。某研究小组为了研制预防SARS病毒的疫苗，开展了前期研究工作。其简要的操作流程如下： （1）实验步骤①所代表的反应过程是____________________。 （2）步骤②构建重组表达载体A和重组表达载体B必须使用限制性内切酶和_____ 酶，后者的作用是将限制性内切酶切割的_________和_________连接起来。 （3）如果省略步骤②而将大量扩增的S基因直接导入大肠杆菌，一般情况下，不能得到表达的S蛋白，其原因是S基因在大肠杆菌中不能________，也不能________ ___。 （4）为了检验步骤④所表达的S蛋白是否与病毒S蛋白有相同的免疫反应特性，可用_________ _ __ 与_________ 进行抗原——抗体特异性反应实验，从而得出结论。 （5）步骤④和⑥的结果相比，原核细胞表达的S蛋白与真核细胞表达的S蛋白的氨基酸序列_______（相同、不同），根本原因是_____________________________________________________________。 逆转录 DNA连接 载体 S基因 复制 合成S基因的mRNA 大肠杆菌中表达的S蛋白 SARS康复病人血清 相同 表达蛋白质所用的基因相同

71 （07年海南）某研究小组进行药物试验时，以动物肝细胞为材料，测定药物对体外培养细胞的毒性。供培养的细胞有甲、乙两种，甲细胞为肝肿瘤细胞，乙细胞为正常肝细胞。 请回答下列有关动物细胞培养的问题：   （1）将数量相等的甲细胞和乙细胞分别置于培养瓶中培养，培养液及其它培养条件均相同。一段时间后，观察到甲细胞数量比乙细胞数量__________。 （2）在动物细胞培养时，通常在合成培养基中加入适量血清，其原因是_________ __ 。细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是____________________________。 （3）在两种细胞生长过程中，当乙细胞铺满瓶壁时，其生长____________。药物试验需要大量细胞，两种细胞频繁传代，甲细胞比乙细胞可以传代的次数更_______。若用动物的肝脏组织块制备肝细胞悬液，需用___________消化处理。 （4）为了防止细胞培养过程中细菌的污染，可向培养液中加入适量的_____________。 （5）已知癌细胞X过量表达与肝肿瘤的发生密切相关，要试验一种抗肿瘤药物Y对甲细胞生长的影响，可将甲细胞分为A．B两组，A组细胞培养液中加入___________，B组细胞培养液中加入无菌生理盐水，经培养后，从A．B两组收集等量细胞，通过分别检测X基因在A．B两组细胞中的________或_______合成水平的差异，确定Y的药效。 多 血清可以补充合成培养基中缺乏的物质 维持培养液pH 停止 多 胰蛋白酶 抗生素 Y mRNA 蛋白质

72 （07全国卷II）已知番茄的抗病与感病、红果与黄果、多室与少室这三对相对性状各受一对等位基因的控制，抗病性用A、a表示，果色用B、b表示、室数用D、d表示。
为了确定每对性状的显、隐性，以及它们的遗传是否符合自由组合定律，现选用表现型为感病红果多室和_______ _____两个纯合亲本进行杂交，如果F1表现抗病红果少室，则可确定每对性状的显、隐性，并可确定以上两个亲本的基因型为___________和___________。将F1自交得到F2，如果F2的表现型有_______种，且它们的比例为__ __ __ ___ _ _ _ ，则这三对性状的遗传符合自由组合规律。 若采用植物组织培养技术，从上述F1番茄叶片取材制备人工种子、繁殖种苗，其过程可简述为如下5个步骤： 上述过程中去分化发生在第________步骤，再分化发生在第_______步骤，从叶组织块到种苗形成的过程说明番茄叶片细胞具有__________________________。 抗病黄果少室 aaBBdd AAbbDD 8 27：9：9：3：3：3：1 番茄 叶片 叶组织块 愈伤组织 有生根发芽能力的胚状结构 人工种子 种苗 a b c d e b c 全能性

73 植物组织培养技术 1切取 形成层 2无菌接种 脱分化 3诱导愈伤组织 的形成 5培养室培养 再分化 6移栽 4试管苗的形成

74 植物组织培养技术 过程 外植体 离体的植物器官、组织或细胞 脱分化 愈伤组织 再分化 根、芽(胚状体) 植物体 植物激素：
细胞分裂素、生长素 愈伤组织 再分化 根、芽(胚状体) 植物体

75 过程 植物体细胞杂交技术 植物细胞的融合 去壁 融合 融合成功的标志 脱分化 再分化 植物组织培养 离心、振动、电刺激、 聚乙二醇
纤维素酶和果胶酶 融合 离心、振动、电刺激、 聚乙二醇 融合成功的标志 脱分化 再分化 植物组织培养

76 动物细胞培养 动物细胞培养 原

77 动物细胞培养的过程 动物组织 细胞悬浮液 细胞贴满瓶壁(10代) 10-50代细胞 获得不死性 剪碎 原代培养 胰蛋白酶处理 胰蛋白酶处理
核型改变（突变） 10-50代细胞 获得不死性 分瓶传代培养 继续传代培养

78 体细胞核移植技术 动物细胞培养

79 体细胞核移植的过程 归纳： 1.整个过程包括细胞核移植和胚胎移植
供体细胞（供核） 动物细胞培养 体细胞 细胞融合 杂种细胞 注入 去核 卵母细胞（减２中期：供质） 无核卵母细胞 胚胎移植 新个体(与供体相同的个体) 构建重组胚胎 代孕母体 归纳： 1.整个过程包括细胞核移植和胚胎移植 2.取减Ⅱ中期的卵母细胞：体积大，易操作；含有促进细胞核表达全能性的营养物质；细胞核易去除

80 动物细胞融合

81 单克隆抗体制备过程 单克隆抗体 B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 注射抗原 细胞融合、筛选 杂交瘤细胞 细胞培养 筛选，继续培养
足够数量的、能产生特定抗体的细胞群 体外培养 注射到小鼠腹腔 单克隆抗体

82

83 单克隆抗体制备过程 抗原 B-B细胞 B淋巴细胞 效应B细胞 人工 选择 刺激 瘤-瘤细胞 杂交瘤细胞 诱导 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞
克隆化培养 抗体检测 体外培养 单克隆抗体 杂交瘤细胞 小鼠腹腔内增殖

84 植物细胞和动物细胞培养的比较 细胞的全能性 细胞增殖 固体培养基 液体培养基 蔗糖、植物激素 葡萄糖、动物血清 植株 相同细胞
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养 原理 细胞的全能性 细胞增殖 培养基性质 固体培养基 液体培养基 蔗糖、植物激素 葡萄糖、动物血清 培养基特有成分 培养结果 植株 相同细胞 快速繁殖、培育无病毒植株等 获得细胞或细胞产物 培养目的

85 植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较 比较项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合 细胞融合原理 细胞膜的流动性、细胞的全能性 细胞膜的流动性
细胞融合的方法 去除细胞壁后诱导原生质体融合 使细胞分散后诱导细胞融合 诱导方法 物理（离心、振荡、电刺激） 化学（聚乙二醇） 物理、化学方法（同左） 灭活的病毒 用途 获得杂种植株 制备单克隆抗体

86 杂交育种 诱变育种 Ｐ DDTT高秆抗锈病 γ射线 ddTT矮秆抗锈病 或 Ｐ ddtt矮秆不抗锈病 P DDTT × ddtt
F DdTt高秆抗锈病 F2 ddTt、ddTT矮秆抗锈病 自 交 Fn ddTT矮秆抗锈病 ∶ 高秆抗锈 矮杆不抗锈 γ射线 Ｐ　DDTT高秆抗锈病 ddTT矮秆抗锈病 Ｐ　ddtt矮秆不抗锈病 或

87 多倍体育种 单倍体育种 花药（配子）离体培养 种子、幼苗 秋水仙素处理 单倍体植株 染色体加倍、不分离 秋水仙素 正常植株 多倍体
植物的组织培养 染色体加倍、不分离 秋水仙素处理 单倍体植株 秋水仙素 多倍体 正常植株

88 纯种矮秆抗病水稻 青霉素 纯种绿色圆粒豌豆 无子西瓜 杂交育种 诱变育种 单倍体育种 多倍体育种 原理 常用方法 优点 缺点 基因重组
基因突变 染色体变异（成倍减少） 染色体变异（成倍增加） 杂交→自交→选种→自交 用物理或化学方法处理生物 花药离体培养→单倍体→秋水仙素处理→纯种 秋水仙素处理种子或幼苗 使位于不同个体的优良性状集中于一个个体上 提高变异频率，加速育种进程 有利变异少，需大量处理供试材料 明显缩短育种年限，育种时间较短。 技术复杂 各种器官大、营养成分高、抗性强 只限于植物 育种时间最长 例子 纯种矮秆抗病水稻 青霉素 纯种绿色圆粒豌豆 无子西瓜