蛋白质化学 蛋白质的概念 蛋白质(Protein)是由许多不同的氨基酸，按照一定的顺序，通过肽键连接而成的一条或多条肽链构成的生物大分子。

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1 蛋白质化学 蛋白质的概念 蛋白质(Protein)是由许多不同的氨基酸，按照一定的顺序，通过肽键连接而成的一条或多条肽链构成的生物大分子。

2 二、蛋白质的生物学意义 免疫作用 结构骨架 运动作用 催化作用 调节作用 运输作用 蛋白质是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。
蛋白质是生命活动的物质基础，是生命活动的主要体现者。 免疫作用 运动作用 调节作用 结构骨架 催化作用 运输作用

3 三、蛋白质的化学组成 (一)蛋白质的元素组成 50~55% 6~8% 20~23% 15~18% 0~4% 基本元素： C H O N S
50~55% 6~8% 20~23% 15~18% 0~4% 其他元素（某些蛋白质） ： P Fe Cu Zn Mo I Se

4 蛋白质的含氮量 大多数蛋白质的含氮量接近于16% 蛋白质氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分
所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量. 蛋白质含量（克%）=每克生物样品中含氮的克数  6.25

5 (二）蛋白质的分子组成 蛋白质 > 104 d ↓ 胨 2×103d 多肽 103~5×102d 二肽 2×102d 氨基酸102d
月

6 (三)蛋白质的其他组分 蛋白质 简单蛋白质 结合蛋白质 氨基酸部分 非氨基酸部分 糖 脂 核酸 辅因子

7 三、蛋白质的基本单位--氨基酸 （一)氨基酸的结构特点 除甘氨酸和脯氨酸外，其他均具有如下结构通式。 手性-碳原子 不变部分 -氨基酸
可变部分 手性-碳原子

8

9 天然氨基酸除脯氨酸和甘氨酸外，其余均属于L-α-氨基酸。
除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性-碳原子，因此都具有旋光性和立体异构。 各种氨基酸的区别在于侧链R基团（Radical)不同。

10 苏氨酸 半胱氨酸

11 八种必需氨基酸： Thr,Lys,Val,Leu Ile, Met, Tyr，Phe
苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸 组氨酸 赖氨酸 精氨酸 天冬氨酸 谷氨酸 天冬酰胺 谷氨酰胺 八种必需氨基酸： Thr,Lys,Val,Leu Ile, Met, Tyr，Phe 苏赖缬亮异亮，甲硫酪苯丙。

12 (二）氨基酸的分类 1.常见的天然氨基酸： 极性氨基酸 ①按极性分 非极性氨基酸 酸性氨基酸 ②按酸碱性分 碱性氨基酸 中性氨基酸

13 带正电: His,Lys,Arg 极性氨基酸 带电荷 带负电荷:Asp,GLu. 氨基酸 不带荷: 非极性氨基酸
Gly,Ala,Val,Leu.Ile,Phe,Met,Pro,Trp 带电荷 Ser,Thr,Asn,Gln,Tyr,Cys 带正电: His,Lys,Arg 带负电荷:Asp,GLu. 不带荷: 极性氨基酸 氨基酸 非极性氨基酸

14 ③按营养状况分 必需氨基酸 非必需氨基酸 2.稀有氨基酸 是正常氨基酸的衍生物 在遗传上没有直接的三联密码. (3)非蛋白质氨基酸 不在蛋白质分子中出现的氨基酸 大多是α-氨基酸的衍生物 也有D-型和 ß-、γ-、δ-氨基酸.

15 （三）氨基酸的理化性质： 1.一般物理性质： 无色晶体，熔点极高，一般在2000 以上。 不同氨基酸有不同的味感。
能溶于稀酸或稀碱，不溶于有机溶剂。

16 2.两性解离及等电点： 氨基酸分子是一种两性电解质。 通过改变溶液的pH可使氨基酸分子的解离状态发生改变。

17 氨基酸的解离曲线 Pk2是AA的-NH3+ 被滴定一半时的pH （ NH3+释放H+） Pk1是AA的-coo- 被滴定一半时的pH
（coo-结合H+） 氨基酸的解离曲线

18 等电点的概念: 氨基酸分子上的-NH3+和-COO-解离度完全相同； 氨基酸所带的净电荷为零； 些时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。
等电点（pI）时溶解度最小。

19 等电点的推导

20 = [Ala+]= [Ala±][H+] 移项： [Ala-]= [Ala±] K2 [H+] 根据等电点的定义:

21 整理：K1 K2 [Ala±]= [Ala±] [H+] [H+]
K1 K2= [H+]2 两端取对数：-lg [H+]2 =-lg K1-lg K2 ∵-lg K1 = pk lg K2= pk2 ∴2 （-lg [H+]）= pk1+pk2 根据pH 的定义得：pH=lg 1/ [H+] =-lg [H+] ∴ 2 pH=pk1+pk2 pI=1/2( pk1+pk2 )

22 中性氨基酸：pI = (pK1 + pK2 )/2 酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 碱性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2 pK 1指α-羧基离解常数的负对数值； pK 2指α-氨基离解常数的负对数值 pK R指侧链R基离解常数的负对数值。

23 3.紫外吸收性质： 色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有光吸收。其吸收峰在280nm左右，以色氨酸吸收最强。
可采用紫外分分光度法测定蛋白质的含量。

24 氨基酸的紫外吸收光谱

25 4.氨基酸的化学反应 加热 （1）茚三酮反应 AA +水合茚三酮 蓝紫色化合物 （2）甲醛反应 AA+甲醛 二羟甲基氨基酸 （3）亚硝酸反应

26 AA + PITC PTC-AA PTH-AA + H2O
（4）Sanger反应 AA +DNFB DNP氨基酸（黄色） （5）Dansyl-cl反应 AA+DNS-Cl DNP氨基酸（荧光） （6）Edman反应 AA + PITC PTC-AA PTH-AA + H2O NaHCO3 pH8-9、室温 pH9.7 无水HF pH8.3

27 AA与茚三酮反应 用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。 水合茚三酮 茚三酮

28 用途：末端基氨基酸测定 AA与二硝基氟苯（DNFB）的反应

29 用途：末端基氨基酸测定 AA与丹磺酰氯的反应

30 四、肽(peptide) （一）肽的概念

31 肽:若干氨基酸通过肽键聚合而成的链状化合物。
肽键:肽分子中，一个氨基酸分子的α-羧基与另一个氨基酸分子的α-氨基经脱水形成的酰胺键（-CO-NH）。 二肽.三肽:根据成肽的氨基酸数目命名. 寡肽：10肽以下称之。 多肽： 10肽以上称之。 氨基酸残基：氨基酸成肽后已不完整，故称之。 肽单位：与肽键相连的六个原子（C1,C,O,N,H,C  2)组成的肽平面。

32 氨基酸残基与肽单位

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34 （二）肽结构的表示 氨基酸的顺序：指从“N”端→“C”端氨基酸的排列顺序。 肽的表示法:按氨基酸的顺序依次读为某氨酰某氨酰……某氨酸。
如：谷氨酰半胱氨酰甘氨酸. 简称：谷胱甘肽 简式：Glu·Cys·Gly

35 （三）生物活性肽： 生物体内具有特殊的生物学活性的肽类物质。 重要的有谷胱甘肽、神经肽、肽类激素等。

36 1. 谷胱甘肽（GSH）： 全称为γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸。 还原型（GSH） 氧化型（GSSG） 谷胱甘肽的生理功用： 参与氧化还原反应
解毒作用 保护巯基酶的活性

37 谷胱甘肽（GSH） γ-

38 2. 多肽类激素： 种类较多，生理功能各异。主要见于下丘脑及垂体分泌的激素。

39 3、神经肽 ·脑啡肽 ·Leo脑啡肽 ·有镇痛麻醉作用。 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-
+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- ·有镇痛麻醉作用。

40 五、 蛋白质的结构 一级结构----基本结构 空间结构 二级结构 三级结构 四级结构 蛋白质的结构

41 （一）蛋白质的一级结构 1、蛋白质的一级结构的概念 一级结构指多肽链的氨基酸组成、线性顺序、多肽链数目和关联。
多肽链的氨基酸顺序，是蛋白质生物功能的基础。 稳定一级结构的力：肽键、二硫键。

42 胰岛素（Insulin）：

43 2、蛋白质一级结构的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。

44 3.一级结构测定的意义： 一级结构是研究高级结构的基础。 可以从分子水平阐明蛋白质的结构与功能的关系。 可以为生物进化理论提供依据。
可以为人工合成蛋白质提供参考顺序。

45 HbA Val.His.Leu.Thr.Pro.Glu.Glu.Lys
蛋白质一级结构的变异与分子病 在镰刀状红细胞贫血患者中，由于基因突变导致血红蛋白β-链第六位氨基酸残基由谷氨酸改变为缬氨酸，血红蛋白的亲水性明显下降，从而发生聚集，使红细胞变为镰刀状。 氨基酸顺序 HbA Val.His.Leu.Thr.Pro.Glu.Glu.Lys HbS Val.His.Leu.Thr.Pro.Val.Glu.Lys

46 细胞色素c的一级结构与生物进化的关系

47 3一级结构测定的程序 1.样品纯化（纯度>97%以上）； 2.测定蛋白质的分子量； 3.末端分析 N端分析：PITC法 DNFB法
Edman法 DNS-CL法 C端分析：肼解法, 羧肽酶法 4.拆分多肽链: 可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理 5.用两种以上方法特异性裂解： 肽链内切酶（胰蛋白酶） 化学试剂（溴化氰） 6.分离纯化肽段：双向电泳 7.测定氨基酸组成 ： 氨 基酸自动分析仪(峰图） 8. 跨切口重迭肽段，分析氨基酸顺序

48 PITC法测定N-端氨基酸残基

49 DNFB法分析N-端氨基酸残基

50 Edman降解法测定氨基酸序列 异硫氰酸苯酯

51 用途：末端基氨基酸测定 AA与丹磺酰氯的反应

52 肼解法分析C-端氨基酸残基 NH2-NH2 NH-NH2

53 羧肽酶法分析C-端氨基酸残基 羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。
羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基； 羧肽酶B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。

54 蛋白质的特异裂解

55 胰蛋白酶（trypsin)的裂解作用

56 BrCN的裂解作用

57 氨基酸自动测序仪

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59 确定肽段在多肽链中的次序

60 （二）蛋白质的空间结构 蛋白质空间结构（构象）：指蛋白质分子中原子和基团在空间的排列分布和肽链的走向。

61 1.概述 ⑴何谓构象： conformation
构象是指一个由几个碳原子组成的分子，由于单键的旋转造成的不同碳原子上各原子或取代基团的空间排布。 构象的改变不需要共价键的断裂和重组，只需要单键旋转方向和角度改变即可。 conformation configuration

62 乙烷的构象

63 ⑵ 决定蛋白质空间构象的因素 ① 蛋白质的氨基酸序列 ②肽键的刚性平面性质
由于C=O双键中的π电子云与N原子上的未共用电子对发生“电子共振”，使肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转。 与肽键相连的六个原子构成刚性平面结构，称为肽单元或肽键平面。 但由于α-碳原子与其他原子之间均形成单键，因此两相邻的肽键平面可以α-碳原子作相对旋转，旋转的相对角度称Cα原子的两面角和 ，可描述多肽的所有可能构象。

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66 ③R基团的性质和排布： 空间位阻 基团相互作用 氢键 离子键 疏水键 范德华力 共价键（二硫键、酯键）

67 稳定蛋白质构象的力

68 2.蛋白质二级结构 蛋白质的二级结构：指一级结构进一步盘绕折叠，其主链形成的局部构象。
二级结构的类型：主要有-螺旋、-折叠、-转角、 无规卷曲。 维持二级结构的力：主要是氢键。

69 （1） α-螺旋的特征 主链围绕中心轴呈有规律螺旋式上升，形成右手螺旋； 旋转一周为3.6个氨基酸残基；螺距为0.54nm；
R基分布在螺旋的外侧，并且影响着螺旋的形成。 主链围绕中心轴呈有规律螺旋式上升，形成右手螺旋； 旋转一周为3.6个氨基酸残基；螺距为0.54nm； 其结构靠第一个肽平面上的-NH基与第四个肽平面上的-CO基形成的氢键维持，氢键的取向几乎与轴平行； （1） α-螺旋的特征

70 左手/右手α- 螺旋

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72 角蛋白分子中的二硫键

73 ⑵影响α-螺旋稳定的因素 极大的侧链基团（存在空间位阻）； 连续存在的侧链带有相同电荷的氨基酸残基（同种电荷的互斥效应)
有脯氨酸、羟脯氨酸的存在（不能形成氢键）。

74 （2）β-折迭的特征 由若干条肽段或肽链平行或反平行排列组成片状结构； 主链骨架上下折叠呈锯齿状； 借相邻主链之间的氢键维系。 R基交替分布在片层的上下方。

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76 β-折迭包括平行式和反平行式两种类型

77 丝蛋白的结构 丝蛋白是由伸展的肽链沿纤维轴平行排列成反向-折叠结构。分子中不含-螺旋。丝蛋白的肽链通常是由多个六肽单元重复而成。这六肽的氨基酸顺序为：   -（Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala）n-

78 （3） β-转角的特征 主链骨架本身以大约180°回折; 回折部分通常由四个氨基酸残基构成; 构象依靠第一残基的-CO基与第四残基的-NH基之间形成氢键来维系。

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80 （4） 无规卷曲的特征 coil 无规卷曲是指多肽链主链部分形成的无规律的卷曲构象。

81 RNase的分子结构 β-转角 β-折迭 α-螺旋 无规卷曲

82 超二级结构(模序）motif 在蛋白质分子中，若干具有二级结构的肽段在空间上相互接近. 形成有规则的，空间上能够辩认的二级结构组合体。
模序是蛋白质发挥特定功能的基础。如βαβ,βββ,ββ, αα等。

83 βββ βαβ ββ αα

84 锌指结构：螺旋-折迭-折迭模序

85 转录因子MyoD的螺旋-环-螺旋模序

86 结构域domain 多肽链在超二级结构基础上进一步盘曲折叠为紧密的近似球状的结构。 在空间上彼此分隔，各自具有部分生物学功能的结构。
结构域 与分子整体以共价键相连，这是它与亚基的区别。

87 图示：假设具有2个结构域的蛋白质的线性折叠途径

88 4、蛋白质的三级结构 蛋白质的三级结构：是指蛋白质分子在二级结构基础上进一步盘曲折叠而形成的整体构象，也就是一条多肽链全部原子在三维空间的排布位置。

89 维系三级结构的力：主要是非共价键（次级键），如疏水键、氢键、盐键、范氏引力等，但也有共价键，如二硫键等。

90 疏水作用是维持蛋白质结构最主要的稳定力。疏水基团因疏水作用而聚向分子内部，亲水基团多分布在分子表面。因此，具有三级结构的蛋白质都是亲水的。

91 肌红蛋白的三级结构

92 溶菌酶分子的三级结构

93 胰岛素分子的三级结构

94 4.蛋白质的四级结构 蛋白质的四级结构： 由两条或两条以上具有三级结构的多肽链相互缔结在一起的聚合体。
其中每条具有三级结构的多肽链为一个亚基sub-unit。 维系蛋白质四级结构的力是次级键。 由多个亚基聚集而成的蛋白质称为寡聚蛋白。

95 血红蛋白(hemoglobin)的四级结构

96 血红蛋白的四级结构

97 亚基的立体排布

98 六、蛋白质分子结构与功能的关系 （一）蛋白质一级结构与功能的关系 1、一级结构与生物进化 2、一级结构与分子病
（二）蛋白质高级结构与功能的关系 1、蛋白质变构与功能的关系 2、蛋白质变性与功能的关系

99 当血红蛋白的一个α亚基与氧分子结合→其他亚基的构象发生改变→对氧的亲和力增加→整个分子的氧结合力迅速增高→血红蛋白的氧饱和曲线呈“S”形。这种由于蛋白质分子构象改变而导致蛋白质分子功能发生改变的现象称为变构效应。 血红蛋白

100 七 蛋白质的性质 (一) 胶体性质 分子量很大 很大的吸附力 不能透过半透膜 其水溶液是亲水胶体

101 蛋白质分子量的测定： 超离心沉降法 凝胶电泳法 凝胶过滤法 渗透压法

102 超离心沉降法： 把蛋白质溶液放在25-50万倍重力场的离心作用下，使蛋白质颗粒从溶液中沉降下来。
应用光学方法观察蛋白质的沉降行为，从而判断出蛋白质的沉降速率，计算出蛋白质的分子 量。 一般把单位（厘米）离心场中的沉降速率，称为沉降系数，用S表示。一个S单位等于1×10-13秒。 蛋白质的分子量可以直接用S表示。

103 （二）蛋白质的两性解离与等电点 由于蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游离的氨基和游离的羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两性解离的性质，因而也具有特定的等电点。

104 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。

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106 （三）蛋白质的变性与复性 1、蛋白质的变性：在某些物理或化学因素的作用下，蛋白质严格的空间结构被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变，称为蛋白质的变性(denaturation)。

107 （1）变性蛋白质的特征： 物理性质： 旋光性改变 溶解度下降 沉降率升高 光吸收度增加

108 化学性质： 官能团反应性增加 易被蛋白酶水解 生物学性质： 原有生物学活性丧失 抗原性改变

109 （2）引起蛋白质变性的因素 物理因素： 高温、高压、紫外线、 电离辐射、超声波等. 化学因素： 强酸、强碱、有机溶剂、
重金属盐、去污剂、尿素

110 2.蛋白质变性的复性 复性的概念：变性蛋白在一定的条件下，恢复其原有的的空间结构与生物活性的过程称之。 影 响复性的因素： 变性的原因
蛋白质的种类 变性的程度

111 沉淀：蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀。
凝固：加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。 变性的蛋白质不一定沉淀， 沉淀的蛋白质不一定变性。

112 核糖核酸酶的变性与复性

113 八 蛋白质的分类 （一）按分子形状分 球状蛋白质: 纤维状蛋白质: α- 角蛋白 毛发、指甲等 β-角蛋白 蚕丝、蜘蛛丝等
八 蛋白质的分类 （一）按分子形状分 球状蛋白质: 纤维状蛋白质: α- 角蛋白 毛发、指甲等 β-角蛋白 蚕丝、蜘蛛丝等 胶原蛋白 皮肤、软骨等

114 （二）按化学组成和溶解度分 简单蛋白质 结合蛋白质 (三)按生物功能分 结构蛋白 收缩蛋白 运输蛋白 贮藏蛋白 免疫蛋白 调节蛋白 酶

115 九 蛋白质的分离纯化 （一）分离纯化的一般程序 破碎 溶解 离心 精制品(结晶/冻干粉) 前处理 生物组织 粗分级 无细胞提取液
九 蛋白质的分离纯化 （一）分离纯化的一般程序 前处理 生物组织 破碎 溶解 离心 粗分级 无细胞提取液 细分级 浓缩的蛋白质溶液 层析 电泳 精制品(结晶/冻干粉) 盐析 等电点沉淀 超滤 有机溶剂分级

116 （二）分离纯化的方法和原理 1.根据分子大小进行分离 透析和超滤 离心沉降 凝胶过滤（凝胶层析）

117 2.根据溶解度差异分离 等电点沉淀 盐析 低温有机溶剂沉淀 3.根据电离性质不同分离 电泳 离子交换层析 4.根据分子与配基的亲和性质分离 亲和层析

118 ㈢蛋白质分离纯化方法简介 1、盐析与有机溶剂沉淀： ①盐析：
概念：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。 常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。

119 盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。
盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。 分段盐析：半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。

120 ②有机溶剂沉淀蛋白质 凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。
沉淀原理是：A、脱水作用；B、使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。

121 蛋白质的透析

122 2、电泳 带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。 蛋白质分子在溶液中可带净的负电荷或带净的正电荷，故可在电场中发生移动。
不同的蛋白质分子所带电荷量不同，且分子大小也不同，故在电场中的移动速度也不同，据此可互相分离. 主要方法有聚丙烯酰胺电泳，等电聚焦，毛细管电泳等。

123 垂直板电泳

124 3、层析 层析：是一种利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离的方法。
主要的层析技术有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及亲和层析等。

125 凝胶过滤分离蛋白质

126 图1 通过DEAE-纤维素将两种不同带电性的蛋白质分离开。
图中显示的是带正电的离子交换树脂结合带负电的蛋白。 离子交换层析

127 亲和层析 (a)琼脂糖珠的表面吸附剂(如胰岛素配体)只能同特异的受体结合(胰岛素); (b)亲和层析的基本步骤

128 4、超速离心 超速离心：利用物质分子量、密度、形状的不同，经超速离心后分布于不同的液层而分离。
超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。