环境微生物学实验 常州大学 赵远 孙向武.

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1 环境微生物学实验 常州大学 赵远 孙向武

2 实验概况 环境微生物学的实验教材包括（1）基础微生物学技术，（2）现代微生物学技术，共10个实验。
包括微生物实验技术基础、在环境科学及环境工程中应用、现代微生物学实验技术等有关内容。 对每个实验的内容，力求较详细的介绍每种方法的技术特点和基本操作要求，反映现代环境微生物学最新的实验技术，同时兼具实用性和可操作性。 目的：是使学生得到微生物学基础实验技术、基本操作和技能训练，同时也初步掌握现代微生物技术的操作方法。本实验指导书主要用于环境与安全工程学院环境工程、给水排水专业和环境科学专业的本科生的微生物学基础实验教材。

3 实验守则 一、学生在实验室应保持安静，不得高声喧哗、打闹，不准随地吐痰、抽烟、乱丢纸屑和杂物，不准将食物带入实验室。进入实验室应穿实验服，服从指导老师和实验员的安排。 二、学生必须按时到达实验室，迟到10分钟不得进入实验室，并按旷课处理。实验进行中不得脱离岗位，必须离开时，需经实验老师同意。 三、实验前要认真做好预习，明确实验目的、内容、方法和步骤，阅读有关仪器和设备说明书。学生应在指定的实验岗位进行实验，不准擅自变换实验岗位。 四、应按操作规程使用实验仪器和设备，不懂即问，不可盲目、野蛮操作。 五、在实验过程中要虚心听取指导老师和实验员的指导，严格遵守操作规程，仔细观察实验现象，按规定格式做好原始记录，经老师审阅同意后，方可结束实验，做到实验数据可靠、真实。 六、爱护仪器设备，除指定使用的仪器外，未经指导老师许可，不得自行拆卸、插拔仪器，不得随意动用与本次实验无关的设备及用品，不得将非本人物品带出实验室，实验用品不准挪作他用，违者教师有权令其终止实验并离开实验室。 七、对实验室公物、门窗、水电、用具、仪器和设备，要妥善保管和爱护，凡损坏仪器设备者应及时向指导老师或实验员报告。如果因违反实验室规章制度而造成设备的损坏、丢失、实验室软环境的破坏等事故，实验室有权责令当事人写出书面检查，并按相关规定进行处理。 八、要节约水、电和药品。对有毒有害物品必须在教师指导下进行处理，不准乱扔、乱放。 九、学生实验完毕后，应按规定程序关闭仪器、设备、电源和水源，并做到清洗器皿、清理桌子和清扫地面。 十、若实验室发生诸如火灾等重大事故时，应及时切断电源，并在指导老师的指挥下按次序撤离。

4 实验注意事项 环境微生物学实验是一门操作技能较强的课程。通过本课程学习，要求学生能牢固地建立无菌概念，掌握环境微生物实验的一套基本操作技术；树立严谨、求实的科学态度，提高观察、分析问题和解决问题的能力；树立勤俭节约、爱护公物、相互协作的优良作风。 为了提高教学效果，保证实验的质量和实验室的安全，实验注意事项如下： 1 每次实验前必须充分预习实验教材，以了解实验的目的、原理和方法。初步熟悉实验操作中的主要步骤和环节、对整个实验的安排做到先后有序、有条不紊和避免差错。 2．非必要的物品不要带进实验室，必须带进的物品（包括帽子、围巾等）应放在不影响实验操作的地方。 3．每次实验前须用湿布擦净台面，必要时可用70%酒精或“新洁尔灭”溶液（01％浓度）。实验前要洗手，以减少染菌的几率。 4．微生物实验中最重要的一环，就是要严格地进行无菌操作，防止杂菌感染。为此，在实验过程中，每个人要严格做到以下几点： ■ 在进行接种操作时，要关闭门窗，以防止空气对流。 ■ 接种时尽量不要走动和说话，以免因尘埃飞扬和唾沫四溅，而导致杂菌污染。 ■ 用过的带菌移液管、滴管或涂布棒等，在实验后应立即投入5％石炭酸或其他消毒液中浸泡20min，然后再取出清洗，以免污染环境。 ■ 在清洗带菌的培养皿、三角烧瓶或试管等之前，应先煮沸半小时或进行蒸汽灭菌。 5．凡需进行培养的材料，都应注明菌名、接种日期及操作者姓名(或组别)，放在指定的温箱中进行培养，按时观察并如实地记录实验结果和按时交实验报告。 6．实验室内严禁吸烟，不准吃东西，以免感染。 7．节约药品和水、电、煤气。 8．各种仪器应按要求操作，用毕按原样放置。 9．实验完毕、立即关闭煤气，整理和擦净台面，离开实验室之前要用肥皂或清洁剂洗手，值日生负责打扫实验室及进行安全检查（门窗、水、电、煤气等）。 10．意外事故的处理： ◆ 如因玻璃器皿打碎而使菌液洒到桌面或地上时、应立即以5％石炭酸液或0.1%新洁尔灭溶液投盖其上，半小时后再擦去。 ◆ 如菌液污染手部时，应先用70％乙醇棉花拭去、再用肥皂水洗刷干净；如污染致病菌时、应将手浸于2％—4％来苏尔或0．1％新洁尔灭溶液中，10min—20min后用自来水刷洗干净。 ◆ 如不慎将菌液及入口中，应立即吐出．并用大量自来水漱口。

5 实验一 光学显微镜的使用及微生物形态观察、大小测定和计数
实验二 培养基的配置和灭菌 实验三 纯种微生物的分离、培养及接种技术

6 实验目的 实验一 光学显微镜的使用及微生物形态观察、大小测定和计数 1、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养
实验一 光学显微镜的使用及微生物形态观察、大小测定和计数 实验目的 1、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片，学会绘制生物图 3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法 4、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法

7 显微镜的构造 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜，由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器：光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。

8 显微镜的使用 1、低倍镜观察 2、高倍镜观察 3、油镜观察
将标本波片用标本夹夹住，移动到物镜的正下方。下降10×物镜，使其接近标本，用粗调节器慢慢升起镜简，使标本在视野中初步聚焦，再使用微调调节图像清晰。移动标本，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。 2、高倍镜观察 在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器使物象清晰，移动标本，仔细观察并记录所观察到的结果。 3、油镜观察 在标本的盖玻片上滴少量香柏油，将物镜转换到油镜，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心降下，使镜头侵入香柏油中。开足光圈，旋转细调节器至标本显出，清晰为止。

9 微生物大小的测量 标定目镜测微尺 装在目镜上的目测微尺中央刻有等分为100格或更多格的标尺，使用前要用物测微尺标定。物测微尺中央刻有1mm长的标尺，等分为100格，10μm／格。将物测微尺的刻度朝上放在载物台上，用低倍镜找出物测微尺的刻度，移动物测微尺使其第一条线与目测微尺的第一条线重合，顺着刻度线找出另一条重合线。算出低倍镜下目测微尺每格的长度。换高倍镜用同样方法标定出高倍镜下目测微尺每格的长度。

10 微生物大小的测量 微生物大小的测量 将物测微尺取下，换上标本片，选择适当物镜测量微生物的长度和宽度占目测微尺的格数，再按目测微尺1格的长度算出微生物的长度和宽度。 10 ╳ 10 颤藻

11 酵母菌 硝化细菌 大肠杆菌

12 作业 记录实验结果完成下列任务并提交一份实验报告。 1、绘制所观察的一种或两种微生物的形态，并测量其大小。
2、将菌液浓度的实验结果填入下表： 计数次数 每个中方格菌数 稀释倍数 原菌液浓度（个/ml） 平均值（个/ml） 第一次 第二次

13 实验二 培养基的配置和灭菌 实验目的 1、明确培养基配置的原理 2、掌握配制培养基的一般方法和步骤 3、掌握灭菌锅的使用方法

14 实验基本原理 本次需要配制的培养基是为下次从土壤或活性污泥中分离细菌用的，所以选择配制适合细菌生长的牛肉膏蛋白胨培养基。这是一种应用最广泛最普遍的细菌基本培养基，牛肉膏提供碳原和能源，蛋白胨主要提供氮源，NaCI提供无机盐，用HCI和NaOH调节pH，还要加入一定量的琼脂最为凝固剂。琼脂在大于96℃时融化，小于40℃时凝固，通常不被微生物利用。 培养基配方如下：（调节 pH 7.2 ~ 7.4） 牛肉膏 蛋白胨 NaCI 琼脂 水 5 g 10 g 25 g 1000ml

15 实验内容和步骤 1.配制溶液：取一定容最的烧杯或搪瓷杯盛入适量蒸馏水，按培养基配方逐一称取各种成分，依次加入水中溶解。牛肉膏、蛋白胨可加热促进溶解，待全部溶解后，加水补足所需容量。 2.调节pH：用精密pH试纸测量培养基原始pH值。若偏酸，逐滴加入1mol\L的NaOH 溶液，边加边搅拌，随时测pH值，直至达约7.4。若偏碱，同法用1mol\L的HCI溶液调节。 3.分装：将配制好的培养基装入三角瓶和试管中，三角瓶装量不要超过容积的1/2，试管装量不要超过试管高度的1/3，约为5ml。5、加塞：分装完毕后，在试管口和三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入并保证良好的通气性能。 4. 加塞：分装完毕后，在试管口和三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入并保证良好的通气性能。

16 实验内容和步骤 5. 包扎：加塞后，三角瓶外包一层牛皮纸或两层旧报纸，用麻绳以活结形式扎好：试管先用橡皮筋全部捆好，再在棉塞外包牛皮纸或旧报纸，防止灭菌时冷凝水润湿棉塞。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。 6. 灭菌：将包扎好的培养基放进高压蒸汽灭菌锅内，0.103MPa，121℃，20min，高压蒸汽灭菌。 7. 搁置斜面：将灭菌的试管培荞基冷却至50℃左右，将试管口端搁在玻璃棒或其它合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。 8. 无菌检套：将灭菌的培养基放入37℃的培养箱中培养24~48h，检查灭菌是否彻底。

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18 作业 实验结束完成下列思考题，并提交实验报告。 1、配制培养基的过程中应该注意些什么问题？为什么？
2、培养基配制好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的?

19 实验目的 实验三 纯种微生物的分离、培养及接种技术 l、掌握梯度稀释平板法分离纯种微生物的原理、方法 2、掌握常规接种技术
实验三 纯种微生物的分离、培养及接种技术 实验目的 l、掌握梯度稀释平板法分离纯种微生物的原理、方法 2、掌握常规接种技术 3、建立无菌操作意识

20 实验基本原理 土样或活性污泥中含有的微生物数量很多，而且聚集在一起，经过无菌水的梯度稀释可以将微生物充分分散，成单个细胞，涂布到固体平板上，长成单菌落，一个单菌落对应于原土样（或活性污泥）中的一个微生物，乘以相应的稀释倍数可以计算出土样的微生物浓度；将单菌落进一步划线纯化可分离到纯种微生物。

21 （一）梯度稀释平板法 1、 制备土壤（或活性污泥）稀释液
准确称取土样10g或活性污泥10ml，加入装有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡约20min，使土样与水充分混匀，将细胞分散。用一支无菌吸管从中吸取1ml土壤或活性污泥悬液加入装有9ml无菌水的试管中，吹吸（深吸浅吹）3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液：再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml．移入装有9ml无菌水的诚管中，也吹吸三次，即成10-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、等一系列稀释菌液。

22 （一）梯度稀释平板法 3、倒平板 4、培养 2、加菌
将无菌平板编上10-4、10-5、10-6号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1ml放入编号10-6的3个平板中，同法吸取10-5稀释液各1ml放入编号10-5的3个平板中，再吸取10-4稀释液各1rnl放入编号10-4的3个平板中（图3-1）（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。 3、倒平板 上述操作的同时，将培养基加热融化，再冷却到40~50℃，倾注10~15ml培养基入已含有菌液的培养皿内（约2~3mm厚）。迅速盖上皿盖，平放在工作台上，轻轻转动，是培养基和稀释的菌液充分混合均匀，冷却后，即制成平板。 4、培养 将培养皿倒置，放于30℃恒温培养箱中培养24~36h，观察结果。

23 （二）平板划线 平板划线的主要目的是长出单菌落，得到纯培养。将融化的培养基无菌操作倒入无菌的空培养皿中。接种环在火焰上彻底杀菌并冷却后，蘸取少量菌种，在平板表面轻轻地划线（如图），使得初始聚集在一起的细胞渐渐稀释，最后有单个分散的细胞，长出单菌落，达到分离纯化的目的。将划好线的培养皿倒置于30℃恒温培养箱中培养24~36h，观察结果。

24 （三）斜面接种 1、在待接种的斜面培养基的试管上部，贴上标签，写上菌名、接种日期等。
2、将一支斜面菌种和一支待接的斜面培养基放在左手上，拇指压住两只试管，中指位于两只试管之间，斜面向上，管口齐平。 3、右手先将棉塞拧松动，以便接种时拔出。右手拿接种环，将接种环可能进入试管的部分在火焰上灼烧灭菌。 4、在火焰旁，用右手小指、无名指和手掌央住棉塞将它拔出。试管口在火焰上微烧一周，将管口上可能沾染的少量茵烧掉。将烧过的接种环伸入菌种管内，先触及没长菌的培养基使环冷却，然后轻轻挑取少许菌种，将接种环抽出管外迅速伸入另一试管底部，在斜面上由底部向上划曲线。抽出接种环，将试管塞上棉塞，最后再次灼烧接种环，则接种完毕。

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26 作业 实验结束完成下列思考题，并提交实验报告。 1、梯度平扳稀释法分离纯种微生物的方法和原理是什么？ 2、平板培养皿为什么要倒置培养？
3、观察实验结果，并对结果进行分析。